专利名称：肠出血性大肠杆菌的主要血清型o157核酸筛查方法
技术领域：
本发明属于疫病检验领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157核酸筛查方法。主要应用于肠出血性大肠杆菌主要血清型0157 的核酸检测。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌(EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，EHEC分为157、沈、111等血清型，主要致病菌株为0157 :H7，可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。2011 年5月，德国爆发肠出血性大肠杆菌病。据罗伯特 科赫研究所6月观日公布的最新疫情通报，德国一个多月来肠出血性大肠杆菌感染病例累计达3901例，截至27日，死亡患者已达47人。报告还指出，本次德国疫情与以往产志贺毒素大肠杆菌造成的疫情不同，其特点为一、感染病例中溶血性尿毒综合征重症病例所占比例达25%，远高于以往疫情；二、溶血性尿毒综合征病例中成人患者约占89%，且多数是女性。而以往产志贺毒素大肠杆菌感染者多数是儿童，且没有明显性别差异；三、以往疫情致病菌大多数是血清型0157型大肠杆菌，这次则是0104型；四、本次感染的潜伏期平均为8天，以往是3到4天。自1982年美国首次发现因大肠杆菌0157:H7致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌0157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本、澳大利亚、南非等多个国家引起发病。1989年美国密苏里州240余人因饮用水感染，死亡4人，1995年美国西海滨因“汉堡包”造成700余人发病，4人死亡。1992年南非由于饮水和粮食不卫生造成上千人发病。日本，于1984年首次出现该病感染，1990 1995年共发生8起由该菌引起的中毒事件，1996年5 8月间，日本包括冈山、广岛、名古屋、神户、东京等在内的30多个都、 府、县的小学、保育学校及幼儿园中多次发生集体食物中毒，发病人数达到9000人以上，以致上百所小学停课、幼儿园关门。我国在1987年就发现由此菌引起的散在感染，近年来已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌。美国，于2006 年9月中旬爆发“毒菠菜”事件，10月26，洛杉矶电，美国加利福尼亚州卫生官员沈日说， 调查表明，“毒菠菜”污染事件可能是因为野猪将大肠杆菌带到了菠菜田里。加州卫生服务部的调查人员于当天晚间召开新闻发布会说，自9月中旬以来，已有204人因食用加州东部萨利纳斯谷地生产的“毒菠菜”而患病，其中3人死亡。迄今美国有沈个州发现食用“毒菠菜”的患者，加拿大也有一个省被殃及。大肠杆菌通常存在于动物的肠内，并通过粪便物传播。未煮过的农产品、未消毒的原料奶、未经高温灭菌的果汁以及被污染的水和肉类中，都容易寄生这种细菌，但并非每种大肠杆菌都会致病。0157:H7感染包括无症状感染，轻度腹泻，出血性结肠炎及其并发症。 感染0157 H7后潜伏期一般为3 4天，长者达10天，临床症状轻重不一，轻者无症状或仅有轻度腹泻。及上呼吸道症状，大多在5 10天内痊愈，典型病例表现为突然发生的剧烈腹痛和非血性腹泻，数天后出现血性腹泻，无粪质，不发热或仅有轻度发热，血白细胞计数增多，感染7天后，可发生严重的溶血性尿素综合症(HUS)，发生率约3% 10%，暴发流行时比例稍低，HUS表现为在腹痛、腹泻症状好转后突然出现溶血性贫血症状(如酱油尿，进行性贫血，黄疸等)、肾功能衰竭症状(水肿、少尿或无尿，尿毒症状，高血钾等)和出血症状 (便血、呕血、硬脑膜下出血或视网膜出血，皮肤伤亡斑少见)。由于HUS存在广泛的微血管血栓形成，可导致多脏器多系统损害如脑、心血管系统、肝、胰等，30%病例可发生脑功能不全，(如各种意识障碍，活动障碍和肌张力异常)40%病例有轻而短暂的肝损害。心血管系统受损可表现为高血压，急性期绝大多数有轻度可逆性、易控制的高血压，与肾素活性相关性不大，循环内皮素可能起重要作用。并发HUS的病死率较高，早期达30 % 50 %，近年来由于诊断、治疗水平的提高死亡率大大下降。另一严重的并发症是栓塞性血小板减少性紫癜(TTP)，临床表现与HUS相似，但神经系统症状较多而肾脏损害较少，TTP死亡率亦可高达 30% 50% .目前肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157的检测方法主要是微生物培养鉴定及多重PCR检测技术。(1)大肠杆菌培养，结果可信度高，并能做细菌药敏试验，但需时过长， 应用受到限制，同时由于肠出血性大肠杆菌主要血清型0157菌株多为烈性人兽共患传染病菌，对实验室安全要求较高，不利于肠出血性大肠杆菌主要血清型0157的普遍筛选。(2) 聚合酶链反应(PCR)，特异性较差，优点是敏感度可达98% 100%，但是其需要PCR扩增仪、凝胶电泳等相关昂贵设备，不利于现场快速测定。21世纪初，Notomi T等开发了一种新颖的恒温核酸扩增理论，即所谓的环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，利用一种链置换Bst DNA聚合酶在恒温条件(65°C左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，短时间扩增效率可达到IO9-IOltl个拷贝。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或显色反应进行判断是否发生反应。该方法不需要模板的热变性、 长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速、廉价 (不需要特定的贵重检测设备，只需要简单结构的恒温箱)、易检测(直接进行目测判断) 等特点。
