特异性结合免疫球蛋白的蛋白质以及免疫球蛋白结合性亲和配体的制作方法

专利名称：特异性结合免疫球蛋白的蛋白质以及免疫球蛋白结合性亲和配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与抗体特异性结合的蛋白质，以及以该蛋白质作为免疫球蛋白结合性亲和配体的亲和分离基质，以及使用所述基质对抗体进行分离纯化或吸附去除的方法。
背景技术：
抗体具有与被称为抗原的物质进行特异性结合的功能，以及协同其他的生物分子或细胞，将具有抗原的因子脱毒、去除的功能。所谓“抗体”这个名称，是强调这种与抗原结合的功能的名称，这类物质也被称为“免疫球蛋白(Ig) ”。近年来，伴随着基因工程、蛋白质工程和细胞工程的发展，被称为抗体药物的利用抗体所具有的功能的药物开发盛行。由于与传统药物相比，抗体药物更加特异性地作用于靶分子，因此预期其可以使副作用减轻并且获得高疗效，实际上有助于改善各种疾病。另一方面，因为抗体药物是向生物体内大量施用的，因此与其他的重组蛋白质药品相比的情况下，抗体药物的纯度对品质产生更大的影响。由此，为了制造高纯度的抗体，亲和层析等方法被普遍使用，亲和层析利用特异性结合抗体的分子作为配体的吸附材料。作为抗体药物得到开发的基本上是单克隆抗体，使用重组的细胞培养技术等进行大量生产。“单克隆抗体”是指从来源于单一抗体生产细胞的克隆所获得的抗体。现在上市的抗体药物，基本上在分子结构上都是免疫球蛋白G(IgG)亚类。作为与IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合蛋白质，普遍已知的是蛋白质A。蛋白质A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产的细胞壁蛋白质的I种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)以及细胞壁结合结构域即XM结构域构成(非专利文献I)。在抗体药物制造步骤的早期纯化步骤(捕获步骤)中，将蛋白质A作为配体固定在水不溶性担载体上的亲和层析用柱(下文称为蛋白质A柱)被普遍使用(非专利文献I、非专利文献2、非专利文献3)。为了改善蛋白质A柱的性能，进行了种种技术开发。从配体方面出发的技术研发也在进行中。最初使用野生型蛋白质A作为配体，但以加入蛋白质工程修饰的重组蛋白质A作为配体而对于柱子性能进行改善的技术也日益增多。作为典型的重组蛋白质A，可列举没有免疫球蛋白结合活性的、去除了 XM区域的重组蛋白质A(rProtein A Sepharose (注册商标)，GE healthcare Japan公司生产)。以去除了 XM区域的重组蛋白质A作为配体的柱子，具有抑制传统制品中的蛋白质的非特异性吸附的优点，现在在产业上普遍使用。此外，还有以向蛋白质A中导入I个Cys突变的重组蛋白质A (专利文献1)，或者导入多个Lys突变的重组蛋白质A(专利文献2)作为配体使用的发明。这些技术表现出固定在水不溶性担载体上的效果，具有降低抗体与柱子的结合容量和减少固定化配体泄露的优点。作为进行了修饰的重组蛋白质A，普遍已知利用在B结构域中导入突变的修饰结构域(被称为Z结构域)作为配体的技术(非专利文献I、非专利文献4、专利文献3)。Z结构域相对于B结构域，是导入了将第29位的Gly取代为Ala的突变的修饰结构域。并且，在Z结构域中，可以同时导入Val取代B结构域的第I位的Ala的取代突变，这是以方便基因工程制造复数个结构域连接而成的编码基因为目的的突变，对结构域的功能几乎没有影响(例如，在专利文献4中，实施例使用了 Ala取代了 Z结构域的第I位的Val的变体)。已知Z结构域比B结构域的耐碱性更高，具有使用杀菌、洗涤效果好的碱溶液洗涤后可对柱子重复利用的优点。以Z结构域为基础，发明了用其他氨基酸取代Asn，产生更高的耐碱性的配体(专利文献5、专利文献6)，也开始用于产业。由此可见，对于蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域(E、D、A、B和C结构域)，导入将第29位的Gly取代为Ala的突变的有效性是普遍已知的。实际上，自1987年公开该“G29A”的突变以来，在后研发的涉及修饰蛋白质A的现有技术中，也导入了该“G29A”的突变(专利文献2、专利文献4、专利文献6)。
作为Z结构域的另一个特征，可列举与免疫球蛋白的Fab区域结合力变弱(非专利文献5)。由于该特征，在用酸来解离结合的抗体的步骤中，具有易于解离抗体的优点(非专利文献I、专利文献7)。抗体易于解离，是可以用更少体积的洗脱液回收含有更高浓度抗体的洗脱液。近年来，在抗体药物制造中，每一批次的细胞培养液量超过10，000升，近几年抗体表达水平提高到了 10g/L(非专利文献6)。下游的纯化步骤必须达到与该处理规模扩大对应，对以少量洗脱液回收含有更高浓度抗体的洗脱液的技术改进具有极大期望。除Z结构域以外，作为修饰蛋白质A ·配体，以蛋白质A的C结构域为基础的研究不断深入(专利文献4)。这类配体的特征是产生了野生型C结构域本来具有的高耐碱性，代替基于B结构域制造而成的Z结构域，作为新的基础结构域受到关注。但是，对于C结构域的检验结果证实，在使用酸将与C结构域结合的抗体进行解离的步骤中，存在抗体难以解离的缺点。在非专利文献2和专利文献4中，C结构域表现出与免疫球蛋白的Fab区域的强结合力，推测该特征是难以用酸解离抗体的原因。为了改善这一缺点，使用导入了第29位的Gly被Ala取代的突变的C结构域，在检验抗体酸解离特性时，相比野生型C结构域，可见抗体有变得易于解离的倾向，但仍不充分。由此可见，现在公知的使抗体变得易于从蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域上解离的突变只有“G29A”。如前所述，“G29A”除了易于解离抗体这一点以外还有优点，预期通过第29位以外的突变技术来改善。但是，尚未报道除第29位以外的突变，能够使抗体更易
于解离。现有技术文献专利文献专利文献I :美国专利第6399750号公报专利文献2 :日本特开2007-252368号公报专利文献3 :美国专利第5143844号公报专利文献4 日本特开2006-304633号公报专利文献5 :欧州专利第1123389号公报专利文献6 :国际公开第03/080655号公报专利文献7 :美国公开第2006/0194950号公报
