专利名称：错配修复基因mlh1突变检测试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种错配修复基因MLHl突变体检测试剂盒及其应用，特别涉及其在 东亚胃癌高发人群的基因诊断及其突变后果评估。
背景技术：
胃癌(gastric cancer, GC)在我国是位居第三的恶性肿瘤，年死亡率高达25/10 万。其中可疑的遗传性病例大于20%，提示遗传因素在胃癌的发病中具有重要作用，但突 变的检出率并不高。已经知道，MLHl基因编码在DNA复制过程的错配修复中起核心作用的 蛋白。MLHl基因含有19个外显子，编码754个氨基酸。MLHl蛋白保守的氨基端被认为与 ATP键合有关，而羧基端区域被认为是与PMS2蛋白相互作用区。MLHl基因突变影响DNA复 制过程中的错配修复，从而导致肿瘤形成。MLHl基因突变类型与频率在东西方人群中存在 较大差异。但是，由于缺乏针对东亚人群的有效的突变检测方法，在中国关于该基因突变的 系统筛查与病例对照分析还未见报道。对于检出的错义突变或同义突变的功能后果也缺乏 有效的评估手段。尤其从RNA剪切角度对于MLHl基因突变后果的评估还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种错配修复基因MLHl突变体检测试剂盒及其应用。本检测试剂盒主要包括以下成分(I)MLHl基因启动子区及第1到第19外显子区PCR扩增与测序引物20对，各对引 物序列见表1 ；(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、Taq DNA聚合酶等。表IMLHl基因第1-19外显子以及启动子区的PCR扩增与测序引物序列
区域引物序列
启云力子 F: 5'-gaacactgaggtgattggc-3，(SEQ ID NO. 1) R: 5'-cattttggcagaagagccaag-3，(SEQ ID N0.2)外显子 1 F: 5'-aggcactgaggtgattggc-3，(SEQIDN0.3)
R: 5'-tcgtagcccttaagtgagc-3，(SEQ ID N0.4) 外显子 2 F: 5'-aatatgtacattagagtagttg-3‘ (SEQ ID N0.5) R: 5'-cagagaaaggtcctgactc-3，(SEQ ID N0.6)
权利要求
一种MLH1基因突变检测试剂盒，其特征在于包括以下成分(1)MLH1基因PCR扩增与测序引物20对,(2)PCR扩增用试剂；所说的20对引物序列如下第1对F: 5' gaacactgaggtgattggc 3’, R: 5' cattttggcagaagagccaag 3’第2对F: 5' aggcactgaggtgattggc 3’,R: 5' tcgtagcccttaagtgagc 3’第3对F: 5' aatatgtacattagagtagttg 3’, R: 5' cagagaaaggtcctgactc 3’第4对F: 5' agagatttggaaaatgagtaac 3’, R: 5' acaatgtcatcacaggagg 3’第5对F: 5' aacctttccctttggtgagg 3’, R: 5' gattactctgagacctaggc 3’第6对F: 5' gattttctcttttccccttggg 3’, R: 5' caaacaaagcttcaacaatttac 3’第7对F:5' gggttttattttcaagtacttc 3’, R: 5' gctcagcaactgttcaatgtatg 3’第8对F: 5' ctagtgtgtgtttttggc 3’, R: 5' cataaccttatctccacc 3’第9对F: 5' ctcagccatgagacaataaatcc 3’,R: 5' ggttccaaaataatgtgatgg 3’第10对F: 5' caaaagcttcagaatctc 3’, R: 5' gtgggtgtttcctgtgagtg 3’第11对F:5' catgactttgtgtgaatgtac 3’,R: 5' gaggagagcctgatagaacat 3’第12对F: 5' gggctttttctccccctccc 3’, R: 5' aaatctgggctctcacg 3’第13对F: 5' cctcgtcttctacttctgg 3’, R:5' ctgggagttcaagcatctcctcatct 3’第14对F: 5' tgcaacccacaaaatttggc 3’, R: 5' ctttctccatttccaaaacc 3’第15对F: 5' tggtgtctctagttctgg 3’, R: 5' cattgttgtagtagctctgc 3’第16对F: 5' cccattttgtcccaactgg 3’, R: 5' cgatcagttgaaatttcag 3’第17对F: 5' catttggatgctccgttaaag 3’, R: 5' cacccggctggaaattttatttg 3’第18对F: 5' ggaaagcactggagaaat 3’R: 5' ccctccagcacacatgcatgta 3’第19对F: 5' taagtagtctgtgatctccg 3’, R: 5' ctagtcctggggtgccagtgtg 3’第20对F: 5' gacaccagtgtatgttgg 3’, R: 5' agagaaagaagaacacatccc 3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括7种限制性内切酶PvuII、 Xba I、Dde I、Mbo I、Tfi I, Dde I, Mwo I 禾口 Cac8I。
3.根权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还有琼脂糖凝胶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括LCGreen Plus+荧光染料。
5.权利要求1所说的试剂盒用于检测错配修复基因突变体。
全文摘要
本发明涉及一种MLH1基因突变检测试剂盒及其用途。试剂盒的主要成分包括(1)MLH1基因PCR扩增与测序引物20对；(2)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可通过高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变，或者是进行限制性片段长度多态性分析。本试剂盒具有高效的MLH1基因突变检出与功能评估作用，用于错配修复基因MLH1突变检测。
文档编号C12Q1/68GK101974642SQ20101055068
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者张婉芬, 支文贤, 王亚平, 范怡梅, 薛冰霜, 郭文文, 陈锦云 申请人:南京大学