发明内容
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌主要血清型0157 核酸筛查方法，LAMP检测技术的检测高于常规检测法100-200倍，有力地解决了传统的微生物培养鉴定方法检出率较低的问题；另外由于经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求较高(如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂，不利于其在基层医疗防疫、检验检疫机构的普遍应用，而LAMP检测技术只需要简单机构的恒温箱，检测时间短 (0. 5-1.0小时)、特异性高(针对靶基因的8个区域设计6种特异引物)等特点，可以使用基因扩增技术在现场监测中广泛使用。本发明是这样实现的一种肠出血性大肠杆菌主要血清型0157核酸筛查方法，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在设置阳性和阴性对照的情况下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157进行核酸筛查；所述特异性引物为
权利要求
1. 一种肠出血性大肠杆菌主要血清型0157核酸筛查方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在设置阳性和阴性对照的情况下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157进行核酸筛查；所述特异性引物为引物类别序列组成F3前外引物5’ -CACACTTATTGGATGGTCTCA-3‘B3后外引物5’ -TAGGCTGGGGAAACTAGG-3‘FIP前内引物5’ -GGCCTTGTTTCGATGAGTTTATCTGTTTTCTAACTAGGACCGCAGAGG-3’BIP后内引物5’ -CTGTCCACACGATGCCAATGTTTTTAATTAATTCCACGCCAACC-3’LoopF环状引物5’ -CAAGGTGATTCCTTAATTCCTCTCT-3‘LoopB环状引物5’ -GCACCCTATAGCTGAGGATCT-3‘
2.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157核酸筛查方法，其特征在于，利用环介导等温扩增技术扩增肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157的特定靶核酸序列区域。
3.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157核酸筛查方法，其特征在于，所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控菌株购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，ATTCC编号7007 ，阳性对照质控品为利用天根基因提取试剂盒提取的大肠杆菌0157的基因，阴性对照质控品为不相同于扩增细菌靶基因的DNA，并使用电泳分析、 沉淀分析或STOR Green I荧光染料显色法同时检测阴阳对照和肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157靶基因扩增产物。
4.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157核酸筛查方法，针对肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157中的genbank登录号为S83460的rfbE基因设计环介导等温扩增特异性引物。
5.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌的主要血清型0157核酸筛查方法，其特征在于，所用的环介导等温扩增反应体系是2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分40mM Tris-HCl、pH8. 8、20mM KCl、20m M(NH4)2SO4UOmM MgSO4^O. 2% Triton X_100、2. 4mM dNTP、 1. 6M甜菜碱；所述引物混合物2ul，其终浓度组成为F3为0. 2umol/L，B3为0. 2umol/L,FIP 为 1. 6umol/L, BIP 为 1. 6umol/L, LF 为 0. 8umol/L, LB 为 0. 8umol/L ；模板 DNA Iul、BSt 聚合酶1. 5ul、补超纯水至20ul ；反应程序63°C 30分钟一80°C 3分钟一10°C保存。
全文摘要
本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法。利用环介导等温扩增(LAMP)技术来进行，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性对照和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157进行核酸筛查。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/19GK102268480SQ20111020289
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者张沙秋, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学