非专利文献非专利文献I Hober S.等人，“J. Chromatogr. B” 2007 年，第 848 卷，第 40 47 页非专利文献2 Low D.等人，“L. Chromatogr. B” 2007 年，第 848 卷，第 48 63 页非专利文献3:Roque A. C. A.等人“ J. Chromatogr. A”2007 年，第 1160 卷，第 44 55页非专利文献4 :Nilsson B.等人“Protein Engineering” 1987 年，第 I 卷，第107 113页非专利文献5 :Jansson B.等人“FEMS Immunology and MedicalMedicalMicrobiology ^ 1998 年，第 20 卷，第 69 78 页
非专利文献6 :稻川淳一等人“分离技术(分離技術)”2008年，第38卷，第20广207页

发明内容
发明要解决的问题本发明要解决的问题是通过向第29位以外的氨基酸导入突变，产生了具有比现有的修饰型蛋白质A配体具有更好的抗体酸解离特性的新型修饰蛋白质A配体。解决问题的方法本发明人对在第29位以外的位置具有氨基酸取代突变的大量重组蛋白质A变体进行了分子设计，使用蛋白质工程的方法和基因工程的方法，通过转化细胞获得了所述突变体,通过比较检验所述突变体的活性,完成了本发明。换言之，本发明涉及对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中该蛋白质是具有下述氨基酸序列在来源于选自序列号I飞所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的至少一个结构域的氨基酸序列中，将至少I个氨基酸取代突变导入至A、B和C结构域的第3广37位的氨基酸残基、E结构域的第29 35位的氨基酸残基、或D结构域的第34 40位的氨基酸残基中而得到的氨基酸序列，并且，与导入突变前的蛋白质相比，该蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低。优选导入突变前的来源于结构域的氨基酸序列是序列号I飞所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列，或序列号6 10所记载的来源于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列。优选导入突变前的来源于结构域的氨基酸序列是序列号5所记载的蛋白质A的C结构域的氨基酸序列，或序列号10所记载的来源于蛋白质A的C结构域的氨基酸序列。优选在导入突变前的氨基酸残基中，各结构域中的对应于C结构域的第33位的氨基酸残基是Ser，各结构域中的对应于C结构域的第35位的氨基酸残基是Lys，各结构域中的对应于C结构域的第36位的氨基酸残基是Asp，或各结构域中的对应于C结构域的第37位的氨基酸残基是Asp。优选所导入的氨基酸取代突变是将对应于C结构域的第33位的Ser取代为Glu、Leu或Thr的突变，
将对应于C结构域的第35位的Lys取代为Arg的突变，将对应于C结构域的第36位的Asp取代为Arg或Ile的突变，或将对应于C结构域的第37位的Asp取代为Glu的突变。优选所导入的氨基酸取代突变是将对应于C结构域的第33位的Ser取代为Glu的突变。此外，本发明涉及将2个以上的上述蛋白质相互连接而得到的由多个结构域所构成的蛋白质。优选相互连接的蛋白质是不同种类的蛋白质，相互连接的蛋白质的个数为疒5个。此外，本发明涉及编码前述蛋白质的DNA。 优选在上述DNA中，构成相互连接的结构域的碱基序列的序列同一性在90%以下。此外，本发明涉及包含上述DNA的载体。此外，本发明涉及用上述载体对宿主进行转化而得到的转化体。在上述转化体中，宿主优选是革兰氏阳性菌。优选革兰氏阳性菌是短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌，优选短芽孢杆菌属细菌是桥石短芽抱杆菌(Brevibacillus choshinensis)。此外，本发明涉及采用上述转化体，或者采用使用了上述DNA的无细胞蛋白质合成体系制造制造上述蛋白质的方法。在上述制造方法中，优选将蛋白质积蓄在转化体的细胞内和/或周质区域中，和/或将蛋白质分泌到转化体的细胞外。此外，本发明涉及亲和分离基质，其是以上述蛋白质作为亲和配体固定于由水不溶性基体材料构成的担载体而得到。优选水不溶性基体材料包括合成高分子或多糖类，优选多糖类是纤维素。上述亲和分离基质，优选与含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合，更优选与免疫球蛋白G或免疫球蛋白G的衍生物结合。此外，本发明涉及上述亲和分离基质的用途，其用于分离含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质。分离含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质，优选其目的在于分离回收只含有免疫球蛋白的Fab区域的蛋白质。发明的效果本发明的蛋白质表现出优异的抗体酸解离特性。通过使用将所述蛋白质固定在载体上的亲和分离基质，可以改善抗体的分离纯化。本发明的蛋白质由于在所有结构域中都保守的氨基酸位置上导入了突变，因此不论在使用E、D、A、B和C结构域中的任何结构域的情况下，本发明的蛋白质以及亲和分离基质都具有上述共同的效果。


图I是葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的序列比对表。图2是本发明的实施例10和比较例3中涉及的Biacore测定中的，与各种GST融合C结构域突变体的单克隆IgG-Fab (VH3型)的结合传感图。
图3是本发明的实施例12中涉及的，关于相对于亲和分离基质(4)抗体的5%dBC的图。图4是本发明的实施例13和比较例I中涉及的，显示了使用亲和分离基质⑴的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。图5是本发明的实施例13和比较例2中涉及的，显示了使用亲和分离基质⑵的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。图6是本发明的实施例13和比较例I中涉及的，显示了使用亲和分离基质(3)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。图7是本发明的实施例13涉及的，显示了使用亲和分离基质(4)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。
