专利名称：猪 MLC2 5<sup>，</sup> 侧翼启动子区 SNP 作为猪胴体性状的遗传标记及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪育种与猪的分子标记辅助选择领域，具体涉及一种与猪的胴体性状相关基因MLC25’侧翼启动子片段的克隆及其作为猪胴体性状遗传标记的应用。
背景技术：
人类对畜禽生产性能的选择从无意识到有意识已有几千年的历史，而从表型选择实践到基因型选择理论的探讨仅是近几十年的事情。在对畜禽生产性能进行选择时，主要是依靠对其目标性状的标记，而先前的生化免疫标记和细胞遗传标记检测位点数目有限、多态性贫乏。20世纪80年代以后，分子遗传标记技术的诞生和逐步完善，使动物育种学家们又迅速把具有丰富多态的DNA分子标记应用到动物育种理论中。从而出现了以DNA分子标记技术为主的畜禽经济性状标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)育种。它 借助分子标记来选择数量性状的基因型，同时利用标记信息和个体表型信息，可以更为准确地估计育种值，提高选择效率，大大加快育种进程。DNA分子标记是指能反应生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它能直接反映基因组DNA间的差异。从1974年Grozdicker首创了第一代分子标记至今，DNA分子标记先后产生了三代几十个种类。第一代为RFLP，第二代为SSR、RAPD, AP-PCR、EST等,第三代为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP是由美国麻省理工学院的 Lander ES 于 1996 年提出的(Lander ES. The new genomics globalviews ofbiology. Science. 1996,274:536-539)。SNP 是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。SNP标记在大多数基因组中存在较高的频率、数量丰富，其有望成为最重要最有效的分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区 SNP(coding-region SNP, cSNP)、基因周边 SNP(perigenic SNP, pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP, iSNP)三类。SNP在DNA分子上分布不均匀，在非转录区SNP频率要高于转录区SNP频率，这可能是受进化中选择的压力影响。转录区的SNP —般与蛋白的表达有关，而非转录区的SNP则可以调控基因的表达。所以这两类SNP不仅都可以作为分子标记，还可能与一些动物的生产性状有直接关系。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，位于结构基因5'端上游区，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它。因此，研究功能基因5’侧翼序列启动子中的SNP可能有更重要的生物学功能，能够影响基因的表达。MLC2 (myosin light chain 2)编码肌球蛋白轻链2,是肌球蛋白的重要组分(肌球蛋白的凝聚状态以及热诱导时的凝胶特性对肉制品的质构、脂肪和水的结合能力等有很大影响)，对肌球蛋白的结构和功能显示重要调节作用，在肌肉的发生过程中起着调控重链表达的作用。MLC2属于肌钙蛋白C超家族，能够可逆的由肌球蛋白轻链磷酸酯酶MLCP脱磷酸化和Ca2+/CaM依赖的肌球蛋白轻链激酶MLCK磷酸化，参与调节肌动蛋白与肌球蛋白互作、Ca2+敏感性、葡萄糖转运和影响肌肉性能的其他相关参数。另外，MLC2也是一种丝氨酸/苏氨酸激酶的底物，能被有丝分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，参与多种细胞信号途径。Davoli等已将其定位于猪的3号染色体短臂(Davoli et al. Identificationof SNPs, mapping and analysis of allele frequencies in two candidate genes formeat production traits :the porcine myosin heavy chain 2B(MYH4)and the skeletalmuscle myosin regulatory light chain 2(HUMMLC2B). Anim Genet. 2003, 34 :221-225)，徐德全等从杂交亲代大白猪与子代长大猪的背最长肌的消减cDNA文库中筛选到其EST，利用电脑克隆和SMART等技术，获得了其cDNA全长序列和全部内含子序列(GenBank登录号分别为 AY754870 和 AY870651, Xu et al. Identification of a differential geneHUMMLC2B between Fl hybrids LandraceXYorkshire and their female parentsYorkshire. Gene, 2005, 352 :118-126)。但有关猪MLC2启动子区SNP的研究至今还未见报道。因此在分子水平上研究猪MLC2基因启动子区的SNP，分析其与猪胴体等经济性状关系，具有重要的意义
发明内容
本发明目的在于克隆猪MLC25’侧翼启动子区225bp的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1(大白猪)和SEQ ID N0:2(梅山猪)所示。通过对2个猪种的上述序列进行Cluster W比对，寻找SNP位点，建立相应的SNP分型方法，分析其与与猪胴体性状的关系，为猪的胴体性状标记辅助选择提供有用的遗传标记。本发明通过以下技术方案实现选择中国地方猪种梅山猪和外来的欧洲大白猪为实验材料，从猪血液中提取基因组DNA，以猪MLC2基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物正向引物F : 5 ’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3，，反向引物R : 5 ’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3 ’。利用该引物进行PCR扩增，PCR产物回收、克隆、测序后，利用Cluster W进行序列比对。本发明提供了猪MLC25’侧翼启动子区即位于该225bp扩增片段内部的I处核苷酸多态性(SNP)，即在所述的序列表SEQ ID NO 1的53bp处存在一个C/A的突变，在序列表SEQ ID NO :2的53bp处存在一个A/C突变，上述等位基因的突变导致Hinf I酶切位点的改变。其SNP位点如图2所示。本发明提供了检测上述序列53bp处A/C变异的HinfI-RFLP基因型分型方法。进一步本发明提供了利用HinfI-RFLP方法确定不同基因型个体与猪胴体性状之间的相关关系的关联分析的应用。本发明进一步克隆了不同基因型大白猪和梅山猪的MLC2基因5’侧翼启动子901bp序列。分别构建重组质粒，转染C2C12细胞，观察不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子序列在细胞中的活性。
