一种假病毒载体及其制备方法和应用的制作方法
专利名称：一种假病毒载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，涉及ー种动物病原微生物假病毒载体的制备方法及其应用。
背景技术：
二十世纪末，Pasloske等人提出了一种新的RNA质控品制备技木，即装甲 RNA (Armorea RNA)技术(Pas丄osKe B L, et al. Armored RNAtechnology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J]. J Clin Microbiol, 1998,36(12) :3590-3594 ；W alker Peach C R, et al. Ribonuclease resistant RNA controls (Armored RNA)for reverse transcription-PCR,branched DNA, and genotyping assays for hepatitis C virus [J]. Clin Chem，1999，45 (12) :2079-2085)。该技术解决了传统RNA质控品存在的问题(或者稳定性差，或存在生物传染隐患，或达不到监测核酸提取及反转录过程的目的等)。装甲RNA技术的原理是将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白基因的序列及外源基因克隆到表达载体中，这ー载体能够将外源基因转录成RNA，并利用载体上MS2的外壳蛋白编码基因组装的外壳蛋白将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，我们称之为装甲RNA假病毒颗粒。目前构建假病毒颗粒的常用假病毒载体主要由可以编码MS2噬菌体外壳蛋白的基因序列和具有高效表达的表达载体組成。MS2噬菌体是单链正性RNA病毒，为^nm长的 20面体，包含有3个基因，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白4种蛋白质分子。噬菌体由180个外壳蛋白単体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA組成。每个 MS2噬菌体是含有180个拷贝的外壳蛋白，一拷贝的成熟酶蛋白，包裏一分子RNA的正二十面体(贾盘兴.噬菌体分子生物学-基木知识和技能[M].北京科学出版社，2001，2-5)。 在早期噬菌体的研究中发现，噬菌体复制酶基因的5’端有ー个约21个核苷酸組成的茎-环区域(操纵子或Pac位点)，噬菌体外壳蛋白的ニ聚体与这个茎环结构的结合不但引发了外壳蛋白本身的组装，而且还引发了外壳蛋白包裹整个噬菌体基因组RNA的过程(Peabody DS. The RNAbinding site of bacteriophage MS2 coat protein. EMBO J,1993,12(2) 595-600 ；Peabody DS. Role of the coat protein-RNA interaction in the life cycle of bacteriophage MS2. Mol Gen Genet, 1997,254(4) :358-364)。MS2 噬菌体成熟酶蛋白可与噬菌体RNA的两个位点发生作用。这种相互作用不是噬菌体包装过程所必须的，但是在噬菌体颗粒中这种相互作用可以用来保护基因组RNA不被广泛存在的核糖核酸酶消化 (Shiba T,Suzuki Y. Localization of A protein in the RNA-Aprotein complex of RNA phage MS2. Biochim Biophys Acta. 1981,654(2) :249-255.)研究表明 MS2 噬菌体成熟酶蛋白对噬菌体外壳的包装起重要作用(Kuzmanovic DA, Elashvili 1，Wick C, et al. The MS2しoat Protein bne11 is Likely assembled Under fension :a novel role ior the MS2 Bacteriophage A Protein as revealed by small-angle neutron scattering[J]. J Mol Biol, 2006, 355 (5) :1095-1111)。裂解蛋白和复制酶蛋白不是噬菌体颗粒的组成部
3分。裂解蛋白的作用是裂解大肠杆菌细胞从而释放出病毒颗粒。复制酶蛋白的作用是与其它3个大肠杆菌宿主蛋白組成ー个蛋白复合体，这个蛋白复合体负责基因组RNA的复制和合成。在MS2噬菌体外壳蛋白的研究中发现外壳蛋白与噬菌体复制酶5'端由19个碱基(19mer)組成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时又将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装。因此，如果将外源基因克隆于MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达过程中噬菌体外壳蛋白得以表达并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。由于单独表达的外壳蛋白组装过程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5'非编码序列相应的cDNA序列都连接到表达载体启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的假病毒颗粒外壳，并具有耐 RNase作用的特性。在假病毒颗粒制备技术中，目前存在的最大问题是纯化问题以及含有假病毒颗粒溶液的纯度问题。传统方法一般如下操作含有外源基因的重组体成功构建后进行诱导表达，然后破碎細胞，双酶(DNaseI和RNase A)消化，再按照噬菌体纯化方法进行纯化盐沉淀，梯度离心回收假病毒颗粒。这种方法操作繁琐，对设备要求高(需要高速低温离心机)， 更关键的是梯度离心回收的含有假病毒颗粒的溶液中仍然存在一定量的核酸，并且残余核酸在PCR鉴定含有假病毒颗粒溶液的纯度过程中很容易使PCR产生假阳性，更进一歩影响到假病毒颗粒定量的研究。虽然有些研究人员在纯化的含有假病毒颗粒溶液提取RNA 后，再进行DNase I酶消化，以去除残存核酸干扰，但这样会造成制备的RNA损失很大，同样造成下一歩定量不精确。
发明内容
本发明的目的是提供ー种假病毒载体pTrcMS。本发明的另一目的是提供制备假病毒载体pTrcMS的方法和应用。所述的假病毒载体包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体 (NC_001417)成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体ー个末端的多克隆位点序列。其中，突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签(CATCACCATCACCATCAC)得到的。所述的出发载体为pTrcHis2A载体。本发明提供的假病毒载体为pTrcMS，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。假病毒载体pTrcMS结构图见图1。本发明提供了ー种假病毒载体pTrcMS的构建方法，包括以下步骤1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体 MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因编码序列，得到前假病毒载体 pTrcHis-MS2 ；
