专利名称：一种刺参拮抗菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋微生物和生物防治技术领域，具体涉及一种刺参拮抗菌及其应用，即一株具有拮抗刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病活性的细菌及其应用。
背景技术：
近年来，刺参消费需求迅速扩大，传统的捕捞业已不能满足人们的需求，刺参人工养殖已成为我国北方沿海地区重要的经济养殖品种，其养殖面积已达百万亩，年产值超过 100亿元。然而，养殖的过速发展和不规范操作、养殖技术水平的参差不齐等导致了病害问题的日趋突出。自2003年冬季起，山东和辽宁沿海的养殖刺参先后出现了烂皮、肿嘴的大面积流行病、引发了 30%以上的大量死亡，造成了惨重的经济损失，严重制约了该产业的持续发展。随着刺参疾病的频繁发生，国内外研究者开始关注刺参养殖过程中导致皮肤溃烂、 肿嘴流行病的病原问题。研究表明假交替单胞菌O^eudoalteromonas sp)和河豚毒素假交替单胞菌(P tetraodonis)可引起刺参皮肤溃烂、围口部肿胀等流行性病害的发生。目前，控制刺参皮肤溃烂、围口部肿胀等流行性疾病的方法一般是使用化学药物，虽然有一定效果，但是并不能从根本上控制该病，而且生物体极易产生耐药性，造成体内、环境的药物残留，破坏生态平衡，威胁人体的健康和安全，并造成环境污染。近年来我国水产品因违禁抗生素超量，不断遭受美国、欧盟和日本等国家的进口限制，不仅造成了巨大的经济损失， 而且国际形象严重受损。因此，采取既能保障水产养殖业健康发展又能消除海水养殖产品抗生素污染、增加水产品质量的措施已成为目前海水养殖业生产中迫切需要解决的重要科学问题。生物防治是近年来被证明很有成就的新途径，它主要利用为生物之间的拮抗作用，选择对养殖生物不造成危害的微生物来抑制海水养殖生物病原菌的生长。使用拮抗菌防治刺参皮肤溃烂、围口部肿胀等流行性疾病，可以减少化学农药的用量和在水产品上的残留，对保护人类健康和防治环境污染都十分重要。同时，可有利于我国水产品的出口创汇，经济效益和社会效益十分显著。
发明内容
本发明的目的是提供了一种刺参拮抗菌及其应用，可有效防治刺参皮肤溃烂、围口部肿胀病，为刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病的预防和治疗提供了产品和使用方法。本发明所提供的生物拮抗菌，是奥氏弧菌(Vibrio ordalii)，该菌株已于2011年 3月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4668。本发明的奥氏弧菌4668的活菌用于制备菌液制剂，所制得的菌液制剂可以预防刺参皮肤溃烂、围口部肿胀病的发生。菌液制剂中奥氏弧菌4668活菌的数量为IO7 101(lCFU/ml。本发明筛选到的奥氏弧菌4668用于提取胞外产物，预防刺参皮肤溃烂、围口部肿胀病的发生。本发明筛选的具有拮抗刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病活性的细菌，拮抗活性强， 利用盐析法制备的拮抗菌胞外产物的产量稳定，成本低，可具有较高的拮抗活性。使用该拮抗菌或拮抗产物对刺参的免疫保护率达70-80%，该拮抗菌产物为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并可从根本上遏制刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病的发生和流行。
具体实施例方式下面对本发明进行详细的描述。上述拮抗菌的筛选方法如下首先分离养殖刺参池水中菌，然后以刺参皮肤溃烂、围口部肿胀病原菌假交替单胞菌(I^eudoalteromonas sp)作为指示菌，筛选其拮抗菌。提取拮抗菌的胞外产物，用于刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病的预防。具体技术方案如下(1)养殖刺参池水、底泥、以及养殖大菱鲆池水细菌分离取养殖海参池水、底泥和大菱鲆池水，用无菌海水稀释不同的倍数、划线接种于2216E平板上，27°C培养48小时。 挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直到获得60株纯培养的优势菌株，转入斜面培养基中4°C保存。(2)拮抗菌的筛选将指示菌-刺参皮肤溃烂、围口部肿胀病原菌假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp)接种于含有3% NaCl的LB液体培养基中，震荡培养12 16小时，取40 μ 1 50 μ 1指示菌均勻涂布于高盐营养琼脂培养基(蛋白胨10g/L，肉浸粉 10g/L,NaCL 30g/L，琼脂20g/L，PH为7. 4)平板上，用接种环或灭菌牙签挑取(1)中的单菌落于涂有指示菌的平板上，每个平板涂2 3个单菌落，或者将该平板贴上灭菌后的小圆形滤纸片(5mm直径)，并用移液枪取50 μ 1(1)中分离纯化的菌液涂于滤纸片上，每个平板上放两片或三片药敏片(药敏片直径为6mm)，并做三个平行平板，减少随机误差。将平板放在恒温培养箱中培养24h后，观察是否出现抑菌圈，并测量抑菌圈的大小。根据抑菌圈的大小筛选得到一株分离自刺参养殖池水的强拮抗菌YASM12，抑菌圈直径M 43mm。(3)牛沣杯法将筛选得到的强拮抗菌YASM12重新鉴定，方法如下将牛沣杯放入高盐营养琼脂培养基平板上，在牛沣杯中放入50 μ 1(1)中分离纯化的菌液，将平板放在恒温培养箱中培养24h后，观察是否出现抑菌圈，结果检测到抑菌圈直径为25mm。(4)拮抗菌YASM12胞外产物的抗菌活性鉴定利用盐析法制备上述( 、(3)筛选得到的拮抗菌的胞外产物，沉淀用PH7. 4、10mM的无菌PBS溶解，并用透析袋，4°C过夜透析后即得拮抗菌胞外产物，放入1. 5ml的灭菌EP管中。将制备得到的10 μ 1胞外产物涂在灭菌滤纸片上，并将滤纸片贴于涂布40 μ 1 50 μ 1指示菌的高盐营养琼脂培养基平板上，恒温培养箱中培养24h后，观察抑菌圈的大小。(5)拮抗菌YASM12的形态、生理生化和分子生物学鉴定将拮抗菌划线接种于 2216E平板，光学显微镜观察细菌形态和生理生化鉴定菌落特征为菌落呈乳白色，羽毛状， 有鞭毛，细胞革兰氏染色阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，对弧菌抑制剂0/1 敏感，接触酶阳性，氧化酶阳性，无盐条件下不生长，和3% NaCl胨水刺激其生长，IBSrRNA进行的分子生物学鉴定为奥氏弧菌(Vibrio ordalii)。菌株在高盐营养琼脂培养基平板上培养 24h后，菌落呈乳白色，羽毛状，有鞭毛可运动，革兰氏染色阴性。发酵葡萄糖产酸不产气，对
4弧菌抑制剂0/1 敏感，接触酶阳性，氧化酶阳性，无盐条件下不生长，和3% NaCl胨水刺激其生长。奥氏弧菌的培养条件将该菌涂布于高盐营养琼脂培养基(蛋白胨10g/L，肉浸粉10g/L，NaCL30g/L，琼脂20g/L, PH为7. 4)平板上，28°C培养16-18小时即长出单菌落。筛选的菌株的抗菌性检测实施例1 从市场购买体形均一、健康刺参，饲养于10L海水的整理箱中，每组15头， 实验期间连续充气，水温14 °C，每天换水，不投饵。将刺参病原菌假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp)和筛选分离到的奥氏弧菌(Vibrio ordalii)分别接种于含有 3 % Na C1的LB培养基中，观°C培养2 4 h后，离心，用无菌海水分别重悬，得菌悬液，进行以下四组实验处理(1)对照组，未加病原菌和拮抗菌；(2)水体中病原菌菌液终浓度为 3. 5X108CFU/ml ； (3)水体中拮抗菌和病原菌菌液终浓度均为3. 5X 108CFU/ml，拮抗菌比病原菌先1天加入；(4)水体中拮抗菌菌液终浓度为3. 5X108CFU/ml,以上四组处理每天换水补充菌液，定时观察记录各组发病和死亡情况。处理组⑵第3天刺参开始出现病症，第4 天出现死亡，第6天发病率是100%，死亡率是66. 7% ；处理组(3)中的刺参第5天有1头出现皮肤溃烂、围口部肿胀，第7天，死亡2头，死亡率为13.3%;处理组⑴和(4)则无一例死亡。 二、奥氏弧菌菌液制剂的制备将奥氏弧菌接种于添加了 3% NaCl的LB培养基中，条件下培养至0D600值达到0.6以上时终止培养，获得奥氏弧菌的扩大培养液；使菌液中的奥氏弧菌的浓度为 107-101QCFU/ml，即制得奥氏弧菌菌液制剂。