具体实施例方式本发明的蛋白质，是对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中，该蛋白质是具有如下氨基酸序列的蛋白质，并且，与具有导入突变前的氨基酸序列的蛋白质相比，该蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低；所述氨基酸序列是在来源于选自序列号f 5所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的至少一个结构域的氨基酸序列中，将至少I个氨基酸取代突变导入至A、B和C结构域的第3广37位的氨基酸残基、E结构域的第29 35位的氨基酸残基、或D结构域的第34 40位的氨基酸残基中而得到的氨基酸序列。蛋白质A是由5个免疫球蛋白结合结构域，即免疫球蛋白结合蛋白质相互连接而构成的蛋白质。蛋白质A的E、D、A、B或C结构域是能够与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)之外的区域结合的免疫球蛋白结合结构域，任一个结构域都具有分别与免疫球蛋白的各个区域结合的活性，所述各个区域是免疫球蛋白的Fe区域、Fab区域以及Fab中特别是Fv区域。此外，本发明中对蛋白质A的来源也没有特殊的限定，优选是来自葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白质 A。被称为“蛋白质”的术语包含了具有多肽结构的所有分子，片段化的或者通过肽键连接的多肽链也都包含在被称为“蛋白质”的术语中。此外，所谓“结构域”是蛋白质的高级结构单位，由数十至数百个氨基酸残基序列构成，足以显现出某种物理化学或生物化学上的功能的蛋白质单位。来源于结构域的氨基酸序列是指导入突变前的氨基酸序列，不仅限于蛋白质A的E、D、A、B及C结构域中任何的野生型氨基酸序列，即使有通过氨基酸的取代、插入、缺失或化学修饰而部分被改变的氨基酸序列，只要其是具有与Fe区域的结合力的蛋白质，就包含在所述来源于结构域的氨基酸序列中。来源于结构域的氨基酸序列，例如可列举构成序列号广5中记载的葡萄球菌属蛋白质A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列，以及构成序列号6 10记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列。此外，由序列号6 10记载的氣基酸序列构成的蛋白质是如下蛋白质该蛋白质是由相对于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域(序列号广5)、向对应于C结构域的第29位导入了将Gly取代为Ala的突变的氨基酸序列构成的蛋白质。此外，由于在B结构域中导入了被称为AlV和G29A的突变的Z结构域也具有与Fe区域的结合力，因此也是来源于结构域的氨基酸序列。优选例如导入突变前的氨基酸序列是化学稳定性高的结构域或其突变体。导入氨基酸取代突变的蛋白质是与蛋白质A的E、D、A、B及C结构域中的任一个的野生型氨基酸具有优选85%以上，更优选90%以上的氨基酸序列同一性，并具有与Fe区域的结合力的蛋白质。在所有结构域中都保守的氨基酸残基是指在比较E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列时，存在于相同位置上的相同的氨基酸残基。如图I的序列比对表所示，A、B和C结构域的第26 39位，E结构域的第2Γ37位，D结构域的第29 42位的氨基酸残基是在所有结构域中都是保守的。在所有结构域中保守的具体氨基酸残基是指，例如可列举A、B和C结构域的第37位的氨基酸，E结构域的第29 35位的氨基酸，以及D结构域的第34 40位的氨基酸。优选是对于于C结构域的第33位的Ser,对应于C结构域的第35位的Lys,对应于C结构域的第36位的Asp，和对应于C结构域的第37位的Asp。特别优选对应于C结构域的第33位的Ser，但不限于此。此外，“对应”是指如图I所示，将蛋白质A的E、D、A、B和C结构域比对时，位于纵列上相同的位置上。·
一般而言，氨基酸序列高度保守的区域大部分是对蛋白质功能重要的区域，一旦在这样的区域中导入突变，在很多情况下蛋白质的功能会丧失。但是，尽管上述区域中的氨基酸序列是高度保守的，但导入突变对与免疫球蛋白Fe区域的结合力没有太多影响，同时可以极大的降低与免疫球蛋白Fab区域的结合力。此外，公知的事实是，在导入突变前的氨基酸序列是化学稳定性高的结构域或其突变体的情况下，由于构成结构域的氨基酸是较少的60个氨基酸左右，一旦导入新的突变，很多时候会降低化学稳定性。例如，对应于C结构域的第30位的Phe被Ala取代的突变体对喊的化学稳定性大幅降低(Linhult M等人，PROTEINS:Structure, Function, andBioinformatics, 2004年,第55卷,第407 416页)。但是,本发明中的氨基酸突变可以在保持原有的化学稳定性的基础上，发挥出上述效果。氨基酸的取代突变是指消除原来的氨基酸，并在相同的位置补充其他的不同种类的氨基酸的突变。所补充的其他氨基酸不受特别的限制，例如可列举天然的构成蛋白质的氨基酸、不构成蛋白质的氨基酸、非天然氨基酸。其中，从基因工程生产的观点看，可以良好地适用天然氨基酸。天然氨基酸可列举例如Ala、Phe> Val、Trp> Leu、Pro、lie、Met、Gly、Asn、Ser、Gin、Thr> Tyr> Cys> Lys、His、Asp、Glu 和 Arg,特别优选是 Glu 或 Arg。氨基酸取代突变的个数没有特殊的限定，只要包含突变的蛋白质对免疫球蛋白Fab区域的亲和力降低，但保持与免疫球蛋白整体的亲和力即可，基于保持突变导入前的蛋白质立体构造的观点来看，优选4个以下，更优选2个以下。此外，对于氨基酸取代突变的表述，取代位置的编号之前记载了野生型或非突变型的氨基酸，而在取代位置的编号之后，记载了突变的氨基酸。例如，将29位的Gly取代为Ala的突变记载为G29A。在将氨基酸取代突变导入到在上述所有结构域都保守的氨基酸部位中的情况下，作为导入实例可列举例如与C结构域的第33位相对应的Ser被GliuLeu或Thr取代突变，对应于C结构域的第35位的Lys被Arg取代的突变,对应于C结构域的第36位的Asp被Arg或Ile取代的突变，和对应于C结构域的第37位的Asp被Glu取代的突变。特别优选的是对应于C结构域的第33位的Ser被Glu取代的突变，但不限于此。
导入氨基酸取代突变所获得的蛋白质，是与蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的任一个的野生型氨基酸具有优选85%以上，更优选90%以上的序列同一性，并具有与Fe区域的结合力的蛋白质。本发明的蛋白质可以是只由导入了氨基酸取代突变的单个结构域构成的蛋白质，也可以是由2个以上的上述蛋白质连接而成的由多个结构域构成的蛋白质。在由多个结构域构成的蛋白质的情况下，所连接的蛋白质可以是来源于同一种结构域的蛋白质(同源二聚体、同源三聚体等同源多聚体)，也可以是来源于种类不同的结构域的蛋白质(异源二聚体、异源三聚体等异源多聚体)。连接的蛋白质数量优选是2个以上，进一步优选是2 10个，更优选是2飞个。
