专利名称：一种类芽孢杆菌中性植酸酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种类芽孢杆菌中性植酸酶，特别涉及编码该中性植酸酶的基因序列及氨基酸序列。
背景技术：
植酸酶，又称为肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或盐)的一类酶的总称，能水解植酸最终释放出无机磷。近年来被广泛用于促进单胃动物的生长发育和提高饲料中磷的利用率，其研究对提高畜牧生产效益及降低环境污染有重要意义；在食品中应用植酸酶可以改善铁和锌的吸收，有利于改善人群的营养。目前植酸酶在工业化生产上存在的主要问题是天然材料中表达水平低，不能完全满足饲料加工的要求。通过构建基因工程菌，可实现了植酸酶的高效表达。因此，找到一种新型的植酸酶，并通过基因工程手段克隆该植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达植酸酶基因，可以使植酸酶的制备产业化。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植酸酶基因，将该基因克隆并表达后，可以得到一种类芽孢杆菌中性植酸酶，该酶可以产业化生产，并具有较高的比活力。本发明通过如下工作提供了一种类芽孢杆菌中性植酸酶基因从新疆高温照射环境中取得土壤，并进行微生物富集培养，筛选出可分泌胞外植酸酶的类芽孢杆菌(Paenibacillu sp.)，进行了基因组的提取与鉴定。该菌株16S rRNA的 PCR产物长度约1. 51Λ，测序后与GenBank数据库中DNA序列进行比对，发现该序列与类芽孢杆菌的16s rRNA基因序列相似性达98%。因此，将该菌株在分类学上鉴定为类芽孢杆菌；从Genbank中找到其他类芽孢杆菌植酸酶基因序列，设计简并引物，并从该菌基因组中通过PCR的方法克隆得到一个中性植酸酶基因，命名为phyP。PCR产物经过测序，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，此序列推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；将SEQ ID NO :1所示基因phyP克隆到表达载体pPIC9K，转化到酵母菌GSl 15中。 利用甲醇诱导植酸酶的表达，通过镍柱亲和纯化带有组氨酸标签的植酸酶。通过SDS-PAGE 验证植酸酶纯化情况；对上述植酸酶进行了性质的测定，通过不同温度和不同pH值的处理，得到该酶的最适温度和最适PH值等性质，发现该酶在较广范围内都有活性，而在中性条件下6. 5-7. 5 之间活性最大。经测定，本发明得到的新的植酸酶比活力约为1100U/mg。本发明提供的新的中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO :1所编码的植酸酶蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或其衍生序列。
所述氨基酸序列的衍生序列包括以下情况(a)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有植酸酶功能的多肽；(b)将SEQ ID NO 1所示的核酸分子的简明序列所编码的多肽；(c)在严谨条件下与SEQ ID NO 1所示核酸分子的互补链杂交的核酸所编码的具有植酸酶活性的多肽；(d)由SEQ ID NO 1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽；或(e)与SEQ ID NO :2所示的多肽序列具有至少70%同源性的具有植酸酶活性的多肽，优选75%，80%，85%，90%或95%，特别是99%的同源性。(f)如权利要求的任一项分离的植酸酶，在其下列位置(根据SEQ ID NO :2中的编号方法进行编号)包含一个或多个突变:1，3，4，5，6，7，8，10，11，13，15，16，18，19，41，42， 67，68，69，70，71，72，80，81，82，83，87，88，89，90，92，93，95，96，97，98，99，101，103，104， 106，107，108，109，110，112，113，114，115，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131， 132，136，138，152，153，154，155，156，160，230，231，232，241，246，247，250，251，268，269， 276，277，278，279，283。经实验(见实施例6 8)证实本发明筛选的到得植酸酶在较广范围内都有活性，在中性条件PH值6. 5-7.5之间活性最大。pH 7. 5的条件下，经测定得到的植酸酶比活力约为1100U/mg。本发明提供的上述新的植酸酶基因phyP的用途是，可以用于产业化生产具有较高酶活性的中性植酸酶。如可以通过基因工程手段，包括人工合成该植酸酶基因PhyP或用其它方式克隆该基因，然后在生物反应器中高效表达。
图1 中性植酸酶PHYP的最适pH结果；图2 :pPIC9K-phyP 的质粒图谱。序列信息编码类芽孢杆菌的中性植酸酶成熟蛋白质的DNA序列SEQ ID NO=I ；类芽孢杆菌的中性植酸酶成熟蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO :2。