2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15_16个氨基酸之间插入6His序列，构建得到假病毒载体；3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。具体地，上述步骤2)是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrCHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为:5X Prime STAR Buffer (Mg2+ plus) IOul，prime STAR HS DNAPolymerase 1.3U，dNTP Mixture 2. 5mM) 4ul, primerl (lOpmol/ul) lul, primer2 (lOpmol/ul) Iul, pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补ddH20至50ul。PCR扩增的循环程序为98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸lOmin，回收纯化扩增产物；用XhoI 和 Hind III 双酶切前假病毒载体 pTrcHis_MS2 ；采用 In- Fusion HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis_MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR 鉴定 G^rimer-Ul :5’ -GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll 5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，获得阳性质粒 pTrcMS ；pTrcMS 重组菌采用 IPTG 诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入細胞裂解液i^ast Break CellLysis Reagent(IOX)破碎細胞，离心收集上清，采用MagneHis Protein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。本发明提供了含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5’ -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。本发明提供了ー种假病毒载体的构建方法，包括以下步骤1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因片段，得到前假病毒载体 pTrcHis-MS2 ；2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15_16个氨基酸之间插入6His序列，具体是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrCHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，其核苷酸序列为Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R 5' -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，；分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为5 X Prime STAR Buffer(Mg2+plus) IOul, Prime STAR HS DNA Polymerasel. 3U, dNTP Mixture (各 2. 5mM)4ul, primerl(lOpmol/ul)lul, primer2(lOpmol/ul)lul, pTrcHis-MS2DNA 10ng，补 ddH20至50ul。PCR扩增的循环程序为98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸lOmin，回收纯化扩增产物；用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis_MS2 ；采用In- Fusion HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR 鉴定，鉴定用引物为(Primer-Ul :5，-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll 5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，获得阳性质粒 pTrcMS ；pTrcMS 重组菌采用 IPTG 诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入細胞裂解液i^ast Break Cell Lysis Reagent(IOX)破碎細胞，离心收集上清，采用MagneHis Protein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。本发明提供的假病毒载体的构建方法，还包括将步骤幻获得的假病毒载体 pTrcMS用His柱进行纯化。本发明提供了ー种假病毒颗粒，含有假病毒载体pTrcMS及其携帯有外源基因的噬菌体基因組。本发明提供了ー种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于假病毒载体pTrcMS中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。本发明提供了假病毒载体pTrcMS或假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品中的应用。假病毒颗粒主要作为參比物质，应用于各类动物病原微生物核酸和血清学检测技木。因此本发明还提供了假病毒载体PTrcMS或假病毒颗粒在制备动物病原微生物检测试剂中的应用。本发明提供的假病毒载体pTrcMS用于制备假病毒颗粒可以大大减少假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。本发明制备的假病毒颗粒，具有以下特点(1)易纯化。由于假病毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用His纯化蛋白方法捕获假病毒颗粒，可以大大减少假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。(2)耐核酸酶，稳定性好，易保存和运输。由于基因组RNA包裹在假病毒载体的外壳蛋白内，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。因此，假病毒稳定性良好，在室温条件下可以保存至少30d，4°C可以保存更长时间，从而解决了 RNA质控品在使用、保存和运输中的稳定性问题。(3)无生物传染性，安全。与自然源性病毒相比，假病毒颗粒整合了其他病毒的外壳蛋白，而且核酸分子上编码外壳蛋白的基因被修饰棹，所以这种病毒丧失了病毒的自我复制能力，只能进行“一个细胞周期”的侵染，从而得到的假病毒颗粒无传染性，不会对实验人员造成伤害，也不会对环境造成污染。(4)全程监控核酸制备及鉴定过程。假病毒颗粒的RNA-蛋白复合体的结构与天然病毒相似，即都是外壳蛋白包裏核酸，因此可以把假病毒颗粒视为病毒材料对待，必须经过RNA提取、反转录后才可用于PCR扩增，从而对RNA病毒的检测进行全程监控，保证试验数据的可靠性。