法，可列举不通过作为接头的氨基酸残基连接的方法，或者以一个或多个氨基酸残基连接的方法，但不限于此。对连接的氨基酸残基个数没有特别的限制。对连接模式和连接个数没有特别的限制，只要没有使单体蛋白质的三维立体结构不稳定即可。此外，上述蛋白质或者由上述多个结构域构成的蛋白质作为I个组成成分，与功能不同的其他蛋白质融合而成的融合蛋白，也包含在本发明的蛋白质中。作为融合蛋白的实例，可列举与卵清蛋白、GST(谷胱甘肽S转移酶)或MBP(麦芽糖结合蛋白)融合的蛋白质，但不限于此。通过作为与GST、MBP的融合蛋白表达，可以方便的纯化蛋白质。此外，融合DNA适体等核酸、抗生物素等药物、PEG(聚乙二醇)等大分子的情况，只要实现与本发明相同的效果，就包含在本发明的蛋白质中。本发明还涉及编码上述蛋白质的DNA。只要由所述DNA构成的碱基序列翻译的氨基酸序列构成本发明的蛋白质即可。此类碱基序列可利用普遍使用的公知方法获得，例如聚合酶链式反应(下文简称为PCR)法。此外，还可以由公知的化学合成法合成，或者由DNA文库获得。所述碱基序列的密码子可进行简并密码子替换，只要在翻译时编码相同的氨基酸即可，而不必需与原来的碱基序列相同。本发明的DNA，相对于编码野生型或突变型蛋白质A的结构域的以往已知的DNA，是通过导入位点特异性突变而获得的。位点特异性的突变导入可以如下所述使用重组DNA技术、PCR方法等进行。通过重组DNA技术导入突变，例如可以进行盒式突变法，既在编码本发明的蛋白质的基因中，在希望导入突变的目的位点两侧存在合适的限制性酶识别序列的情况下，用上述限制性酶切开这些限制性酶识别序列部分，去除包含希望导入突变的位置的区域后，插入通过化学合成等仅在目的位置导入了突变的DNA片段。此外，通过PCR导入位置特异性突变可如下进行，例如通过以编码蛋白质的双链质粒为模板，使用与+或-链互补的、含有突变的2种合成寡核苷酸引物进行PCR的双引物法。此外，将编码本发明的单体蛋白质(I个结构域)的DNA按期望数量串联连接，来制造编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA。例如，编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA的连接方法可以是在DNA序列中导入合适的限制性酶切位点，用DNA连接酶将限制性酶片段化了的双链DNA连接而成。限制性酶切位点可以是一种，也可以导入多种不同种类的限制性酶切位点。或者，可以在编码蛋白质A的DNA(例如，国际公开第W006/004067号公报)中应用上述突变导入法来制造编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA。在本文中，在编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA中，在编码各个单体蛋白质的碱基序列相同的情况下，由于存在引起宿主的同源重组的可能性，因此编码连接而成的单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同一性优选90%以下，更优选85%以下。本发明的载体包含编码上述蛋白质或由多个结构域构成的蛋白质的碱基序列，以及与所述碱基序列可操作连接的、可在宿主中发挥功能的启动子。一般而言，编码上述蛋白质的DNA可以通过与载体连接或插入而获得。用于插入基因的载体只要是可以在宿主中自主复制的即可，没有特别的限定，质粒DNA或噬菌体DNA都可作为载体使用。就用于插入基因的载体而言，例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可列举PQE系列载体(QIAGEN公司生产)、pET系列载体(Merck公司生产)和pGEX系列载体(GE Healthcare Japan公司生产)等载体。在使用短芽孢杆菌属细菌作为宿主的情况下，可以使用例如作为枯草芽孢杆菌载体而公知的PUBllO或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pNU211R2L5 (日本特开平7-170984号公报)、pHT210 (日本特开平6-133782号公报)，或者，大肠杆菌和短芽孢 杆菌属细菌的穿梭载体即pNCM02(日本特开2002-238569号公报)等。可以通过用载体转化宿主，获得转化体。对于宿主，并没有特别的限制，在可廉价的大量生产的基础上，优选可恰当的使用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)等细菌(真细菌)。更优选的可以是枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)等革兰氏阳性菌。进一步优选的可以是公知的大量生产蛋白质A的适用例(国际公开第W006/004067号公报)的短芽孢杆菌属细菌。短芽孢杆菌属细菌虽无限定,但可示例土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)、波茨坦短芽孢杆菌(B. borstelensis)、短短芽孢杆菌(B. brevis)、中孢短芽孢杆菌(B. centrosporus)、桥石短芽抱杆菌(B. choshinensis)、美_短芽抱杆菌(B. formosus)、污染短芽抱杆菌(B. Invocatus)、侧抱短芽抱杆菌(B. Iaterosporus)、B. IimnophiIus、类短短芽孢杆菌(B. parabrevis)、罗伊氏短芽孢杆菌(B. reuszeri)、嗜热红短芽孢杆菌(B. thermoruber)。优选的可示例短短芽孢杆菌47株(JCM6285)、短短芽孢杆菌47K株(FERMBP-2308)、短短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)、桥石短芽孢杆菌HPD31株(FERM BP-1087)或桥石短芽孢杆菌HPD31-0K株(FERM BP-4573)。以提高产量为目的，可以使用上述短芽孢杆菌属细菌的蛋白酶缺陷株、高表达株或芽孢形成能力缺失株等突变株(或诱导株)。具体可列举来源于桥石短芽孢杆菌HPD31的蛋白酶突变株即桥石短芽孢杆菌HPD31-0K(日本特开平6-296485号公报)，或没有芽孢形成能力的桥石短芽孢杆菌HPD31_SP3(国际公开第W005/045005 号公报)。