具体实施例方式以下实施例中所用的材料和试剂来源如下菌株与载体大肠杆菌菌株E. coli BL21 (DE3)购自Novagen公司，载体由本研究构建并保存。巴斯德毕氏酵母GSl 15和表达载体pPIC9K购自invitrogen公司。酶与试剂盒限制性内切酶，连接酶，Taq酶为NEB公司产品。基因组提取试剂盒为Omega公司产品。生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成为ABI公司Cyclone DNA 合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸酶钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。NTA树脂为Qiagen公司产品。
培养基大肠杆菌LB培养基为蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH 7.0。 巴斯德毕氏酵母YPD培养基为2%蛋白胨、酵母提取物、2%葡萄糖，pH 7.0。富集培养为植酸钠1%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.3%，NaCl 0. 5%,pH6.0o筛选培养基为植酸钠1%， NaN03 0. 3%, MgS04 0. 5%, KCl 0. 5%, K2HP04 0· 1 %，FeS04 · 7H200. 001 %，琼月旨 1 %， ρΗ6· 0。实施例1产植酸酶的类芽孢杆菌的筛选从新疆高温照射环境中取得土壤进行微生物富集培养。称取Ig 土壤放入富集培养基中，37°C，200r/min，培养6天。每日吸取少量培养液进行梯度稀释(10_2 10_1(1)，涂布于含有植酸钠的筛选固体培养基中，37°C恒温培养3天。待长出菌落后反复划线分离，选取得到可水解植酸钠且水解圈较大的菌落。实施例2类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)基因组的提取与鉴定将实施例1中选取的培养基中的菌落，挑取单菌落放入LB液体培养基中培养，取菌液用于该菌的基因组DNA的提取。使用Omega公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，按公司提供的试剂盒操作说明书提取该菌的基因组DNA。为了鉴定菌属，以基因组DNA为模板， 进行聚合酶链式反应(PCR)扩增该菌株的16s rRNA基因序列。设计细菌16s rRNA 基因序列的引物F 27 5' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3‘R 1492:5, -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3‘PCR产物长度约1. 5kb，测序后与GenBank数据库中DNA序列进行比对，发现该序列与类芽孢杆菌的16s rRNA基因序列相似性达98%，因此，将该菌株在分类学上鉴定为类芽孢杆菌属。实施例3类芽孢杆菌基因组中植酸酶基因的克隆从Genbank中找到其他类芽孢杆菌关于植酸酶基因序列，设计简并引物，如下phyP F(EcoR I) 5' -GAATTCTTGGTTAAGTTGGAAAACGG-3‘
phyP R(Not I) 5' -GCGGCCGCTCTTGGAGACAACTTTCTTG-3‘下划线部分为EcoR I (上游引物F)和Not I (下游引物R)识别位点。PCR产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳后，观察长度约为1. 3kb。运用T4DNA连接酶连接到T-载体上(pGEM-T vector, Promega公司)。经过测序，得到序列推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。实施例4类芽孢杆菌中植酸酶基因的酵母转化及筛选表达连接T-载体的植酸酶DNA片段经过限制性核酸内切酶NotI和EcoRI消化，通过浓度为0. 8%的琼脂糖凝胶电泳纯化后，将线性化的植酸酶基因切割下来，使用DNA回收试剂盒(Tiangen)回收线性化的植酸酶DNA ；将载体质粒pPIC9K用限制性核酸内切酶Not I和EcoR I消化，运用浓度为0. 8%的琼脂糖凝胶电泳纯化后，将线性化的载体片段切割下来，使用DNA回收试剂盒(Tiangen)回收线性化的载体质粒片段pPIC9K。用T4 DNA连接酶把两段纯化的DNA片段连接起来，转化大肠杆菌JM109。新构建的表达载体命名为 pPIC9K-phyP (图2)。之后提取质粒，使用限制性核酸内切酶DraI将质粒线性化。后悬浮于100μ 1电转感受态毕赤酵母GS115细胞中，将混悬液转移到0. Icm的电穿孔杯(BioRad) 中，使用Gene Pulser Xcell(BioRad)装置，1800V、25 μ F和200 Ω进行电激。电激后立即加入Iml的lmol/L的山梨醇，随后涂布与含组氨酸缺陷的MM培养基平板上，30°C培养2天。PCR筛选含有phyP基因的转化子。将活化的pPIC9K-phyP菌液Iml加入到100ml LB培养基中，37°C使菌液浓度达 OD600 = 0. 6-0. 8时进行甲醇诱导。30°C摇床(200rpm)用10ml/L的甲醇诱导，每12小时向培养基中添加一次甲醇，共诱导2天。由于植酸酶在酵母菌中的异源表达能有效地分泌到胞外，因此诱导后的菌液，经离心得到上清即是植酸酶的粗酶液。实施例5来自类芽孢杆菌中重组植酸酶的纯化将实施例4中得到的粗酶液，用Tris碱将粗酶液的上清pH调节到7 9。将上清通过PH 7. 9平衡的Ni-NTA层析柱子，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。层析用5倍NTA体积的NTA-O Buffer洗，流速控制在 30ml/ 小时左右。分别用 5 倍 NTA 体积的 NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100， NTA-200 Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。 