专利名称：Cyp2e1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的检测方法
技术领域：
本发明涉及的是基因技术领域的核酸及其引物和检测方法，具体地讲是一种分离 核酸、一种等位基因特异性的核酸引物和一种CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态 性的检测方法。
背景技术：
细胞色素氧化酶P450 2E1(CYP2E1)是细胞色素P450的一个成员。CYP2E1在 人类肝微粒体内含量丰富，约占CYP450S总量的7%。人类的CYP2E1基因定位在染色体 10q26. 3。CYP2E1含有9个外显子和8个内含子，在起始密码子附件具有典型的TATA盒，全 长约11. 51Λ。细胞色素P4502E1是一种膜结合蛋白，分子质量为57kDa，由493个氮基酸组 成，主要结合在内质网膜上。CYP2E1主要负责小分子量物质如丙酮、乙醇、乙酸等，以及亚硝 酸胺、芳香族类致癌物的代谢活化过程。此外，临床上约有4%的常用药物由CYP2E1催化代 谢，它常见的底物有氯唑沙宗、异烟胼、水杨酸类药物等。多数CYP2E1的单核苷酸突变可以 影响基因的后续转录和表达，进而改变了酶的结构和活性，这是造成个体差异的主要原因。 鉴于CYP2E1在药物代谢中的作用及活性存在个体差异，因此对解决CYP2E1基因多态性的 检测和相关问题是现有技术急需解决的技术难题。对现有文献的检索，未发现有本发明的CYP2E1基因第七号外显子(C1009 —T)单 核苷酸多态性(SNP)相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CYP2E1基因第七号外显子 的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物， 可用于评估个体患CYP2E1基因的第七号外显子相关疾病的易感性，以及用于CYP2E1基因 多态性与临床用药安全关系的研究。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种检测人CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的方法，它 包括步骤(a)采用I^rimer 5. 0等相关软件，以GenBank数据库CYP2E1基因(J02843)第七 号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物， 利用引物对来扩增CYP2E1基因的第七号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得 到相应分离核酸。(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。采用一些分析技术可用于检测分 离核酸的CYP2E1基因第七号外显子的SEQ ID NO :1所示序列的第1009位核苷酸是否存在 单核苷酸多态性，即C — T的碱基突变。步骤(b)检测多态性时采用的方法包括DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割 法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法和/或变性高效液相色谱法。本发明又涉及一种CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的检测方法的应 用，其特征在于，用于评估个体患CYP2E1基因的第七号外显子相关疾病的易感性，用于研 究我国人群中CYP2E1基因多态性与临床用药安全的关系，用于新药的研究开发。本发明还涉及一种分离核酸，它具有SEQ ID NO :1所示的序列，且第1009位为T。本发明进一步涉及一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15_50bp，且特异性 地杂交并扩增出含人CYP2E1基因第七号外显子的SEQ ID NO :1所示序列的第1009位的单 核苷酸多态性的扩增产物。本发明所述的“分离纯化”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增每个多态 性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等 样品中抽提出的DNA或mRNA。对于CYP2E1基因的第七号外显子活性而言，可以任何含有 CYP2E1基因的第七号外显子的样品，如血液等。本发明“分离出的或纯化的”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增多态性 位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。通过对所取样品CYP2E1基因测 序结果，在汕头中发现了 1个样品含有CYP2E1基因的第七号外显子SNP (即第C1009 — T)。 