专利名称：一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法，尤其是制备十一碳二元酸的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
长链二元酸是化工合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、高温电介质、医药和农药等的重要原材料。DC11(十一碳二元酸)是合成高性能尼龙1112、尼龙1110、尼龙1111、高级全合成润滑油和绿色农药等的重要原料。DC11自然界中不单独存在，化学方法无法合成，因此利用微生物特殊的氧化酶活力，在常温常压下发酵转化石油副产物中的正十一烷(IiC11)生产DC11,开辟了 DC11的新来源，为尼龙1111和尼龙1110等一系列尼龙工程塑料新品种的工业生产，为全合成润滑油的工业生产，为农药蜕皮性信息素的合成生产提供了物美价廉的重要原料。在以中科院微生物所陈远童为代表的一系列国内外长链二元酸的专利文献中，有许多用热带假丝酵母生产十二碳、十三碳、十四碳、十五碳、十六碳和十七碳二元酸的报道， 但鲜有微生物发酵转化高产十一碳二元酸的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法，该方法当原料正i^一烷(nCn)的纯度>99%时，DC1Ji度达到99%。本发明解脂假丝酵母(Candida lipolytica)CX-998号突变菌株是以一株在油田附近采集、分离筛选，按Lodder J.的酵母分类鉴定系统进行鉴定属于解脂假丝酵母，能氧化正烷烃生产二元酸的原始菌株为出发菌株，通过紫外线、亚硝酸和N+注入等方法，反复诱变和筛选培育出来的高产菌株，该菌株对正十一烷有较强的氧化酶活力、亲和力和乳化性。 该菌株已于2011年3月M日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO :M2011094。该菌株在麦芽汁琼脂斜面上菌落乳白色，粘湿，光泽，有些菌落的表面褶皱，边缘不整齐；细胞形态呈圆形或卵圆形。本发明的技术放案是以上述菌株制备长链二元酸的方法，其特征是，在以Cltl C18的正烷烃为基质的培养基中，用上述菌株发酵，然后经分离、提取、回收得到与正烷烃基质链相同的长链二元酸。本发明的种子培养基(1) 12Be'糖度的麦芽汁加麦芽汁重量1. 8%的琼脂制成的固体斜面；(2)12Be'糖度的麦芽汁液体培养基培养种子的过程为取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在麦芽汁固体斜面上(每个茄子瓶中装有20ml培养基，灭菌后放成斜面)，于培养40-44小时。取一支在茄子瓶培养好的上述解脂假丝酵母CX-998菌种全部刮入装有培养基的三角瓶中，于 200rpm的旋转摇床，培养44-48小时，作为发酵罐种子。
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用本发明解脂假丝酵母CX-998菌株发酵转化生产长链二元酸，特别是十一碳二羧酸的具体方法是把培养好并生长旺盛、无杂菌的发酵罐种子液接入PH6. 0-7. 2的含20-25% (ν/ν)的Cltl C18正烷烃和80-75% (ν/ν)的发酵培养基的混合液中；所述种子液的接种量优选为(v/V) =18-24% ；所述发酵培养基的组成为NaAC 8_15g/L，优选为 10-12g/L，KH2PO4 4-14g/L，优选为 8-lOg/L，NaCl 1. 0-1. 5g/L，优选为 1. 0-1. 2g/L，尿素 1. 0-2. 5g/L，优选为 1. 2-1. 5g/L，蔗糖 10_20g/L，优选为 12_16g/L，维生素 C 0. 5-1. 5g/L， 优选为1. 0-1. 2g/L，及一些公知的营养源。在pH7. 0-8. 2下，将混合液在^_32°C，优选在 27-30°C，通风发酵转化70-160小时。在0-48小时，pH控制在7. 0-7. 5 ；在48-120小时， PH控制在7. 5-7. 8 ；在120小时以后，pH控制在7. 8-8. 2。发酵结束后进行破乳，用过滤膜分离除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色液用H2SO4或HCl酸化结晶，压滤、洗涤、吹干、烘干得白色DCltl DC18。本发明的有益效果是用本发明的解脂假丝酵母CX-998菌株和发酵转化方法，可生产Cltl C18的各种单一和混合二元酸，其中在10立升发酵罐，从IIC11发酵转化生产DC11 时，144小时DC11产量高达165g/L，后处理收率88%，当IiC11纯度> 99%时，DC11纯度达到 99%。