图1显示的是假病毒载体pTrcMS结构图谱；图2显示的是假病毒载体pTrcMS纯化效果，图中1为RT-PCR鉴定結果，2为PCR鉴定結果，3为阴性对照，M为Marker2000 ；图3显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP对温度的敏感性试验結果。其中1为空白对照，2-6 分别为 56 °C /ld、37°C /20d、室温/30d、4°C /30d、-20 °C /60d 保存条件下，样本 RT-PCR 鉴定结果，M 为 Marker2000 ；图4显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP对RNase A的稳定性试验結果。图中1为阴性对照，2-6分别为RNase A 1 μ g、2 μ g、3 μ g、4 μ g、0 μ g样本处理后RT-PCR鉴定结果，M 为 Marker2000 ；图5显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP的电镜观察图。(80000 X JEM1400)。
具体实施例方式以下实施例进ー步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特別指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 实施例中所用的生化试剂均为市售购买得到。实施例1前假病毒载体pTrcHis-MS2构建1)提取MS2噬菌体(ATCC 15597-B1，购买自美国ATCC) RNA，參考ー步法one step RT-PCR kit进行RT-PCR扩增，PCR产物回收纯化连入pGEM-T Easy Vector,构建MS2-T质粒。MS2-T质粒(本实验室保存)和表达载体pTrcHis2A(购自hvitrogen公司)分别进行 NcoI 和 BglII 双酶切，酶切体系如下Ncol/Bglll 10U, IOXK buffer 2ul,0. 1% BSA 2ul，模板lyg，补水至20ul。37°C池。分别将酶切产物进行胶回收纯化，产物分別命名为 MS2-T (N/B)、pTrcHis2A (Ν/Β)。2)将酶切产物用Τ4 DNA连接酶连接，连接体系如下10 X buffer lul，T4DNA酶 0. 5ul, pTrcHis2A (N/B)50ng, MS2-T (N/B) 120ng，25°C，lOmin，然后立即放冰上。3)将连接产物进行转化，挑取单克隆摇菌、测序。测序正确的菌株命名为 pTrcHis-MS20 实施例2假病毒载体pTrcMS构建利用基因插入的方法，在pTrcHis-MS2载体上MS2中外壳蛋白基因编码序列的 15-16个氨基酸之间插入6His序列，得到假病毒载体pTrcMS，其具体构建方法如下①在PCR引物中引入突变的碱基，以前假病毒载体pTrCHis-MS2为模板，分別以 Primerl 和 Primer2 为引物对，用Primer STAR HS DNAPolymerase 分别进行 PCR 扩增，扩增产物命名为PCR产物I、II。其中，PCR扩增引物为Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5，-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。50ul PCR 扩增的反应体系为:5 χ Prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 1 Ou 1, Prime STAR HS DNA Polymerase 1. 3U, dNTP Mixture 2. 5mM) 4ul, primerl (lOpmol/ul) lul, primer2(10pmol/ul) Iul, pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补 ddH20 至 50ul。PCR 扩增的循环程序
7为98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸IOmin0扩增产物纯化
回收，保存备用。②pTrcHis-MS2 质粒采用 XhoI 和 HindIII 双酶切，体系如下XhoI/HindIII 10U,IOXM buffer 5ul，模板1 μ g，补水至50ul。37°C池。分别将酶切产物进行胶回收纯化，命名为 Vector DNA。③使用Fusion HD Cloning Kit(Clontech Code No. 639648)，将PCR产物 I、PCR产物II和Vector DNA连接，反应体系及条件如下PCR产物I 50ng，PCR产物II 50ng,Vector DNA 300ng，5 X In—Fusion HD Enzyme Premix 2ul，补水至 10ul。50°C 15min。④取上述h-Fusion 产物 2. 5ul 热转化至 E. coli Competent Cel 1JM109 (CodeNo. D9052)，37 °C过夜培养，挑取阳性菌落进行测序鉴定，鉴定用引物为(ft~imer-Ul 5，-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll :5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，将测序正确的质粒命名为pTrcMS。⑤假病毒载体菌体采用IPTG(终浓度为lmol/L)诱导表达16h，5000rpm，离心lOmin，收集菌体。⑥产物沉淀加入细胞裂解液Fast Break Cell Lysis Reagent (10X) IOul/ml菌体沉淀，涡旋混勻，室温消化30min。4 °C，13000rpm,离心15min。上清加入MagneHis Ni-Particles 10ul/ml菌体，室温结合30min。溶液放置磁力架上，吸附2min，除去上清，加入200ulMagneHiSTM Bingding/ffash Buffer，颠倒混勻，放置磁力架上吸附，除去上清。将上述MagneHis Ni-Particles重复洗涤。洗涤的MagneHis Ni-Particles加入Elution Buffer 10ul/ml菌体，颠倒混勻，室温作用30min，放置磁力架上吸附，回收上清，即为纯化后的假病毒载体PTrcMS。假病毒载体核苷酸序列见SEQ ID No. 1所示。