向宿主细胞导入载体的方法可列举例如使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法、农杆菌感染法、基因枪法，或聚乙二醇法等，但不限于此。此外，在宿主中表达所获得的基因的功能的方法，可列举在染色体中重组本发明获得的基因的方法等。可通过上述转化体或使用了 DNA的无细胞蛋白质合成系统来制造蛋白质。在使用转化体制造蛋白质的情况下，可以通过在培养基中培养转化细胞，使本发明的蛋白质生产积蓄在培养菌体内(包含菌体的细胞周质区域内)或培养液中(细胞外)来制造，并从所述培养物中收集所需的蛋白质。在使用转化细胞制造蛋白质的情况下，蛋白质可以积蓄在转化体的细胞内和/或细胞周质区域内。在此情况下，如果积蓄在细胞内，则具有可以防止表达的蛋白质发生氧化，也不与培养基组分发生副反应的优点，积蓄在周质区域内时，优点是可以抑制细胞内蛋白酶引起的分解。另一方面，在制造蛋白质的情况下，蛋白质可以分泌到转化体的细胞外。在此情况下，就不需要菌体破碎、提取工艺，优点是降低了生产成本。在培养基中培养本发明的转化细胞的方法，通过用于宿主培养的常用方法进行。用于培养所获得的转化体的培养基并无特殊限制，只要能够高效、高产量的生产所述蛋白质即可。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、聚胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等作为碳源或氮源。此外，必要时相应添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。在使用营养缺陷型的宿主细胞的情况下，可添加生长繁殖必需的营养物。此外，必要时也可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。进一步的，为了抑制位于菌体内外的来源于宿主的蛋白酶导致该目标蛋白质的分 解和小分子化，可以添加适当浓度的各种公知的蛋白酶抑制剂，即，苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、抗蛋白酶(AntiPain)、糜蛋白酶抑素、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A、膦酰二肽(Phosphoramidon)、抑肽酶(aprotinin)、乙二胺四乙酸(EDTA)，和/或其他市售的蛋白酶抑制剂。进一步的，为了正确的折叠本发明的蛋白质，可以利用例如GroEL/ES、Hsp70/DnaK、Hsp90、Hspl04/ClpB等分子伴侣。在此情况下，分子伴侣可以通过例如共表达或融合蛋白化等方法与本发明的蛋白质共存。在以蛋白质的正确折叠为目的的情况下，虽然也存在向培养基中添加促进正确折叠的添加剂，或者在低温下培养等方法，但不限于此。培养以大肠杆菌为宿主获得的转化细胞的培养基没有特殊的限定，例如，可列举LB培养基(1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取物，l%NaCl)或2xYT培养基(I. 6%胰蛋白胨，I. 0%酵母提取物，O. 5%NaCl)等。培养以短芽孢杆菌属细菌作为宿主获得的转化体的培养基没有特殊的限定，例如，可列举TM培养基(1%蛋白胨，O. 5%肉提取物，O. 2%酵母提取物，1%葡萄糖，pH7. O)或2SL培养基(4%蛋白胨，O. 5%酵母提取物，2%葡萄糖，pH7. 2)等。此外，通过在15 42°C，优选2(T37°C的培养温度下，在通气搅拌的条件下好氧培养数小时至数天，使本发明的蛋白质积蓄在培养细胞内(包含菌体的细胞周质区域内)或培养液(细胞外)中并回收。根据具体情况，也可以切断通气进行厌氧培养。在分泌生产重组蛋白质的情况下，可以在培养结束后，通过离心分离、过滤等普通的分离方法，将培养细胞和含有分泌生产的蛋白质的上清液分离，回收所生产的重组蛋白质。此外。在积蓄在培养细胞内(包含周质空间区域内)的情况下，可以通过例如从培养液离心分离、过滤等方法收集菌体，然后，通过超声破碎、法式压滤法等将所述菌体破碎和/或通过添加表面活性剂等使其溶解，回收细胞内积蓄生产的蛋白质。在通过无细胞蛋白质合成体系制造本发明的蛋白质的情况下，所述无细胞蛋白质合成体系并无特殊限制，例如，可以使用原核细胞来源的、植物细胞来源的、高等动物细胞来源的合成体系等。
可以通过亲和层析、阳离子或阴离子交换层析、凝胶过滤层析等单独或恰当的组合，进行本发明的蛋白质的提纯。确认所获得的纯化物质是否是目标蛋白质，一般可以进行的方法是例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、Western印迹等。通过将上述方法生产的蛋白质作为亲和配体固定在由水不溶性基体材料组成的担载体上，可以制造亲和分离基质。在此，“亲和配体”是指以抗原和抗体的结合为代表，基于特异性的分子间亲和力，从某 些分子的集合中选择性地捕获(结合)目标分子的物质(官能团)的术语，在本发明中，指特异性结合免疫球蛋白的蛋白质。在本说明书中，在只记载“配体”的情况下，与“亲和配体”是同义的。在本发明中使用的由水不溶性基体材料组成的担载体可以列举玻璃珠、硅胶等无机担载体，交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚乙烯等合成高分子，或包括结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联右旋糖酐等多糖的有机担载体，此外，由这些组合获得的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售商品，可以列举作为多孔纤维素凝胶的GCL2000、烯丙基右旋糖酐和亚甲基双丙烯酰胺共价结合交联的Sephacryl S-1000、作为甲基丙烯酸酯类的担载体的Toyopearl、作为琼脂糖类交联担载体的Sepharose CL4B和作为纤维素类交联担载体的Cellufine等。但是,本发明中的水不溶性担载体不限于这些示例的担载体。此外，本发明中使用的水不溶性担载体，从所述亲和分离基质的使用目的和方法来看，希望是表面积大的，优选是具有大量合适大小的细孔的多孔物质。担载体的形状可以选择任意的形状，珠状、独石状、纤维状、膜状(包括中空纤维)等都是可以的。关于配体的固定化方法，可以是例如利用配体中存在的氨基、羧基或硫醇基，通过传统的偶联方法与担载体结合。