通过SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。将纯化得到的植酸酶蛋白收集，低温存放。实施例6类芽孢杆菌中异源表达的植酸酶酶活测定1、测定对象、目的将实施例5得到的纯化酶液(取自有重组植酸酶的收集管中)用于测定植酸酶酶活；2、方法酶液上清用缓冲液(50mMTris_HCl，2mM CaC12，10% 甘油，ρΗ7· 0)稀释 1000 倍后，取0. Iml酶液加入0. 9ml 0. 25mol/L乙酸缓冲液混合，37 V保温5min，后加入 2ml7. 5mmol/L 植酸钠溶液(IOOmM Tris-HCl, pH7. 0,0. 2mM CaC12)，37°C保温 30min。加入2ml颜色终止液终止酶活反应，终止液为33%的硝酸溶液100g/L钼酸铵溶液2.35g/L钒酸铵溶液体积比为2 1 1的混合液。反应后的溶液在室温下静置10 分钟；以4000rpm转速离心10分钟，测定上清液在415nm波长处的吸光值。同时，取 0. Iml纯化酶液加入0. 9ml 0. 25mol/L乙酸缓冲液混合，先加入2ml颜色终止液，混勻，后加入 2ml 7. 5mmol/L 植酸钠溶液(IOOmM Tris-HCl, pH7. 0,0. 2mM CaC12)，37°C保温 30min 后，以该溶液为空白调零使用；使用分光光度计测定样品在415nm波长处的吸光值，计算植酸酶的活性。3、测定结果该重组植酸酶的活力约为966U/ml。酶活性单位(U)定义为上述条件下，每分钟释放Inmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位。实施例7来自类芽孢杆菌重组植酸酶的最适pH条件测定目的研究类芽孢杆菌中植酸酶的活性对pH的依赖性；方法按照实施例6测定酶活性的方法，分别在pH值为2. 5,3. 5,4. 5,5. 5,6. 5、 7. 5,8. 5,9. 5缓冲液的条件下，测定实施例5得到的植酸酶酶液中植酸酶的活性；结果类芽孢杆菌重组植酸酶在较广范围内都有活性，而在中性条件下pH值 6. 5-7. 5之间活性最高(图1)；
实施例8来自类芽孢杆菌中重组植酸酶PHYP的比活测定方法用实施例5的纯化制备物来评估PHYP植酸酶的比活。使用考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度。操作过程取实施例5植酸酶蛋白0. 5ml直接置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇勻后，取0. Iml加入考马斯亮蓝G250试剂5. Oml (考马斯亮兰0. 25g，甲醇225ml, 冰醋酸46ml，蒸馏水225ml)，充分振荡混合，放置5min后，使用分光光度计在595nm波长处测定样品的吸光值，计算植酸酶蛋白浓度。结果测定的植酸酶蛋白浓度为0. 87mg/ml。因此计算得出来自类芽孢杆菌的重组植酸酶的比活力约为966 + 0. 87 = 1110U/mg。
权利要求
1.一种类芽孢杆菌中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.—种由SEQ ID NO :1所编码的中性植酸酶蛋白，具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或其衍生序列。
3.权利要求2所述的中性植酸酶蛋白，所述衍生序列包括(a)将SEQID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有中性植酸酶功能的多肽；(b)将SEQID NO 1所示的核酸的简明序列所编码的多肽；(c)在严谨条件下与SEQID NO :1所示核酸分子的互补链杂交的核酸所编码的具有植酸酶活性的多肽；(d)由SEQID NO :1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽；
4.一种中性植酸酶蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO :2所示序列的同源性达70%以上。
5.权利要求2 4中任一所述的中性植酸酶蛋白，其氨基酸序列具有一个或多个突变， 所述突变氨基酸的位置选自SEQ ID N0:2中以下编号的一个或多个1、3、4、5、6、7、8、10、 11、13、15、16、18、19、41、42、67、68、69、70、71、72、80、81、82、83、87、88、89、90、92、93、95、 96、97、98、99、101、103、104、106、107、108、109、110、112、113、114、115、122、123、124、125、 126、127、128、129、130、131、132、136、138、152、153、154、155、156、160、230、231、232、241、 246、247、250、251、268、269、276、277、278、279 或 283。
6.一种重组表达载体，其特征是含有SEQ ID NO :1所示序列的基因。
7.权利要求6所述的载体，是pPIC9K-phyP。
8.权利要求6或7所述的载体，其宿主细胞为GS115。
全文摘要
本发明从类芽孢杆菌中得到了一种中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。利用该基因可以生产具有较高酶活性的中性植酸酶。
文档编号C12R1/84GK102286503SQ20111026033
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者平淑珍, 林敏 , 燕永亮, 赵仲麟, 陆伟 申请人:中国农业科学院生物技术研究所