其中lbp_410bp为p^TrcHisZA载体前半部分基因序列，190bp-382bp为启动子区域，411bp-416bp为NcoI酶切位点，1713bp-1730bp 为突变序列(插入的 6His 标签)，2141bp_2146bp 为 Bglll，2172bp_2177bp为HindIII，2178bp-6119bp区域为pTrcHis2A载体后半部分基因序列，2!352bp-2508bp区域为pTrcHis2A载体终止子区域，2473bp_2516bp区域为pTrcHis2A载体终止子rrnB_Tl，2648bp-2676bp 区域为 pTrcHis2A 载体终止子 rrnB_T2。⑦回收的假病毒载体分别进行PCR和RT-PCR鉴定，以判定假病毒载体的纯度，即是否溶液中存在残余的基因组DNA。纯化产物作为RT-PCR反应模板，其中一组不经过反转录直接进行PCR鉴定，检测结果为阴性，表明制备的假病毒颗粒溶液中，无基因组DNA污染。另一组样本提取RNA后进行RT-PCR鉴定，检测结果呈阳性，表明溶液中含有假病毒颗粒(见图2)。实施例3尼帕(NP)假病毒颗粒的研制1.构建 pTrcMS-NP 质粒pGEM-T-NP质粒与实施例2制备的pTrcMS质粒分别进行pstl和Hindi11双酶切，胶回收纯化，连接，测序，构建PTrcMS-NP。具体方法参照实施例1前假病毒载体pTrcHis-MS2的构建方法。2. pTrcMS-NP假病毒颗粒的纯化制备将pTrcMS-NP重组菌进行诱导表达，表达产物处理同实施例2，回收的假病毒颗粒分别进行PCR和RT-PCR鉴定。PCR鉴定产物电泳显示无目的条带，RT-PCR鉴定产物电泳显示存在明显目的条带，表明该溶液中含有尼帕假病毒颗粒，并且无DNA污染。
实施例4pTrcMS_NP假病毒假病毒颗粒特性鉴定将实施例3获得的纯化的假病毒颗粒进行特性鉴定。主要从温度敏感性、RNaseA攻击和形态观察三方面进行鉴定。PCR鉴定引物分别为I^rimer-NPF :5’ -AACTGCAGACAAGCAATGGAGCCGGAC-3，；Primer-NPR 5' CCCAAGCTTCTCCCTGTATTGTCAATGAAG-3。PCR 产物目的片段大小为450bp。1)纯化后的假病毒颗粒温度敏感性试验将50ul/管纯化的假病毒载体溶液分别放置于56°C /ld、37°C /20d、常温/30d、4°C /30d、-20°C /60d，进行样品处理后RT-PCR鉴定。2)稳定性试验(RNase A攻击试验)将50ul/管的假病毒颗粒溶液中分别加入RNase A(lmg/mL) 1 μ 1/2 μ 1/3 μ 1/4 μ 1后，放入37°C，30min,对照组不加RNaseA0所有样品均进行RNA抽提，进行RT-PCR鉴定。3)形态观察纯化后的假病毒颗粒溶液先进行醋酸双氧铀染色，然后自然干燥，最后透射电子显微镜进行形态观察。经实验结果表明，含假病毒颗粒的溶液在37°C情况下至少可以保存20天，随着保存温度降低，保存时间越长。由此可以看出，该假病毒颗粒具有良好的稳定性，结果见图3。用RNaseA处理的假病毒颗粒溶液与对照组样品分别RT-PCR鉴定，检测结果一致，表明制备的假病毒颗粒能够抵抗RNaseA的降解见图4。经电镜观察，看到直径大约为^nm的多边形颗粒，如图5，即诱导表达的假病毒颗粒。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
11.ー种假病毒载体，其特征在干，包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体ー个末端的多克隆位点序列。
2.如权利要求1所述的假病毒载体，其特征在干，所述的突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签，核苷酸序列为CATCACCATCACCATCAC。
3.如权利要求1或2所述的假病毒载体，所述的出发载体为pTrCHis2A。
4.如权利要求3所述的假病毒载体，其为pTrcMS，核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
5.一种权利要求4所述假病毒载体的构建方法，其特征在干，包括以下步骤1)在pTrcHis2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的基因片段，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2 ；2)通过基因插入方法将载体pTrCHis-MS2中外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间插入Mlis序列，构建得到假病毒载体；3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在干，所述步骤2)是以前假病毒载体 pTrCHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，回收纯化扩增产物；用》ιοΙ和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2 ；两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrCHis-MS2连接，转化受体菌，经筛选，诱导表达，鉴定得到假病毒载体 PTrcMS0
7.如权利要求6所述的方法，其特征在干，所述的含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为Primerl-F :5’ -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F :5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5’ -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。
8.ー种假病毒颗粒，其特征在干，含有权利要求4所述假病毒载体pTrcMS及其携帯有外源基因的噬菌体基因組。
9.ー种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于权利要求4所述假病毒载体PTrcMS中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。
10.权利要求4所述的假病毒载体或权利要求8所述的假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品的应用。
全文摘要
本发明公开了一种动物病原微生物假病毒载体及其制备技术。本发明将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5′非编码序列相应的cDNA序列连接到pTrcHis2A载体启动子的下游，构建了前假病毒载体。然后通过基因插入方法，将MS2噬菌体中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间加入6His纯化标签，这样含外源基因的假病毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用纯化蛋白方法捕获假病毒颗粒，可以减化假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。本发明假病毒载体为pTrcMS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
文档编号C12N15/70GK102559731SQ20111044502