偶联方法可列举使担载体与溴化氰、表氯醇、二环氧甘油醚、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼和高碘酸钠等反应而活化担载体(或者在担载体表面导入反应官能团)，与作为配体的进行固定化的化合物进行偶联反应的固定化方法，此夕卜，可列举添加在担载体和配体这样的固定化化合物中存在的类似碳化二亚胺这类的缩合试剂，或者类似戊二醛这类的在分子中具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联来固定化的方法。此外，可以在配体和担载体之间导入由多个原子构成的间隔分子，也可以将配体直接固定在担载体上。然而，为了进行固定化，可以对本发明的蛋白质进行化学修饰，也可以加入对固定化有利的氨基酸残基。对固定化有利的氨基酸可列举侧链具有对固定化的化学反应有利的官能团的氨基酸，例如可列举侧链含有氨基的Lys、侧链含有硫醇基的Cys。本发明的实质是，只要将在本发明中赋予蛋白质的效果，也同样赋予给将该蛋白质作为配体而固定化的基质即可，不论为固定化而进行何种修饰、变化，也都包含在本发明的范围内。由于亲和分离基质是通过固定本发明的蛋白质而获得的，因此基于本发明蛋白质本身的活性，可以结合包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质。由此可见，利用本发明的蛋白质和亲和分离基质，可以通过亲和柱层析纯化方法分离纯化包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质。“包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质”是指包含结合蛋白质A的Fe区域一侧部分的蛋白质。但是，只要能够结合蛋白质A即可，不必是包含完整Fe区域的蛋白质。
作为包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质，可列举免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物，但不限于此。作为包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质的具体实例，可列举属于VH3亚家族的IgG，特别是属于VH3亚家族的人IgG(单克隆抗体)。优选的，本发明的蛋白质和亲和分离基质与属于VH3亚家族的IgG的Fab区域的亲和力与导入突变前的蛋白质的亲和力相比降低，同时，优选是与亚型1、2和4的IgG的Fe区域具有亲和力的。人的VH生殖细胞基因约一半属于VH3亚家族，实际上，由属于VH3亚家族的IgG抗体构成的药物正在销售、开发中。进一步的，在抗体纯化中，虽然属于VH3亚家族的免疫球蛋白Fab片段残留了对于与作为亲和分离基质使用的配体的结合力，但却对抗体的酸解离特性产生不良影响，上述内容由于参考文献等已成为公知信息(Ghose S.等，Biotechnology and bioengineering, 2005年，第92卷，第6期)。因此，本发明的蛋白质和亲和分离基质优选与属于VH3亚家族的人IgG的Fab区域的结合力降低。上述“免疫球蛋白G衍生物”是指能够结合蛋白质A的修饰型人工蛋白质的总称，例如将人免疫球蛋白G的一部分结构域替换为其他物种的免疫球蛋白G的结构域而融合成的嵌合型免疫球蛋白G，或将人免疫球蛋白G的CDR(互补决定区)部分替换为其他物种的抗体的CDR部分而融合成的人源化免疫球蛋白，向Fe区域的糖链中增加分子修饰的免疫球 蛋白G，人免疫球蛋白G的Fv区域与Fe区域融合成的人工免疫球蛋白G等。此外，结合区域广义上定义为Fab区域(特别是Fv区域)和Fe区域，由于抗体的立体结构是已知的，因此在本发明的蛋白质以及作为亲和分离基质结合对象的蛋白质，在蛋白质工程学上保持与蛋白质A的结合区域的立体结构的基础上，也可以对Fab区域或Fe区域实施进一步修饰(片段化等)。使用填充了本发明的亲和分离基质的亲和柱纯化包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质的方法，可以依照亲和柱层析提纯法，使用已经作为市售品存在的蛋白质A柱来实现(非专利文献3)。换言之，将包含含有免疫球蛋白Fe区域的蛋白质的缓冲液调整为中性后，使所述溶液通过填充了本发明的亲和分离基质的亲和柱，吸附含有免疫球蛋白Fe区域的蛋白质。然后，使适量的纯净缓冲液通过亲和柱，将柱内部洗净。此时，所期望的含有免疫球蛋白Fe区域的蛋白质被吸附到柱内的本发明的亲和分离基质上。然后，使调整到合适的pH的酸性缓冲液(也有含有促进从所述基质解离的物质的情况)流经柱子，通过洗提所期望的含有免疫球蛋白Fe区域的蛋白质，实现高纯度的提纯。通过使缓冲液流经本发明的亲和分离基质对其进行清洗，本发明的亲和分离基质可以循环利用，所述缓冲液是不完全损坏配体化合物或担载体基体材料的功能的、适当的强酸性或强碱性的纯净缓冲液(也有含合适的变性剂或有机溶剂的溶液的情况)。本发明的蛋白质以及使用了所述蛋白质的亲和分离基质产生的效果是与免疫球蛋白具有亲和力，而与免疫球蛋白的Fab区域的亲和力下降。一般而言，蛋白质A的各个结构域与Fe区域的结合比与Fab (Fv)区域的结合更强(非专利文献3)。但是，蛋白质A和各个结构域的“对免疫球蛋白的亲和力”实质上是指对Fe区域的亲和性的表述，仅与Fab区域的结合力发生变化，与免疫球蛋白的亲和性的强度也没有很大的变化。本发明的蛋白质具有蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域，与Fab区域的次级亲和性低，产生如下效果，即可以排除与免疫球蛋白的相互作用中的次级结合的影响。另一方面，由于保持了与Fe区域的亲和性，因而保持了与免疫球蛋白整体的亲和性。当通过下文所述的Biacore系统测定与人免疫球蛋白G制品的亲和性时，本发明的蛋白质所具有的与免疫球蛋白的亲和性其亲和常数(KA)优选在lOlM—1)以上，更优选在lOYM—1)以上。本发明的蛋白质和亲和分离基质与包含免疫球蛋白Fe区域的蛋白质的亲和性可以通过例如使用表面等离子体共振原理的Biacore系统(GE HealthCare Japan公司生产)等生物传感器来测定，但不限于这类测定方法。作为测定条件，可以检测出蛋白质A与免疫球蛋白的Fe区域结合时的结合信号就行，可以在2(T40°C (恒定温度)的温度，pH6 8的中性条件下测定来进行简单的评价。结合对象的免疫球蛋白只要可以检出与Fab区域的结合即可，没有特殊的限定，但是由于一旦使用含Fe区域的免疫球蛋白分子也就检测出与Fe区域的结合，故优选使用将Fab区域片段化从而去除Fe区域所获得的免疫球蛋白分子(Fab片段、Fv片段)。进一 步的，优选通过属于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段，该片端已经确认蛋白质A与Fab区域的结合。