具体实施例方式实施例1(1)取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在C 15X180大试管麦芽汁固体斜面上培养44小时；取上述培养好的菌种1支，接入装有300ml麦芽汁(12Be ’糖度) 种子培养基的500ml三角瓶中，于在200rpm的旋转摇床上培养2天。(2)在装有18ml含C11正烷烃和发酵培养基的混合液的500ml三角瓶中，接入上述种液，在200rpm的旋转摇床上发酵4天，每M小时用NaOH溶液调一次pH至7. 5。所述含C11正烷烃和发酵培养基的混合液的成分为nCn200ml/L (纯度> 99% ),NaAC 12g/L， KH2P049g/L, NaCl 1. lg/L，酵母膏 3g/L，玉米浆 2. 5g/L，尿素 1. 2g/L，蔗糖 13g/L，维生素 C lg/L，维生素B20.02g/L，自来水配制，pH7. 2，110°C灭菌30分钟。发酵结束后用HCl调pH 至3。用乙醚提取两次，除去乙醚，得二元酸结晶，用NaOH滴定，计算二元酸产量。结果DC11 产量为75g/L，DC11纯度为99. 2%0实施例2正烷烃采用nC13(纯度为99.0% )，其余步骤同实施例1，结果DC13产量为65. 4g/ L，DC13 纯度为 98. 5%。实施例3正烷烃采用nC15(纯度为98.5% )，其余步骤同实施例1，结果DC15产量为Mg/L， DC15 纯度为 98. 3%0实施例4正烷烃采用nC18(纯度为97.0% )，其余步骤同实施例1，结果DC18产量为44g/L， DC18 纯度为 96. 5%0实施例5(1)同实施例1步骤(1)。
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(2)含C11正烷烃和发酵培养基的混合液nCn200ml/L(纯度> 99% ) ；NaAC12g/ L，KH2P049g/L, NaCl 1. lg/L，酵母膏 3g/L，玉米浆 2. 5g/L，尿素 1. 2g/L，蔗糖 13g/L，维生素 C lg/L，维生素B20. 02g/L ；自来水配制，ρΗ7· 2，110°C灭菌30分钟。将1300ml培养2天，OD为1. 0，pH4. 2，健壮，无杂菌的种子液接入装有5. 5L含 Cll正烷烃和发酵培养基的混合液中，经121°C灭菌30分钟的IOL发酵罐中，^±0.5°C， 650rpm，罐压 0. 8kg/cm2，通气量 1 1，在 0-48 小时，pH 控制在 7. 0-7. 5 ；在 48-120 小时， PH控制在7. 5-7. 8 ；在120小时以后，pH控制在7. 8-8. 2。发酵144小时，产酸量达到165g/ L。发酵结束后，进行破乳，通过膜分离，除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色清液用 H2SO4酸化结晶，压滤、洗涤，吹干，烘干，得到白色DC11产品，后处理收率为88. 0%，DCn纯度为 99. 1%。实施例6(1)取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在C 15X180大试管麦芽汁固体斜面上培养42小时；取上述培养好的菌种1支，接入装有300ml麦芽汁(12Be'糖度) 种子培养基的500ml三角瓶中，于在200rpm的旋转摇床上培养44小时。(2)含C13正烷烃和发酵培养基的混合液nC13200ml/L (纯度99% ) ；NaACllg/L, KH2P048g/L, NaCl 1. 2g/L，酵母膏 3g/L，玉米浆 2. 5g/L，尿素 1. 5g/L，蔗糖 12g/L，维生素 C
0.8g/L，维生素B20. 02g/L,自来水配制，ρΗ7· 2，110°C灭菌30分钟。将1300ml培养44小时，OD为1. 0，pH4. 2，健壮，无杂菌的种子液接入装有5. 5L 含C13正烷烃和发酵培养基的混合液，经121°C灭菌30分钟的IOL发酵罐中，27. 5士0. 5°C， 650rpm,罐压 0. 8kg/cm2，通气量 1 1，在 0-48 小时，pH控制在 7. 0-7. 5 ；在 48-120 小时，pH 控制在7. 5-7. 8 ；在120小时以后，pH控制在7. 8-8. 2。发酵150小时，产酸量达到140g/L。 发酵结束后，进行破乳，通过膜分离，除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色清液用H2SO4 酸化结晶，压滤、洗涤，吹干，烘干，得到白色DC11产品，DC11纯度为98. 2%。实施例7(1)取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在C 15X180大试管麦芽汁固体斜面上培养43小时；取上述培养好的菌种1支，接入装有300ml麦芽汁(12Be'糖度) 种子培养基的500ml三角瓶中，于在200rpm的旋转摇床上培养46小时。(2)含C15正烷烃和发酵培养基的混合液nC15200ml/L(纯度99% ) ；NaAC10g/L, KH2P048g/L, NaCl 1. 3g/L，酵母膏 3g/L，玉米浆 2. 5g/L，尿素 1. 2g/L，蔗糖 15g/L，维生素 C