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者吴绍强, 林祥梅, 王彩霞, 邓俊花 申请人:中国检验检疫科学研究院
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，涉及ー种动物病原微生物假病毒载体的制备方法及其应用。
背景技术：
二十世纪末，Pasloske等人提出了一种新的RNA质控品制备技木，即装甲 RNA (Armorea RNA)技术(Pas丄osKe B L, et al. Armored RNAtechnology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J]. J Clin Microbiol, 1998,36(12) :3590-3594 ；W alker Peach C R, et al. Ribonuclease resistant RNA controls (Armored RNA)for reverse transcription-PCR,branched DNA, and genotyping assays for hepatitis C virus [J]. Clin Chem，1999，45 (12) :2079-2085)。该技术解决了传统RNA质控品存在的问题(或者稳定性差，或存在生物传染隐患，或达不到监测核酸提取及反转录过程的目的等)。装甲RNA技术的原理是将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白基因的序列及外源基因克隆到表达载体中，这ー载体能够将外源基因转录成RNA，并利用载体上MS2的外壳蛋白编码基因组装的外壳蛋白将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，我们称之为装甲RNA假病毒颗粒。目前构建假病毒颗粒的常用假病毒载体主要由可以编码MS2噬菌体外壳蛋白的基因序列和具有高效表达的表达载体組成。MS2噬菌体是单链正性RNA病毒，为^nm长的 20面体，包含有3个基因，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白4种蛋白质分子。噬菌体由180个外壳蛋白単体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA組成。每个 MS2噬菌体是含有180个拷贝的外壳蛋白，一拷贝的成熟酶蛋白，包裏一分子RNA的正二十面体(贾盘兴.噬菌体分子生物学-基木知识和技能[M].北京科学出版社，2001，2-5)。 在早期噬菌体的研究中发现，噬菌体复制酶基因的5’端有ー个约21个核苷酸組成的茎-环区域(操纵子或Pac位点)，噬菌体外壳蛋白的ニ聚体与这个茎环结构的结合不但引发了外壳蛋白本身的组装，而且还引发了外壳蛋白包裹整个噬菌体基因组RNA的过程(Peabody DS. The RNAbinding site of bacteriophage MS2 coat protein. EMBO J,1993,12(2) 595-600 ；Peabody DS. Role of the coat protein-RNA interaction in the life cycle of bacteriophage MS2. Mol Gen Genet, 1997,254(4) :358-364)。MS2 噬菌体成熟酶蛋白可与噬菌体RNA的两个位点发生作用。这种相互作用不是噬菌体包装过程所必须的，但是在噬菌体颗粒中这种相互作用可以用来保护基因组RNA不被广泛存在的核糖核酸酶消化 (Shiba T,Suzuki Y. Localization of A protein in the RNA-Aprotein complex of RNA phage MS2. Biochim Biophys Acta. 1981,654(2) :249-255.)研究表明 MS2 噬菌体成熟酶蛋白对噬菌体外壳的包装起重要作用(Kuzmanovic DA, Elashvili 1，Wick C, et al. The MS2しoat Protein bne11 is Likely assembled Under fension :a novel role ior the MS2 Bacteriophage A Protein as revealed by small-angle neutron scattering[J]. J Mol Biol, 2006, 355 (5) :1095-1111)。裂解蛋白和复制酶蛋白不是噬菌体颗粒的组成部
3分。裂解蛋白的作用是裂解大肠杆菌细胞从而释放出病毒颗粒。复制酶蛋白的作用是与其它3个大肠杆菌宿主蛋白組成ー个蛋白复合体，这个蛋白复合体负责基因组RNA的复制和合成。在MS2噬菌体外壳蛋白的研究中发现外壳蛋白与噬菌体复制酶5'端由19个碱基(19mer)組成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时又将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装。因此，如果将外源基因克隆于MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达过程中噬菌体外壳蛋白得以表达并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。由于单独表达的外壳蛋白组装过程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5'非编码序列相应的cDNA序列都连接到表达载体启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的假病毒颗粒外壳，并具有耐 RNase作用的特性。在假病毒颗粒制备技术中，目前存在的最大问题是纯化问题以及含有假病毒颗粒溶液的纯度问题。传统方法一般如下操作含有外源基因的重组体成功构建后进行诱导表达，然后破碎細胞，双酶(DNaseI和RNase A)消化，再按照噬菌体纯化方法进行纯化盐沉淀，梯度离心回收假病毒颗粒。这种方法操作繁琐，对设备要求高(需要高速低温离心机)， 更关键的是梯度离心回收的含有假病毒颗粒的溶液中仍然存在一定量的核酸，并且残余核酸在PCR鉴定含有假病毒颗粒溶液的纯度过程中很容易使PCR产生假阳性，更进一歩影响到假病毒颗粒定量的研究。虽然有些研究人员在纯化的含有假病毒颗粒溶液提取RNA 后，再进行DNase I酶消化，以去除残存核酸干扰，但这样会造成制备的RNA损失很大，同样造成下一歩定量不精确。
发明内容
本发明的目的是提供ー种假病毒载体pTrcMS。本发明的另一目的是提供制备假病毒载体pTrcMS的方法和应用。所述的假病毒载体包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体 (NC_001417)成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体ー个末端的多克隆位点序列。其中，突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签(CATCACCATCACCATCAC)得到的。所述的出发载体为pTrcHis2A载体。本发明提供的假病毒载体为pTrcMS，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。假病毒载体pTrcMS结构图见图1。本发明提供了ー种假病毒载体pTrcMS的构建方法，包括以下步骤1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体 MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因编码序列，得到前假病毒载体 pTrcHis-MS2 ；