本发明为研究我国人群中CYP2E1基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为药物 设计和临床用药个体化提供了基因学理论根据，同时也为基于药物基因组学理念的新药研 发提供指导依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常照常 规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例步骤1一种核酸的分离和测序引物设计采用Primer 5. O软件，以GenBank数据库CYP2E1基因(NM_000773. 3)第七号外 显子以及外显子与内含子接含部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，由 Invitrogen公司合成。引物信息扩增CYP2E1基因的第七号外显子SNP位点的DNA序列引物信息正向引物5，-TGGATAAAAGCGTGATTGAATAGATGG-3，反向引物5，-CTGGAGATGCAGTATCCCACA-3，PCR扩增条件(体系各项试剂除DNA外均由Bio-Asia公司提供)反应体系总体积为15 μ 1，其中ddH20 10. Ομ 1 灭菌双蒸水
10X Buffer 1. 5 μ 1聚含反应缓冲液包含KCl Tris-HCl溶液DMSO 0. 6 μ 12mM dNTP 1. 5μ 1IOpM正反向引物各0.6μ 15U Taq 0. 3 μ 1 DNA 合成多聚酶10ng DNA 0. 5 μ 1 10ng 人体 DNA 扩增摸板PCR反应条件940C 3mins ；94°C 30seconds ；64°C 30seconds，_0· 5°C /CYCLE ；72°C Imin ； 14times to2 ；30X (94°C 30seconds ；57°C 30seconds ；72°C Imin ；)72°C 10mins。测序反应均作正反向，条件如下扩增产物酶纯化法PCR产物2 μ 1加入2 μ 1纯化酶系内含SAP (Shrimp alkalin印hosphatase，碱性磷酸酶)0. 15u 和 Exo-nuclease I (核酸外切酶 1)0. 75u/ul, 37°C 30mins，85°C 20mins，4°C保存备用。 贝Ij 序米用 ABI Prism BigDye terminator (BDT) cycle sequencing reaction kit (PE AppliedBiosystems)，测序总体积为5 μ 1，其中纯化后的PCR产物4 μ 1， BDT 0. 5μ 1，正向或反向引物 0. 5μ 1。反应条件是 94°C 2mins，35X(94°C 30seconds， 55°C 40seconds,60°C 1. 5mins)，4°C保存备用。上样前纯化5μ 1测序产物中加入25 μ 1无水乙醇和3. Omol/L醋酸钠混合液 (V V = 25 1)，室温、避光、静置 15min，4000rpm/min 45mins, 700rpm/min 5seconds 弃 上清；2X (75% Alcohol 25 μ 1,4000rpm/min IOmins，700rpm/min 5seconds 弃上清)；室 温、避光、静置、风干20mins ；上样8 μ 1于3100测序仪进行测序。步骤2SNP的获得对CYP2E1基因进行直接测序。将测定的各样本序列与GenBank数据库CYP2E1 基因序列(ΝΜ_000773.幻进行比较，从而得出序列的差异。在汕头中发现了 1个样品含有 CYP2E1基因第七号外显子SNP (即第1009位C — T点突变)，而其它样品该位点的基因型 均为C，只有这1个样品的基因型为T ；经分析发现，该SNP位于血红素辅基结合区域与血红 素的结合有关。CYP2E1基因⑶S及其多态性位点的⑶S序列如SEQ NO. 1所示(a)序列特征
*长度500碱基对
*类型核酸
1 连型双链
(b)反义否
(C)最初来源人
(d)SEQ ID NO. 1核酸序列描述如下
gatggataaaagcgtgattgaatagatgggtggatgatgggtggatgccc
aactggccaggaaccaatccctgaaatttgtcccattcatatcttggcag
AGAAGCTCCATGAAGAAATTGACAGGGTGATTGGGCCAAGCCGAATCCCT
GCCATCAAGGATAGGCAAGAGATGCCCTACATGGATGCTGTGGTGCATGA
GATTCAGCGGTTCATCACCCTCGTGCCCTCCAACCTGCCCCATGAAGCAA
CCCGAGACACCATTTTCAGAGGATACCTCATCCCCAAGgttaagcaatga
gcctgcagcacacagcatgaacaccatcctatcagctaatcgccttcctg
ccagggagcaggatgggggccccaagacccttccctttggcaggggtcac
tgaggggaagggctggccccactcccaccctgtgggatactgcatctcca
ggagtgctcacattggcctggtgaccagagaggtggaggaaatctggaaa
备注大写字母表示第七号外显子的DNA序列，红色字母即为新发现的突变位点。
扩增CYP2E1基因第七号外显子SNP位点的DNA序列如SEQ NO. 2所示
(a)序列特征
*长度449碱基对
*类型核酸
1 连型双链
(b)反义否
(C)最初来源人
(d)SEQ ID NO. 2核酸序列描述如下
tggataaaagcgtgattgaatagatgggtggatgatgggtggatgccc