1.2g/L，维生素B20. 02g/L ；自来水配制，ρΗ7· 2，110°C灭菌30分钟。将1300ml培养46小时，OD为1. 0，pH4. 2，健壮，无杂菌的种子液接入装有5. 5L含 C15正烷烃和发酵培养基的混合液，经121°C灭菌30分钟的IOL发酵罐中，28. 5士0. 5 650rpm,罐压 0. 8kg/cm2，通气量 1 1，在 0-48 小时，pH控制在 7. 0-7. 5 ；在 48-120 小时，pH 控制在7. 5-7. 8 ；在120小时以后，pH控制在7. 8-8. 2。发酵140小时，产酸量达到118g/L。 发酵结束后，进行破乳，通过膜分离，除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色清液用H2SO4 酸化结晶，压滤、洗涤，吹干，烘干，得到白色DC11产品，DC11纯度为98.0%。
权利要求
1.解脂假丝酵母(Candidalipolytica) CX-998CCTCC NO :M2011094。
2.用权利要求1所述菌株制备长链二元酸的方法，其特征是，在以Cltl C18的正烷烃为基质的培养基中，用权利要求1所述菌株发酵，然后经分离、提取、回收得到与正烷烃基质链相同的长链二元酸。
3.如权利要求2所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，(1)取权利要求1所述菌株，涂布在麦芽汁固体斜面上，于培养40-44小时；将培养好的菌种刮入装有培养基的三角瓶中，于200rpm的旋转摇床，培养44-48小时，作为发酵罐种子；所述麦芽汁固体斜面为12Be'糖度的麦芽汁加麦芽汁重量1.8%的琼脂制成的固体斜面；所述培养基为12Be'糖度的麦芽汁液体培养基；(2)将步骤⑴培养好的发酵罐种子液接入pH6.0-7. 2的含20-25% (ν/ν)的Cltl C18 正烷烃和80-75% (ν/ν)的发酵培养基的混合液中；在ρΗ7.0-8.2下，将混合液在沈-321， 通风发酵转化70-160小时；所述发酵培养基的主要组成成份为NaAC 8_15g/L，KH2PO4 4-14g/L，NaCl 1. 0-1. 5g/L，尿素 1. 0-2. 5g/L，蔗糖 10_20g/L，维生素 C 0. 5-1. 5g/L ；(3)发酵结束后进行破乳，用过滤膜分离除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色液用H2SO4或HCl酸化结晶，压滤、洗涤、吹干、烘干得到产物长链二元酸。
4.如权利要求3所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述步骤O)的发酵条件是在0-48小时，pH控制在7. 0-7. 5 ；在48-120小时，pH控制在7. 5-7. 8 ；在120小时以后，PH控制在7. 8-8. 2。
5.如权利要求3所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述种子液的接种量为 18H
6.如权利要求3所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述发酵培养基的主要组成成份为=NaAC 10_12g/L，KH2P048-10g/L, NaCl 1. 0-1. 2g/L，尿素 1. 2-1. 5g/L，蔗糖 12-16g/L，维生素 C 1.0-1.2g/L。
7.如权利要求6所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述发酵培养基的组成为 NaAC 12g/L，KH2PO4 9g/L，NaCl 1. lg/L，酵母膏 3g/L，玉米浆 2. 5g/L，尿素 1. 2g/L，蔗糖 13g/L，维生素 C lg/L，维生素 B2 0. 02g/L。
8.如权利要求2-7中任意一项所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述长链二元酸为十一碳二元酸。
全文摘要
本发明公开了一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法，属于微生物发酵领域。该解脂假丝酵母菌株为解脂假丝酵母(Candida lipolytica)CX-998 CCTCC NOM2011094。该制备方法是在以C10～C18的正烷烃为基质的培养基中，用该菌株发酵，然后经分离、提取、回收得到与正烷烃基质链相同的长链二元酸。该方法可以生产C10～C18的各种单一和混合二元酸，其中在10立升发酵罐，从nC11发酵转化生产DC11时，144小时DC11产量高达165g/L，后处理收率88％，当nC11纯度＞99％时，DC11纯度达到99％。
文档编号C12R1/73GK102191187SQ201110081370
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者赵友谊 申请人:山东华星环保集团有限公司