2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15_16个氨基酸之间插入6His序列，构建得到假病毒载体；3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。具体地，上述步骤2)是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrCHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为:5X Prime STAR Buffer (Mg2+ plus) IOul，prime STAR HS DNAPolymerase 1.3U，dNTP Mixture 2. 5mM) 4ul, primerl (lOpmol/ul) lul, primer2 (lOpmol/ul) Iul, pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补ddH20至50ul。PCR扩增的循环程序为98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸lOmin，回收纯化扩增产物；用XhoI 和 Hind III 双酶切前假病毒载体 pTrcHis_MS2 ；采用 In- Fusion HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis_MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR 鉴定 G^rimer-Ul :5’ -GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll 5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，获得阳性质粒 pTrcMS ；pTrcMS 重组菌采用 IPTG 诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入細胞裂解液i^ast Break CellLysis Reagent(IOX)破碎細胞，离心收集上清，采用MagneHis Protein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。本发明提供了含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5’ -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。本发明提供了ー种假病毒载体的构建方法，包括以下步骤1)在pTrcHis 2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的成熟酶蛋白、外壳蛋白、部分裂解蛋白和复制酶的基因片段，得到前假病毒载体 pTrcHis-MS2 ；2)通过基因插入方法将载体pTrcHis-MS2中外壳蛋白的第15_16个氨基酸之间插入6His序列，具体是以步骤1)获得的前假病毒载体pTrCHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，其核苷酸序列为Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R 5' -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，；分别进行PCR扩增反应，50ul PCR扩增的反应体系为5 X Prime STAR Buffer(Mg2+plus) IOul, Prime STAR HS DNA Polymerasel. 3U, dNTP Mixture (各 2. 5mM)4ul, primerl(lOpmol/ul)lul, primer2(lOpmol/ul)lul, pTrcHis-MS2DNA 10ng，补 ddH20至50ul。PCR扩增的循环程序为98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸lOmin，回收纯化扩增产物；用XhoI和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis_MS2 ；采用In- Fusion HD Cloning Kit将两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrcHis-MS2连接，转化受体菌，摇菌、PCR 鉴定，鉴定用引物为(Primer-Ul :5，-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll 5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，获得阳性质粒 pTrcMS ；pTrcMS 重组菌采用 IPTG 诱导表达，离心收集菌体。沉淀中加入細胞裂解液i^ast Break Cell Lysis Reagent(IOX)破碎細胞，离心收集上清，采用MagneHis Protein Purification System纯化蛋白方式回收产物，得到假病毒载体pTrcMS。本发明提供的假病毒载体的构建方法，还包括将步骤幻获得的假病毒载体 pTrcMS用His柱进行纯化。本发明提供了ー种假病毒颗粒，含有假病毒载体pTrcMS及其携帯有外源基因的噬菌体基因組。本发明提供了ー种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于假病毒载体pTrcMS中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。本发明提供了假病毒载体pTrcMS或假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品中的应用。假病毒颗粒主要作为參比物质，应用于各类动物病原微生物核酸和血清学检测技木。因此本发明还提供了假病毒载体PTrcMS或假病毒颗粒在制备动物病原微生物检测试剂中的应用。本发明提供的假病毒载体pTrcMS用于制备假病毒颗粒可以大大减少假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。本发明制备的假病毒颗粒，具有以下特点(1)易纯化。由于假病毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用His纯化蛋白方法捕获假病毒颗粒，可以大大减少假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。(2)耐核酸酶，稳定性好，易保存和运输。由于基因组RNA包裹在假病毒载体的外壳蛋白内，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。因此，假病毒稳定性良好，在室温条件下可以保存至少30d，4°C可以保存更长时间，从而解决了 RNA质控品在使用、保存和运输中的稳定性问题。(3)无生物传染性，安全。与自然源性病毒相比，假病毒颗粒整合了其他病毒的外壳蛋白，而且核酸分子上编码外壳蛋白的基因被修饰棹，所以这种病毒丧失了病毒的自我复制能力，只能进行“一个细胞周期”的侵染，从而得到的假病毒颗粒无传染性，不会对实验人员造成伤害，也不会对环境造成污染。(4)全程监控核酸制备及鉴定过程。假病毒颗粒的RNA-蛋白复合体的结构与天然病毒相似，即都是外壳蛋白包裏核酸，因此可以把假病毒颗粒视为病毒材料对待，必须经过RNA提取、反转录后才可用于PCR扩增，从而对RNA病毒的检测进行全程监控，保证试验数据的可靠性。