通过在相同的测定条件下，获得与相同的免疫球蛋白分子的结合反应曲线，根据分析时所获得的结合参数，比较导入突变前的蛋白质和导入突变后的蛋白质，本领域技术人员可以方便的验证亲和性的差异。此时，比较亲和性不同的两条序列在突变位置以外的序列必须是相同的，例如，在评价突变D36R的效果的情况时，如导入突变前的蛋白质的氨基酸序列是B结构域，而导入突变后的蛋白质的氨基酸序列是C结构域中导入了突变D36R的序列，则所述比较是不恰当的。作为结合参数可使用例如亲和指数(KA)或解离指数(KD)(永田等著“生体物質相互作用Q 7 >夕^ &解析実験法”，Springer-Verlag东京，1998年,第41页)。本发明的各个结构域突变体与Fab的亲和常数可以如下获得，例如利用Biacore系统，在传感芯片中固定属于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段，在温度25°C，pH7. 4的条件下向流路中添加各结构域突变体的实验体系。对于具有导入了本发明所涉及突变的序列的蛋白质而言，可以优选使用与具有导入该突变前的序列的蛋白质相比，可以恰当的使用所述蛋白质的亲和常数(KA)降低至1/2以下的蛋白质，更优选降低1/5以下，进一步优选降低至1/10以下的蛋白质。并且，在某些文献中，将亲和常数记载为结合常数，两者的定义基本上是相同的。第29位的Gly替换为Ala的C结构域突变体对Fab的KA通常在I X l(Tl X IO5 ( M ―1)之间，可以在本发明中优选使用导入了将第29位的Gly替换为Ala的突变和本发明涉及的突变的C结构域突变体，其是KA降低至低于I X IO4 ( M ―1)的变体，更优选适用KA降低至O. 5XlO4( M ―1)以下的该突变体。并且，在上述KA测定中，可以使用通过木瓜蛋白酶解将免疫球蛋白G片段化为Fab片段和Fe片段而获得的Fab，或者可以使用通过基因工程方法获得的、只表达免疫球蛋白G的Fab区域的生产系统制造的Fab。由于本发明的亲和分离基质具有与免疫球蛋白的Fab区域的结合力降低的性质，在用酸性溶液洗提抗体的步骤中，其解离抗体的特性是优异的。具体而言，可以通过更偏中性的酸性洗提条件进行洗提，而获得抑制酸性条件对抗体的破坏的效果。具体而言，普通的酸性洗提条件是ρΗ2. (Γ3. 5左右，相对于此更偏中性的酸性洗提条件是ρΗ3. (Γ5. O左右的条件,此条件下的洗提对抗体的破坏小(Ghose S.等,Biotechnology andbioengineering, 2005,第92卷,第6期)。优异的抗体酸解离特性,是指在更偏中性的酸性洗提条件下解离、在酸性条件下洗提抗体时的洗提峰形更加尖锐这样的特性。层析的洗提峰形变得更尖锐，则可以用更小体积的洗提液回收含有更高浓度的抗体的洗提液。此外，通过使用本发明的亲和分离基质，可以从包括含有Fe区域的分子与只含有Fab区域的分子的混合物中，作为直接通过的级分，方便的分离回收Fab区域。实施例以下基于实施例，对本发明进行更详细地说明，但是本发明不限于这些实施例。对于实施例中获得的各种蛋白质，以“表示结构域的字母-导入的突变(野生型时注为“野生型(wild)”)”的形式表述。例如，蛋白质A的野生型C结构域以“C-野生型”的形式表述，导入G29A突变的C结构域突变体以“C-G29A”的形式表述。对于同时导入2种突变的突变体的表述，用斜杠来表述。例如，导入G29A突变和S33E突变的C结构域突变体以“C-G29A/S33E”的形式表述。此外，对于由多个单结构域连接而成的蛋白质，加入”号，在连接数后添加“d”来组合表述。例如，由5个导入G29A突变和S33E突变的C结构域突变体连接而成的蛋白质以“C-G29A/S33E. 5d”的形式表述。·[实施例I]制造编码C-G29A.5d的DNA由5个C-G29V连接而成的蛋白质的氨基酸序列(C-G29A. 5d，序列号11)进行逆翻译，设计出编码该蛋白质的碱基序列。所述蛋白质的密码子使用频率与桥石短芽孢杆菌HPD31菌株中大量表达的细胞表面蛋白HWP (Ebisu S.著，“J. Bacteriol. ” 1990年，第172期，1312 1320页)的密码子使用频率接近，并且，考虑到使5个结构域之间的碱基序列的序列同一性变低而分配密码子。此外，在编码5连接型结构域的序列的5’端制作PstI，和在3’端制作XbaI的限制性酶识别位点。DNA片段的制造是委托Takara BIO公司完成的。制造的DNA片段的序列记载在序列号12中。用PstI和XbaI (均为TakaraBio公司生产)消化所制造的编码C-G29V. 5d的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化。另一方面，PNK3262是短芽孢杆菌属细菌用的质粒载体，用PstI和XbaI消化后，纯化回收再通过碱性磷酸酶(TakaraBIO公司生产)处理进行脱磷酸化处理。将两者混合后，用Ligation High(T0Y0B0公司生产)连接，构建C-G29V. 5d表达质粒载体pNK3262-C-G29V. 5d。使用由上述操作获得的质粒载体进行桥石短芽孢杆菌FY-I菌株的转化。转化是通过已知的方法由电转法来实施的(“Biosci. Biotech. Biochem.J”，1997年，第61期，202^203页)。此外，桥石短芽孢杆菌FY-I菌株是对桥石短芽孢杆菌HPD31-0K菌株(日本特开平6-296485号公报)进行突变处理获得的Phe、Tyr缺陷性菌株。由所制造的质粒pNK3262-C-G29V. 5d来制造DNA片使其包含各结构域的Val_29的、分成5段的编码C-G29V.5d的基因。从N端开始，各结构域按顺序赋予Γ5的编号。分别用PstI和NarI消化结构域1，用NarI和HindIII消化结构域2，用HindIII和MluI消化结构域3，用MluI和BglII消化结构域4，用BglII和XbaI消化结构域5 (NarI由东洋纺织株式会社生产，其他酶由Takara BIO公司生产)，用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化，获得各DNA片段。使用与用于编码各个结构域的DNA片段所使用的相同的2种限制性酶消化2种两种克隆载体pSL301 (Invitrogen公司生产)和pUC19 (Takara BIO公司生产)，与上述DNA片段混合后，用Ligation High连接，构建具有切割成5份的DNA片段的质粒。在各个质粒中，与结构域所附编号对应的，各个质粒分别表述为pUC19-V29-dl、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29_d4、pSL301-V29_d5。