aactggccaggaaccaatccctgaaatttgtcccattcatatcttggcag
AGAAGCTCCATGAAGAAATTGACAGGGTGATTGGGCCAAGCCGAATCCCT
GCCATCAAGGATAGGCAAGAGATGCCCTACATGGATGCTGTGGTGCATGA
GATTCAGCGGTTCATCACCCTCGTGCCCTCCAACCTGCCCCATGAAGCAA
CCCGAGACACCATTTTCAGAGGATACCTCATCCCCAAGgttaagcaatga
gcctgcagcacacagcatgaacaccatcctatcagctaatcgccttcctg
ccagggagcaggatgggggccccaagacccttccctttggcaggggtcac
tgaggggaagggctggccccactcccaccctgtgggatactgcatctccag
备注大写字母表示第七号外显子的DNA序列，红色字母即为新发现的突变位点。
本实施例中采用的样品包括上海(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)、汕头(100 例，男女各50例，年龄为18-53岁)、和西安(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)，
沈阳(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)，均为正常人。全体参与者均在正式的知情同 意书上同意签字。对所取样品进行CYP2E1基因的PCR扩增与测序，根据对所取样品CYP2E1基因测 序结果，在汕头中发现了 1个样品含有CYP2E1基因的第七号外显子SNP (即第1009位C — T 的点突变)。CYP2E1基因第七号外显子的cDNA序列列于SEQ ID NO. 1。CYP2E1基因第七号外 显子的基因组序列可以从GenBank中获得。扩增CYP2E1基因第七号外显子SNP位点的DNA 序列列于SEQ NO. 2。
权利要求
1.一种CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括如 下步骤(a)以GenBank数据库CYP2E1基因第七号外显子以及外显子与内含子接含部位序列 为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2E1基因的列于SEQ NO. 2第七号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸；(b)检测分离核酸的CYP2E1基因第七号外显子的SEQID NO. 1所示序列的第1009位 核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即1009位C — T。
2.根据权利要求1的所述的CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的检测方法， 其特征是，步骤(b)检测多态性时采用的方法包括DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割 法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法和/ 或变性高效液相色谱法。
3.一种根据权利要求1的所述的CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的检 测方法的应用，其特征在于，用于评估个体患CYP2E1基因的第七号外显子相关疾病的易感 性，用于研究我国人群中CYP2E1基因多态性与临床用药安全的关系，用于新药的研究开 发。
4.一种分离核酸，其特征在于，具有SEQ ID NO. 1所示的序列，且第1009位为T。
5.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交 并扩增出含人CYP2E1基因的第七号外显子的SEQ ID NO. 1所示序列的第1009位的单核苷 酸多态性的扩增产物。
全文摘要
本发明涉及一种CYP2E1基因第七号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物。方法包括确定在人CYP2E1基因第七号外显子的SEQ ID NO.1所示序列的第1009位的核苷酸；检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性；一种分离核酸，具有SEQ ID NO.1所示的序列，且第1009位为T；一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2E1基因的第七号外显子的SEQ ID NO.1所示序列的第1009位的单核苷酸多态性的扩增产物。本发明可用于研究我国人群中CYP2E1基因多态性与临床用药安全的关系，为新药研发提供指导依据。
文档编号C12Q1/68GK102146481SQ20111011028
公开日2011年8月10日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者汤柯夫, 沈陆, 秦胜营, 贺林, 陈培华 申请人:上海交通大学, 上海佰真生物科技有限公司