专利名称：一种用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法
技术领域：
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种发酵方法，具体设计一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的半连续发酵方法。
背景技术：
多年来，化肥对农业增产增收起到了重要作用，但其对环境的损害已经为人们广泛关注。微生物肥料对改善土壤营养结构，增强土壤肥力，促进作物生长，增强作物抗病能力等方面具有重要作用。微生物肥料因具有无毒、无害、肥效显著持久、施用方便、适用范围广泛等优点而成为各国肥料研究的重点。中华人民共和国农业部陆续颁布了微生物肥料系列标准，如NY227-1994、NY/T798-2004等，标准中明确规定了肥料中微生物的种类与数量，有效微生物的安全性与数量是肥料质量的核心。微生物在不良环境(如干旱、高温等)下容易死亡，从而失去其应用价值。而微生物的休眠体“芽孢”具有抗逆性强、耐高温和干燥，、耐存储等优点，便于生产与应用。芽孢易在固体培养基上形成，但固体发酵存在易染菌、劳动强度大、效率低的不足，难以满足生产的要求。液体发酵中，需控制一定的发酵条件(如碳源浓度、氮源浓度、PH、溶氧等)才能形成芽孢，且芽孢形成所需的时间较长。目前，关于微生物芽孢培养方法的描述都是用分批或补料分批的培养方法。一般微生物肥料生产工艺是保藏菌种一斜面菌种培养活化一摇瓶扩大培养一种子罐扩大培养 —发酵罐液体发酵一吸附后包装或按稀释后直接包装。每批培养都需要种子扩培环节，导致整个生产周期较长，设备的利用率不高，且无菌操作要求高。分批操作还给生产控制带来困难。
发明内容
本发明的目的在于解决目前芽孢生产周期长、生产效率低，提供一种在大规模的液体发酵条件下，缩短生产周期并提高生产效率的用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续培养方法。本发明的目的是通过如下的技术方案实现的
用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法，其特征在于在发酵罐1培养芽孢杆菌至对数期末期或稳定期初期，取出一半以上发酵液至发酵罐2，在发酵罐2中促进芽孢形成；补充新鲜培养基到发酵罐1内至发酵液达到原体积，继续培养至稳定期，反复进行上述步骤。发酵液最后作什么用，什么时间停止？发酵液是不是最后的目标物？
所述的用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法，其特征在于具体操作步骤如
下
(1)将培养基加入到灭菌罐中，充分搅拌均勻后，通入蒸汽，于121-U6°C、 0. 11-0. 13Mpa下灭菌20-25分钟；降温至35_50°C，将培养基转移至灭过菌的发酵罐1中， 按5-15%的重量比率将处于对数生长期中后期的芽孢杆菌种子液接入发酵罐1，按罐压0. 02-0. 05Mpa,通风量1 1. 0-1. 2体积/体积/分，搅拌转速250-400rpm,罐温30-40°C的条件下，培养M_40h至微生物处于对数期末期或稳定期初期；通风量1 1. 0-1. 2体积/体积/分，意思不明确？
(2)取出发酵罐1中1/2-2/3体积的发酵液至灭过菌的发酵罐2中，按罐压 0. 02-0. 05Mpa,通风量1 0. 6-0. 8v体积/体积/分，搅拌转速200-300rpm,罐温32-37°C的条件下，培养18-24h;
(3)补充灭过菌的培养基到发酵罐1中，按(1)中培养条件培养16-24h至微生物处于对数期末期或稳定期初期；
(4)重复2)、3)过程。每当发酵罐1菌体至对数期末期或稳定期初期，就取出部分发酵液另外培养。所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。连续发酵时间为12-18天。本发明的方法已经在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等有肥料功能的芽孢杆菌的液体发酵生产中应用，该半连续生产可进行12-18d，发酵 15-20批次，芽孢形成率90-95%。本发明提供的发酵方法是在发酵罐生产过程中，采取带放的方式进行芽孢杆菌发酵，可实现半连续的进行菌种的培养，使该法易于在工业生产中应用。与现有的分批培养相比，优点在于(1)将菌体生长与生成芽孢分开进行，便于生产控制，对设备要求降低。(2) 大大减少量种子扩培次数，缩短了生产周期、降低了生产成本，效果显著。3)该方法操作简便，降低了因操作带来污染的几率。
具体实施例方式下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。实验装置
本发明的实验是在机械搅拌发酵罐中进行的，搅拌罐包括通风管、排气管、接种管、取样管、温度指示、罐压表、转子流量计、换热夹套等。发酵罐1体积为lm3，发酵罐2体积为 0. 7 m3。实施例1
