专利名称：一种新的三萜合成酶的功能及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新的三萜合成酶的功能及应用。
背景技术：
三萜化合物包括游离三萜和三萜皂苷，广泛存在于高等植物中。三萜化合物是通过异戊二烯途径来合成的，其生物合成路线为甲羟戊酸(Mevalonic acid)生成的异戊烯二磷酸(IPP)及其异构体二甲基丙烯二磷酸(DAPP)在香草二磷酸合成酶(GPS)作用下首先形成香叶二磷酸(GPP)，接着利用法呢二磷酸合成酶(FPQ转化成法呢二磷酸(FPP)，又在鲨烯合成酶(Squalene synthase, SQS)的作用下合成鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(Squalene 印oxidase，SQE)催化转变为2，3_氧化鲨烯(2，3-oxidosqualene)。2，3_氧化鲨烯在氧化鲨烯环化酶(OSCs)的作用下环化形成三萜化合物的前体物质，如β -香树素(β -amyrin)。 目前已经从拟南芥、水稻、苜蓿、百脉根等不同的植物中分离得到了几十个编码OSCs酶的基因，除了合成植物留醇的环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase, CAQ，还包括 arabidiol synthase,(lupeol synthas,LUP)、βi^BI ( β -Amyrin synthase, β AS)、^|p二; 酉享(cucurbitadienol, CPQ) >thalianol synthase (THA) > marneral synthase (MRN)、camel1iol synthase(CAMS)、baruol synthase(BARS)、 isomultiflorenol synthase (IMS)等。另外，人们从双子叶植物中发现了羊毛甾醇合成酶 (lanosterol synthase，LAQ，并证实在拟南芥中参与了植物留醇的合成。三萜化合物骨架在依赖细胞色素P450单加氧酶、糖基转移酶和酰基转移酶进行氧化、糖基化及酰基化等化学修饰，最终获得不同种类的三萜皂苷。众所周知，三萜化合物是一种重要的天然药物，例如，齐墩果酸具有降低转氨酶的功能，临床用于治疗急性黄疸肝炎；人参皂苷具有增加白细胞数量、提高人体免疫力、促进物质代谢、抗疲劳、抗衰老等作用。但三萜化合物的生物学功能的了解还非常少，例如燕麦在根尖合成的燕麦苷(avenacins)具有广谱的抗菌功能，能防止多种病原菌侵染根部，发挥抗病作用。在水稻中发现有7个可编码全长OSCs酶的基因序列，并鉴定了其中4个OSC基因的生化功能，它们分别是环阿屯醇合酶基因(0s02g04710/0s0SC3)，帕克醇(parkeol)合酶基因(0sllg08569/0s0SC9)，蓍醇 B (achilleol B)合酶基因(0sllgl81/0s0SC10)，以及异山苷子萜醇(isoarborinol)合酶基因(0sllg35710/0s0SC12)，还有一些OSC基因的功能
不清楚。
发明内容
本发明的一个目的是提供OsOSCS蛋白的应用。本发明提供了 OsOSCS蛋白在制备三萜化合物中的应用；所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述三萜化合物的结构式如下式I所示
权利要求
1.OsOSCS蛋白在制备三萜化合物中的应用；所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于 所述三萜化合物的结构式如下式I所示式
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述OsOSCS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
4.一种制备三萜化合物的方法，包括如下步骤1)将OsOSCS蛋白的编码基因导入目的植物得到转基因植物，2)提取步骤1)得到转基因植物的叶片，收集提取产物，即得到三萜化合物； 所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物；步骤2、中，所述提取步骤1)得到转基因植物的叶片的方法包括如下步骤A、用裂解液裂解所述转基因植物的叶片，得到裂解产物、过滤，收集滤液；B、将步骤A得到的滤液用等体积正己烷萃取，收集正己烷层，再用等体积饱和Nacl水溶液洗涤，收集正己烷层，即得到三萜化合物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述OsOSCS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中得序列1 ； 所述重组载体为将所述OsOSCS蛋白的编码基因插入表达载体pH7WG2D，l，得到表达所述蛋白的载体；步骤幻中，所述裂解液按照如下方法制备将Κ0Η、乙醇和水混合，得到裂解液，所述 KOH在所述裂解液中的浓度为10% (质量百分含量)，所述乙醇在所述裂解液中的浓度为 80% (体积百分含量)；所述裂解液和所述转基因植物的叶片的配比为5L 500g； 所述裂解的温度为80°C，所述裂解的时间为池； 所述三萜化合物的结构式如下式I所示
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物。
8.OsOSCS蛋白在作为三萜化合物合成酶中的应用； 所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2 ；所述三萜化合物的结构式如下式I所示
9.一种重组载体，为将OsOSCS蛋白的编码基因插入表达载体pH7WG2D，1，得到表达所述蛋白的载体。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
全文摘要
本发明公开了一种新的三萜合成酶的功能及应用。本发明提供的0s0SC8蛋白在制备三萜化合物中的应用；所述0s0SC8蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明提供水稻中0s0SC8基因的生化功能为合成(3S，13S)-malabarica-17，21-dien-3β，14-diol，从而证明，0s0SC8基因编码(3S，13S)-malabarica-17，21-dien-3β，14-diol合成酶。
文档编号C12N15/52GK102321696SQ20111024799
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者刘丹, 段礼新, 漆小泉, 薛哲勇 申请人:中国科学院植物研究所