本发明制得的奥氏弧菌菌液制剂可以添加在刺参饵料中或养殖水体中。三、拮抗菌奥氏弧菌胞外产物的信息1、拮抗菌奥氏弧菌胞外产物的制备拮抗菌接种于250ml、3% NaCl的LB培养基中，培养12-1 后，4°C、8000g离心10-20分钟，弃沉淀，取上清，搅拌条件下缓慢滴加饱和硫酸铵达50%的饱和度，于4°C沉淀30min以上或过夜，使蛋白充分沉淀，10000g/min，10min4°C离心，弃上清。沉淀用5ml、 pH7. 4、IOmM的无菌PBS溶解，并装入处理好的透析袋(截留分子量为14000Da)中，在4°C 条件下，于PH7. 4、IOmM的无菌PBS中透析过夜后，期间换两到三次PBS溶液，即得拮抗菌胞外产物，分装、放入1. 5ml的灭菌EP管中，_80°C条件下保存备用。2、拮抗菌奥氏弧菌胞外产物的抗菌效果检测实施例1 将健康、体形均一的刺参70头，饲养于IOL海水的整理箱中，随机分组每组15头， 实验期间连续充气，水温14°C，每天换水，不投饵。使用制备的拮抗菌胞外产物进行注射拮抗效果试验，方法如下，试验分3个处理，第1组为对照组，第2组为终浓度为3. 5 X IO8CFU/ ml的刺参病原菌处理组，第3组为注射20 40 μ 1的奥氏弧菌胞外产物后1天后加入终浓度为3. 5X108CFU/ml的刺参病原菌处理。10天后，第1组刺参无死亡，第2组刺参死亡率为100%，第3组的死亡率为20%。
实施例2 将健康、体形均一的刺参70头，饲养于IOL海水的整理箱中，随机分组每组15头， 实验期间连续充气，水温14°C，每天换水，不投饵。使用制备的拮抗菌胞外产物进行注射拮抗效果试验，方法如下，试验分3个处理，第1组为对照组，第2组为终浓度为3. 5 X IO8CFU/ ml的刺参病原菌处理组，第3组为注射20 40 μ 1的奥氏弧菌胞外产物后3天后加入终浓度为3. 5X108CFU/ml的刺参病原菌处理。10天后，第1组刺参无死亡，第2组的刺参死亡率为100%，第3组的死亡率为30%。实施例3 将健康、体形均一的刺参200头，饲养于IOL海水的整理箱中，随机分组，每组50 头，实验期间连续充气，水温14°C，每天换水。将制备的拮抗菌胞外产物混合入刺参饵料中， 进行拮抗效果试验，每天胞外产物的饲喂量为50 μ 1，连续饲喂6天后，再饲喂正常饵料， 进行病原菌感染试验。10天后，未进行拮抗菌胞外产物饵料饲喂的对照组刺参死亡率为 89%，第2组饲喂拮抗菌胞外产物饵料的刺参死亡率为30%。上述的实验结果表明，本发明筛选得到的刺参拮抗菌及其保外产物具有高效的拮抗效果，能够有效的提高刺参的抗病力，具有良好的市场推广前景。
权利要求
1.一种刺参拮抗菌，为奥氏弧菌，其保藏编号为CGMCC No. 4668。
2.一种菌液制剂，其特征在于包含有权利要求1所述的奥氏弧菌的活菌。
3.如权利要求2所述的菌液制剂，其特征在于上述的奥氏弧菌活菌的数量为IO7 10lclCFU/ml。
4.如权利要求2或3所述的菌液制剂，其特征在于上述的菌液的培养基为高盐营养培养基。
5.如权利要求4所述的菌液制剂，其特征在于上述的高盐营养培养基为添加有3%g/ ml NaCl的LB培养基。
6.一种细菌胞外产物，其特征在于是由权利要求1所述的奥氏弧菌发酵生产的。
7.权利要求6所述的胞外产物用作饲料添加剂或抗菌增效剂。
全文摘要
本发明涉及一种刺参拮抗菌及其应用，所述的刺参拮抗菌为奥氏弧菌，其保藏编号为CGMCC No.4668。本发明的拮抗菌用于制备菌液制剂和提取胞外产物。本发明筛选的具有拮抗刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病活性的细菌，拮抗活性强，利用盐析法制备的拮抗菌胞外产物的产量稳定，成本低，可具有较高的拮抗活性。使用该拮抗菌或拮抗产物对刺参的免疫保护率达70-80％，使用该拮抗菌产物为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制刺参皮肤溃烂、围口部肿胀疾病的发生和流行。
文档编号C12N1/20GK102206595SQ201110079359
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘均玲, 刘洪展, 吴艳君, 孙修勤, 曲凌云, 郑风荣 申请人:国家海洋局第一海洋研究所