将枯草芽孢杆菌的培养基(按重量百分比计，小麦粉2%，玉米浆0. 2%，磷酸氢二钾 0. 5%，黄豆饼粉0. 5%，菜籽油0. 2%，pH7. 2-7. 4，其余为水)700公斤加入到发酵罐1中，搅拌均勻，蒸汽通入夹套，培养基升温至121°C，表压0. llMpa，保温保压25分钟进行灭菌。降温至40°C，通过接种管道将枯草芽孢杆菌种子液70公斤加入到发酵罐1中，在罐温37°C、罐压0. 02-0. 05Mpa、搅拌转速每分钟320转、通气量1:1.2体积/体积/分进行培养，培养36 小时，镜检培养开始出现芽孢，通过管道将发酵液500公斤运至发酵罐2。发酵罐2在罐温 37°C、罐压0. 02-0. 05Mpa、搅拌转速每分钟250转、通气量1:1.0体积/体积/分进行培养， 培养18小时，细胞浓度为30亿CFU、ml，芽孢形成率约95%。补充灭过菌的培养基500公斤至发酵罐1中，应用上述罐1培养条件(罐温37°C、罐压0. 05Mpa、搅拌转速每分钟320转、 通气量1:1. 2体积/体积/分)进行培养20小时，将发酵液500公斤运至发酵罐2，应用发酵罐2培养条件进行培养18小时，如此反复，共进行18批次，芽孢形成率90-95%。18批次耗时384小时，得到芽孢发酵液9270公斤。对比例1
将枯草芽孢杆菌采用与实施例1相同的培养基和灭菌方法，培养基灭菌结束后，接入种子液，在前36小时采用上述罐1培养条件，后18小时采用罐2培养条件，1个周期共64 小时，包括发酵培养M小时，清洗灭菌10小时，罐1 (投料700公斤，70公斤种子液)、罐2 (投料450公斤，种子液50公斤)同时进行发酵，每罐各进行6批次，共进行12批次，耗时 384小时，得到芽孢发酵液7620公斤。实施例2
将胶质芽孢杆菌的培养基(按重量百分比计，小麦粉1%，黄豆饼粉0. 5%，磷酸氢二钾 0. 05%，硫酸镁0. 25%，硫酸铵0. 1%，泡敌0. 002%, ρΗ7· 2-7. 4，其余为水)700公斤加入到发酵罐1中，搅拌均勻，蒸汽通入夹套，培养基升温至121°C，表压0. 1 IMpa,保温保压25分钟进行灭菌。降温至40°C，通过接种管道将胶质芽孢杆菌种子液100公斤加入到发酵罐1中， 在罐温35士2°C、罐压0. 05Mpa、搅拌转速每分钟280转、通气量1:1.0体积/体积/分进行培养，培养40小时，镜检培养开始出现芽孢，通过管道将发酵液400公斤运至发酵罐2。发酵罐2在罐温37°C、罐压0. 05Mpa、搅拌转速每分钟250转、通气量1:0. 8体积/体积/分进行培养，培养18小时，芽孢形成率约95%。补充灭过菌的培养基400公斤至发酵罐1中， 应用上述罐1培养条件(罐温37°C、罐压0. 05Mpa、转速每分钟300转、通气量1:1. 0体积/ 体积/分)进行培养20小时，将发酵液400公斤运至发酵罐2，应用发酵罐2培养条件进行培养18小时，如此反复，共进行18批次，芽孢形成率90-95%。18批次耗时398小时，得到芽孢发酵液9200公斤。对比例2
将胶质芽孢杆菌采用与实施例2相同的培养基和灭菌方法，培养基灭菌结束后，接入种子液，在前36小时采用上述罐1培养条件，后M小时采用罐2培养条件，1个周期共68 小时，包括发酵培养58小时，清洗灭菌10小时，罐1 (投料700公斤，100公斤种子液)、罐 2 (投料360公斤，种子液40公斤)同时进行发酵，每罐各进行6批次，共进行12批次，耗时 408小时，得到芽孢发酵液7200公斤。实施例3
将地衣芽孢杆菌的培养基(按重量百分比计，小麦粉1%，玉米粉1. 0%，黄豆饼粉2. 5%， 玉米浆0. 3%，七水合硫酸镁0. 2%，一水合硫酸锰 0. 04%,菜籽油0. 2%，pH7. 2-7. 4，其余为水)700公斤加入到发酵罐1中，搅拌均勻，蒸汽通入夹套，培养基升温至121 °C，表压 0. llMpa，保温保压25分钟进行灭菌。降温至40°C，通过接种管道将地衣芽孢杆菌种子液70 公斤加入到发酵罐1中，在罐温37°C、罐压0. 05Mpa、搅拌转速每分钟300转、通气量1:1. 0 体积/体积/分进行培养，培养36小时，镜检培养开始出现芽孢，通过管道将发酵液500公斤运至发酵罐2。发酵罐2在罐温37°C、罐压0. 05Mpa、搅拌转速每分钟250转、通气量1 0. 8 体积/体积/分进行培养，培养16小时，芽孢形成率约95%。补充灭过菌的培养基500公斤至发酵罐1中，应用上述罐1培养条件(罐温37°C、罐压0. 05Mpa、转速每分钟300转、通气量1:1. 0体积/体积/分)进行培养16小时，将发酵液500公斤运至发酵罐2，应用发酵罐 2培养条件进行培养16小时，如此反复，共进行18批次，芽孢形成率90-95%。18批次耗时 3 小时，得到芽孢发酵液9270公斤。
5
对比例3