图1显示的是假病毒载体pTrcMS结构图谱；图2显示的是假病毒载体pTrcMS纯化效果，图中1为RT-PCR鉴定結果，2为PCR鉴定結果，3为阴性对照，M为Marker2000 ；图3显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP对温度的敏感性试验結果。其中1为空白对照，2-6 分别为 56 °C /ld、37°C /20d、室温/30d、4°C /30d、-20 °C /60d 保存条件下，样本 RT-PCR 鉴定结果，M 为 Marker2000 ；图4显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP对RNase A的稳定性试验結果。图中1为阴性对照，2-6分别为RNase A 1 μ g、2 μ g、3 μ g、4 μ g、0 μ g样本处理后RT-PCR鉴定结果，M 为 Marker2000 ；图5显示的是假病毒颗粒pTrcMS-NP的电镜观察图。(80000 X JEM1400)。
具体实施例方式以下实施例进ー步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特別指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 实施例中所用的生化试剂均为市售购买得到。实施例1前假病毒载体pTrcHis-MS2构建1)提取MS2噬菌体(ATCC 15597-B1，购买自美国ATCC) RNA，參考ー步法one step RT-PCR kit进行RT-PCR扩增，PCR产物回收纯化连入pGEM-T Easy Vector,构建MS2-T质粒。MS2-T质粒(本实验室保存)和表达载体pTrcHis2A(购自hvitrogen公司)分别进行 NcoI 和 BglII 双酶切，酶切体系如下Ncol/Bglll 10U, IOXK buffer 2ul,0. 1% BSA 2ul，模板lyg，补水至20ul。37°C池。分别将酶切产物进行胶回收纯化，产物分別命名为 MS2-T (N/B)、pTrcHis2A (Ν/Β)。2)将酶切产物用Τ4 DNA连接酶连接，连接体系如下10 X buffer lul，T4DNA酶 0. 5ul, pTrcHis2A (N/B)50ng, MS2-T (N/B) 120ng，25°C，lOmin，然后立即放冰上。3)将连接产物进行转化，挑取单克隆摇菌、测序。测序正确的菌株命名为 pTrcHis-MS20 实施例2假病毒载体pTrcMS构建利用基因插入的方法，在pTrcHis-MS2载体上MS2中外壳蛋白基因编码序列的 15-16个氨基酸之间插入6His序列，得到假病毒载体pTrcMS，其具体构建方法如下①在PCR引物中引入突变的碱基，以前假病毒载体pTrCHis-MS2为模板，分別以 Primerl 和 Primer2 为引物对，用Primer STAR HS DNAPolymerase 分别进行 PCR 扩增，扩增产物命名为PCR产物I、II。其中，PCR扩增引物为Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5，-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。50ul PCR 扩增的反应体系为:5 χ Prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 1 Ou 1, Prime STAR HS DNA Polymerase 1. 3U, dNTP Mixture 2. 5mM) 4ul, primerl (lOpmol/ul) lul, primer2(10pmol/ul) Iul, pTrcHis-MS2 DNA 10ng，补 ddH20 至 50ul。PCR 扩增的循环程序
7为98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸IOmin0扩增产物纯化
回收，保存备用。②pTrcHis-MS2 质粒采用 XhoI 和 HindIII 双酶切，体系如下XhoI/HindIII 10U,IOXM buffer 5ul，模板1 μ g，补水至50ul。37°C池。分别将酶切产物进行胶回收纯化，命名为 Vector DNA。③使用Fusion HD Cloning Kit(Clontech Code No. 639648)，将PCR产物 I、PCR产物II和Vector DNA连接，反应体系及条件如下PCR产物I 50ng，PCR产物II 50ng,Vector DNA 300ng，5 X In—Fusion HD Enzyme Premix 2ul，补水至 10ul。50°C 15min。④取上述h-Fusion 产物 2. 5ul 热转化至 E. coli Competent Cel 1JM109 (CodeNo. D9052)，37 °C过夜培养，挑取阳性菌落进行测序鉴定，鉴定用引物为(ft~imer-Ul 5，-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll :5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，将测序正确的质粒命名为pTrcMS。⑤假病毒载体菌体采用IPTG(终浓度为lmol/L)诱导表达16h，5000rpm，离心lOmin，收集菌体。⑥产物沉淀加入细胞裂解液Fast Break Cell Lysis Reagent (10X) IOul/ml菌体沉淀，涡旋混勻，室温消化30min。4 °C，13000rpm,离心15min。上清加入MagneHis Ni-Particles 10ul/ml菌体，室温结合30min。溶液放置磁力架上，吸附2min，除去上清，加入200ulMagneHiSTM Bingding/ffash Buffer，颠倒混勻，放置磁力架上吸附，除去上清。将上述MagneHis Ni-Particles重复洗涤。洗涤的MagneHis Ni-Particles加入Elution Buffer 10ul/ml菌体，颠倒混勻，室温作用30min，放置磁力架上吸附，回收上清，即为纯化后的假病毒载体PTrcMS。假病毒载体核苷酸序列见SEQ ID No. 1所示。其中lbp_410bp为p^TrcHisZA载体前半部分基因序列，190bp-382bp为启动子区域，411bp-416bp为NcoI酶切位点，1713bp-1730bp 为突变序列(插入的 6His 标签)，2141bp_2146bp 为 Bglll，2172bp_2177bp为HindIII，2178bp-6119bp区域为pTrcHis2A载体后半部分基因序列，2!352bp-2508bp区域为pTrcHis2A载体终止子区域，2473bp_2516bp区域为pTrcHis2A载体终止子rrnB_Tl，2648bp-2676bp 区域为 pTrcHis2A 载体终止子 rrnB_T2。