序列表SEQ ID NO 1是所克隆到的大白猪MLC2基因5’侧翼启动子区的核苷酸序列，长度为225bp。序列表SEQ ID NO 2是所克隆到的梅山猪MLC2基因5’侧翼启动子区的核苷酸序列，长度为225bp。图I是大白猪和梅山猪MLC2基因5’侧翼启动子区225bp片段的扩增条带图中M为DL2000Marker ；泳道1_3为以大白猪基因组DNA为模板的扩增条带；泳道4_5为以梅山猪基因组DNA为模板的扩增条带。图2是大白猪和梅山猪MLC2基因5’侧翼启动子区225bp序列的比对结果和SNP位点。图3是MLC25’侧翼区HinfI-RFLP检测结果琼脂糖浓度为2% ;图中泳道M为DL2000Maker ；
图4是不同基因型大白猪和梅山猪的MLC2基因5’侧翼901bp启动子PCR扩增图中M为DL2000Marker ;泳道1_3为以大白猪基因组DNA为模板的扩增条带；泳道4_5为以梅山猪基因组DNA为模板的扩增条带。图5是用于分析不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子活性的PGL3_basiC载体结构示意图。图6是不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子转染C2C12细胞的结果。
具体实施例方式实施例I利用苯酌■抽提法提取大白猪和梅山猪血液总DNA将现场所采大白猪(来自华中农业大学试验猪场，为常规报道的品种，下同)新鲜血液加入0. 5M乙二胺四乙酸(即EDTA，购自武汉市江润精细化工有限责任公司)作为抗凝剂(按血液量体积比的1/10)，并摇匀，防止凝血。白细胞分离(I) 4°C, 6000rpm,离心 IOmin,去血清。(2)加入2倍体积双蒸水，轻轻摇匀沉淀lOmin，破碎红细胞。(3) 40C，6OOOrpm,离心 lOmin，去上层红细胞浆。(4)利用0. 9% NaCl洗漆沉淀,轻轻摇勻lOmin。(5)4°C,6000rpm,离心lOmin,弃上清,得到白细胞沉淀。总DNA 提取(I)在白细胞沉淀或肌肉组织磨碎浆液中，加入等体积lXSET(lml)，蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度100 y g/mL，10%十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度0. 5%，摇勻，55°C水浴摇床中温育过夜消化。(2)在消化液中加入等体积的Tris饱和酹,轻轻摇勻15min,于4°C、IlOOOrpm离心lOmin，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。(3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25 24 I)，缓慢颠倒离心管IOmin,于低温冷冻离心机中4°C、IlOOOrpm离心lOmin，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 : I),缓慢颠倒离心管lOmin，于低温冷冻离心机中4°C、IIOOOrpm离心lOmin。
(5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，小心混匀后可见白色絮状DNA沉淀。(6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水溶解DNA。(7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在I %琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测DNA提取质量。实施例2 :猪MLC25’侧翼启动子区特异DNA片段的获得及SNP检测方法的建立选择外来血缘猪“大白猪”和中国地方猪种“梅山猪”(来自华中农业大学试验猪场，为常规报道的品种)为试验材料，以猪MLC2基因(登录号AY754870)的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物正向引物 F : 5 ’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3， 反向引物R : 5 ’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3 ’分别以大白猪(国外血缘猪品种)和梅山猪(中国地方猪品种)血液基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增(见图I)。PCR反应体系见表I。表IPCR反应体系
权利要求
1.猪MLC2基因5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，在所述的SEQ ID NO 1的53bp处存在一个C/A的突变，在SEQ ID N0:2的53bp处存在一个Α/C突变，导致HinfI酶切位点的改变，引起HinfI-RFLP 多态性。
2.根据权利要求I所述的遗传标记，其中克隆猪MLC2基因5’侧翼启动子片段所用引物的DNA序列如下所示 正向引物 F:5’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3’， 反向引物 R :5’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3’。
3.一种筛选猪胴体性状遗传标记的方法，其特征在于，按照以下步骤 以猪MLC2基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，以其5’侧翼序列为靶序列设计引物，得到如权利要求2所示引物；从猪血液中提取基因组DNA，用权利要求2所示的引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；通过序列比对，筛查SNP及其所在限制性内切酶识别位点，进行酶切分型，构建不同基因型的重组质粒，转染细胞，观察不同基因型的转录活性，分析不同基因型与猪胴体性状的相关关系。
4.权利要求I所述的遗传标记在猪胴体性状标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪MLC2的5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记及制备方法与应用。该遗传标记具有如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列的第53bp处分别存在一个C/A和A/C的突变，该等位基因的突变引起DraIII-RFLP的多态性。利用该遗传标记对大白猪和梅山猪F2代进行了与猪胴体性状的关联分析，检测了不同基因型的启动子的转录活性。本发明还公开了该遗传标记的分型检测方法，为猪胴体性状分子标记辅助选择提供了新的遗传标记和检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102776273SQ201110445328
公开日2012年11月14日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者刘倩, 刘敏, 夏晓亮, 孙小瑞, 徐德全, 熊远著 申请人:华中农业大学