将地衣芽孢杆菌采用与实施例3相同的培养基和灭菌方法，培养基灭菌结束后，接入种子液，在前36小时采用上述罐1培养条件，后16小时采用罐2培养条件，1个周期共62 小时，包括发酵培养52小时，清洗灭菌10小时，罐1 (投料700公斤，种子液70公斤)、罐 2 (投料450公斤，种子液50公斤)同时进行发酵，每罐各进行6批次，共进行12批次，耗时 372小时，得到芽孢发酵液7620公斤。实施例4
将巨大芽孢杆菌的培养基(按重量百分比计，小麦粉2%，玉米浆0. 1%，黄豆饼粉0. 5%， 磷酸氢二钾0. 15%，七水合硫酸镁0. 2%，pH7. 2-7. 4，其余为水)700公斤加入到发酵罐1 中，搅拌均勻，蒸汽通入夹套，培养基升温至121°C，表压0. 1 IMpa,保温保压25分钟进行灭菌。降温至40°C，通过接种管道将巨大芽孢杆菌种子液70公斤加入到发酵罐1中，在罐温 37°C、罐压0. 02-0. 05Mpa、搅拌转速每分钟280转、通气量1 0. 9体积/体积/分进行培养， 培养32小时，镜检培养开始出现芽孢，通过管道将发酵液500公斤运至发酵罐2。发酵罐2 在罐温37°C、罐压0. 02-0. 05Mpa、转速每分钟250转、通气量1:0. 8体积/体积/分进行培养，培养16小时，芽孢形成率约95%。补充灭过菌的培养基500公斤至发酵罐1中，应用上述罐1培养条件(罐温37°C、罐压0. 02-0. 05Mpa、搅拌转速每分钟280转、通气量1:0. 9体积/体积/分)进行培养18小时，将发酵液500公斤运至发酵罐2，应用发酵罐2培养条件进行培养16小时，如此反复，共进行18批次，芽孢形成率90-95%。18批次耗时3M小时， 得到芽孢发酵液9270公斤。对比例4
将巨大芽孢杆菌采用与实施例4相同的培养基和灭菌方法，培养基灭菌结束后，接入种子液，在前32小时采用上述罐1培养条件，后16小时采用罐2培养条件，1个周期共58 小时，包括发酵培养48小时，清洗灭菌10小时，罐1 (投料700公斤，种子液70公斤)、罐 2 (投料450公斤，种子液50公斤)同时进行发酵，每罐各进行6批次，共进行12批次，耗时 348小时，得到芽孢发酵液7620公斤。在前32小时采用上述罐1培养条件，后16小时采用罐2培养条件，是什么意思？ 罐1与罐2本身培养条件是不同的，而且，如何区分前32小时、后16小时。
权利要求
1.用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法，其特征在于在发酵罐1培养芽孢杆菌至对数期末期或稳定期初期，取出一半以上发酵液至发酵罐2，在发酵罐2中促进芽孢形成；补充新鲜培养基到发酵罐1内至发酵液达到原体积，继续培养至稳定期，反复进行上述步骤。发酵液最后作什么用，什么时间停止？发酵液是不是最后的目标物？
2.根据权利要求1所述的用于微生物肥料的芽孢杆菌的半连续发酵方法，其特征在于具体操作步骤如下(1)将培养基加入到灭菌罐中，充分搅拌均勻后，通入蒸汽，于121-U6°C、 0. 11-0. 13Mpa下灭菌20-25分钟；降温至35_50°C，将培养基转移至灭过菌的发酵罐1中， 按5-15%的重量比率将处于对数生长期中后期的芽孢杆菌种子液接入发酵罐1，按罐压 0. 02-0. 05Mpa,通风量 1 1. 0-1. 2 体积 / 体积 / 分，搅拌转速 250-400rpm,罐温 30-40°C 的条件下，培养对-4011至微生物处于对数期末期或稳定期初期；通风量1 1.0-1. 2体积 /体积/分，意思不明确？(2)取出发酵罐1中1/2-2/3体积的发酵液至灭过菌的发酵罐2中，按罐压 0. 02-0. 05Mpa,通风量 1 0. 6-0. 8v 体积 / 体积 / 分，搅拌转速 200-300rpm,罐温 32-37°C 的条件下，培养18-24h;(3)补充灭过菌的培养基到发酵罐1中，按(1)中培养条件培养16-24h至微生物处于对数期末期或稳定期初期；(4)重复2),3)过程。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每当发酵罐1菌体至对数期末期或稳定期初期，就取出部分发酵液另外培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于连续发酵时间为12-18天。
全文摘要
本发明涉及一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的半连续发酵方法，通过两步培养法制备芽孢杆菌发酵液。将发酵液培养至对数期末期或稳定期初期，流出部分发酵液至另一发酵罐培养至成熟发酵液，而对原发酵罐进行补料培养。补料可进行16-20次，大大减少了种子扩培次数，缩短生产周期，提高生产效率，可实现半连续的工业生产。
文档编号C12N1/20GK102242075SQ201110099929
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者唐旺全, 杨柳, 杨红兵 申请人:马鞍山科邦生态肥有限公司