⑦回收的假病毒载体分别进行PCR和RT-PCR鉴定，以判定假病毒载体的纯度，即是否溶液中存在残余的基因组DNA。纯化产物作为RT-PCR反应模板，其中一组不经过反转录直接进行PCR鉴定，检测结果为阴性，表明制备的假病毒颗粒溶液中，无基因组DNA污染。另一组样本提取RNA后进行RT-PCR鉴定，检测结果呈阳性，表明溶液中含有假病毒颗粒(见图2)。实施例3尼帕(NP)假病毒颗粒的研制1.构建 pTrcMS-NP 质粒pGEM-T-NP质粒与实施例2制备的pTrcMS质粒分别进行pstl和Hindi11双酶切，胶回收纯化，连接，测序，构建PTrcMS-NP。具体方法参照实施例1前假病毒载体pTrcHis-MS2的构建方法。2. pTrcMS-NP假病毒颗粒的纯化制备将pTrcMS-NP重组菌进行诱导表达，表达产物处理同实施例2，回收的假病毒颗粒分别进行PCR和RT-PCR鉴定。PCR鉴定产物电泳显示无目的条带，RT-PCR鉴定产物电泳显示存在明显目的条带，表明该溶液中含有尼帕假病毒颗粒，并且无DNA污染。
实施例4pTrcMS_NP假病毒假病毒颗粒特性鉴定将实施例3获得的纯化的假病毒颗粒进行特性鉴定。主要从温度敏感性、RNaseA攻击和形态观察三方面进行鉴定。PCR鉴定引物分别为I^rimer-NPF :5’ -AACTGCAGACAAGCAATGGAGCCGGAC-3，；Primer-NPR 5' CCCAAGCTTCTCCCTGTATTGTCAATGAAG-3。PCR 产物目的片段大小为450bp。1)纯化后的假病毒颗粒温度敏感性试验将50ul/管纯化的假病毒载体溶液分别放置于56°C /ld、37°C /20d、常温/30d、4°C /30d、-20°C /60d，进行样品处理后RT-PCR鉴定。2)稳定性试验(RNase A攻击试验)将50ul/管的假病毒颗粒溶液中分别加入RNase A(lmg/mL) 1 μ 1/2 μ 1/3 μ 1/4 μ 1后，放入37°C，30min,对照组不加RNaseA0所有样品均进行RNA抽提，进行RT-PCR鉴定。3)形态观察纯化后的假病毒颗粒溶液先进行醋酸双氧铀染色，然后自然干燥，最后透射电子显微镜进行形态观察。经实验结果表明，含假病毒颗粒的溶液在37°C情况下至少可以保存20天，随着保存温度降低，保存时间越长。由此可以看出，该假病毒颗粒具有良好的稳定性，结果见图3。用RNaseA处理的假病毒颗粒溶液与对照组样品分别RT-PCR鉴定，检测结果一致，表明制备的假病毒颗粒能够抵抗RNaseA的降解见图4。经电镜观察，看到直径大约为^nm的多边形颗粒，如图5，即诱导表达的假病毒颗粒。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
11.ー种假病毒载体，其特征在干，包括出发载体的启动子序列和终止子序列，MS2噬菌体成熟酶蛋白基因编码序列、突变的外壳蛋白基因编码序列、部分裂解蛋白和复制酶基因编码序列，出发载体ー个末端的多克隆位点序列。
2.如权利要求1所述的假病毒载体，其特征在干，所述的突变的外壳蛋白基因编码序列是在位于MS2噬菌体的外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间，插入6His标签，核苷酸序列为CATCACCATCACCATCAC。
3.如权利要求1或2所述的假病毒载体，所述的出发载体为pTrCHis2A。
4.如权利要求3所述的假病毒载体，其为pTrcMS，核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
5.一种权利要求4所述假病毒载体的构建方法，其特征在干，包括以下步骤1)在pTrcHis2A载体多克隆位点的NcoI和BglII双酶切位点处插入噬菌体MS2的基因片段，得到前假病毒载体pTrcHis-MS2 ；2)通过基因插入方法将载体pTrCHis-MS2中外壳蛋白基因编码序列的第15-16个氨基酸之间插入Mlis序列，构建得到假病毒载体；3)假病毒载体pTrcMS用His柱进行纯化。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在干，所述步骤2)是以前假病毒载体 pTrCHis-MS2为模板，以两对含有突变基因的PCR引物对为引物，分别进行PCR扩增反应，回收纯化扩增产物；用》ιοΙ和Hind III双酶切前假病毒载体pTrcHis-MS2 ；两次PCR的扩增产物与酶切后的pTrCHis-MS2连接，转化受体菌，经筛选，诱导表达，鉴定得到假病毒载体 PTrcMS0
7.如权利要求6所述的方法，其特征在干，所述的含有突变基因的PCR引物对，其核苷酸序列为Primerl-F :5’ -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F :5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5’ -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。
8.ー种假病毒颗粒，其特征在干，含有权利要求4所述假病毒载体pTrcMS及其携帯有外源基因的噬菌体基因組。
9.ー种假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，将外源基因克隆于权利要求4所述假病毒载体PTrcMS中的MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达噬菌体外壳蛋白并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，得到假病毒颗粒。
10.权利要求4所述的假病毒载体或权利要求8所述的假病毒颗粒在制备检测动物病原微生物质控品的应用。
全文摘要
本发明公开了一种动物病原微生物假病毒载体及其制备技术。本发明将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5′非编码序列相应的cDNA序列连接到pTrcHis2A载体启动子的下游，构建了前假病毒载体。然后通过基因插入方法，将MS2噬菌体中外壳蛋白的第15-16个氨基酸之间加入6His纯化标签，这样含外源基因的假病毒颗粒表达后为RNA-蛋白质复合体，利用纯化蛋白方法捕获假病毒颗粒，可以减化假病毒颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高假病毒颗粒纯化的质量。本发明假病毒载体为pTrcMS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
文档编号C12N15/70GK102559731SQ20111044502
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者吴绍强, 林祥梅, 王彩霞, 邓俊花 申请人:中国检验检疫科学研究院
相关技术
网友询问留言
已有1条留言
-
0访客 来自[未知地区] 2018年12月28日 11:51感谢文章分享的关于假病毒的一些知识，假病毒在血清等物质中可以长期稳定的存在，且易于保存，之前有听过BIOG的假病毒可以在-20保存6个月不降解。
1