序列号 13 17 中显示了各个 C-G29V. 5d编码区的DNA片段的序列(包含限制性内切酶识别部位)。以 pUC19-V29-dl、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5为模板，使用序列号18-27的寡核苷酸引物实施QuickChange法，制造含有各结构域的 Val-29 被 Ala 替换了的 C-G29A 的 DNA 片段的质粒 pUC19-A29_dl、pUC19-A29_d2、、pSL301-A29-d3、pSL301-A29_d4、pSL301-A29_d5，用 Ligation High 依次连接 5 个片段，构建具有编码C-G29A. 5d(序列号28)的DNA片段(序列号29)的表达质粒PNK3262-C-G29A. 5d,实施FY-1重组菌的转化。QuickChange法是使用DNA聚合酶Pfu Turbo和甲基化DNA(模板DNA)切割酶DpnI (均为Stratagene公司生产),依照Stratagene公司的规程实施的。例如，对于包含序列号13的DNA片段的质粒pUC19-V29_dl,使用序列号18和序列号19这两条合成DNA引物,实施QuickChange法,制造包含结构域I的Val_29被Ala替换的DNA片段的质粒pUC19-A29_dl。 [实施例 2]制造编码 C-G29A/S33E. 5d、C_G29A/D36R· 5d 和 C-G29A/K35R/D37E. 5d的DNA以实施例I制造的含有编码C-G29A的DNA片段的5种质粒，即pUC19-A29_dl、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5 为模板，使用序列号 30 59的寡核苷酸引物，按实施例I相同的方式，采取利用QuickChange法的方法，制造含有C-G29A/S33E、C-G29A/D36R 和 C-G29A/K35R/D37E 的 DNA 片段的质粒。之后，用实施例I中记载的方法将各种DNA片段进行连接，分别制造包含编码C-G29A/S33E. 5d (序列号60)的DNA片段(序列号61)的表达质粒pNK3262_C_G29A/S33E. 5d，包含编码C-G29A/D36R. 5d(序列号62)的DNA片段(序列号63)的表达质粒PNK3262-C-G29A/D36R. 5d,和包含编码 C-G29A/K35R/D37E. 5d (序列号 64)的 DNA 片段(序列号65)的表达质粒pNK3262-C-G29A/K35R/D37E. 5d，实施FY-I重组菌的转化。此外，在连接编码C-G29A的DNA片段时利用限制性酶Hindlll，由于HindIII的识别序列与突变导入位点接近，因此，在制造了将编码未导入突变的结构域2的DNA片段和编码导入了突变的结构域3的DNA片段在HindIII位点连接而成的质粒之后，在编码结构域2的区域中导入相应的突变。此外，以pNK3262-C-G29A/S33E. 5d为模板质粒，使用序列号66 67的寡核苷酸引物，PCR扩增编码C-G29A/S33E. 4d(序列号68)的DNA片段(序列号69)。用PstI和XbaI消化该DNA片段，插入到用相同的酶消化的载体pNK3262中，制造表达质粒pNK3262_C_G29A/S33E. 4d，实施FY-I重组菌的转化。[实施例3] DNA序列确认使用DNA测序仪 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystem 公司生产)，确认实施例I 2所获得的各种表达质粒的DNA碱基序列。使用BigDye Terminator v. I. I循环测序试剂盒(Applied Biosystem公司生产)，根据附带的规程，进行各个质粒DNA的测序PCR反应，纯化所述测序产物，进行序列分析。略去测序中使用的寡核苷酸引物的序列。[实施例4]表达重组菌中目标蛋白质的表达将实施例f 2所获得的各种桥石短芽孢杆菌FY-I重组菌，在含有60 μ g/mL新霉素的5mL 3YC培养基(聚胨(polyp印tone) 3%，酵母提取物O. 2%，葡萄糖3%，硫酸镁O. 01%、硫酸铁O. 001%、氯化锰0. 001%、氯化锌0. 0001%)中，30°C下振荡培养3天。离心处理培养物，分离菌体，从所获得的培养上清液中，利用SPFast Flow柱(GEhealthcare Japan公司生产)进行阳离子交换层析,纯化目标蛋白质(初步纯化)。具体而言，将添加醋酸钠使其终浓度为50禮，再将用盐酸调节至pH4. O的培养上清液加入到用阳离子交换缓冲液A(50mM醋酸-醋酸钠，pH4.0)平衡过的SP Fast Flow柱中，用阳离子交换缓冲液A洗净后，利用阳离子交换缓冲液A和阳离子交换缓冲液B (50mM醋酸-醋酸钠，IM NaCl, pH4. O)的盐浓度梯度，分离中途洗提出的目标蛋白质。然后，在使用DEAE Fast Flow柱(GE healthcare Japan公司生产)的阴离子交换层析中，纯化目标蛋白质。具体而言，在超纯水中透析所分离的目标蛋白质溶液，将其添加到用阴离子交换缓冲液A(50mM Tris-HCl, pH8. O)平衡过的DEAE Fast Flow柱中，用阴离子交换缓冲液A洗净后，利用阴离子交换缓冲液A和阴离子交换缓冲液B (50mM醋酸-醋酸钠，O. 3M NaCl, pH8. O)的盐浓度梯度，分离中途洗提出的目标蛋白质。再次在超纯水中透析所分离的目标蛋白质溶液，以只含有目标蛋白质的水溶液作为最终纯化的样品。此外,上述通过使用柱子的层析进行的蛋白质的纯化,是利用AKTAprime plus系统(GE healthcare Japan公司生产)来实施的。
[实施例5]使用Biacore 3000 (GE HealthCare Japan公司生产)对实施例4中获得的各种蛋白质与免疫球蛋白的亲和性进行解析来解析所获得的蛋白质与人免疫球蛋白G(人IgG)的亲和性，Biacore 3000利用了表面等离子体共振(surface p lasmon resonance)。在本实施例中，利用从人血衆中分级的人免疫球蛋白G制品(下文称为人IgG)。将人IgG固定在传感芯片上，使各种蛋白质流至芯片上，检测两者的相互作用。用氨基偶联法将人IgG固定在传感芯片CM5上，所述氨基偶联法使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-乙基-N’ -(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺氯化物(EDC)进行，使用乙醇胺进行封闭(传感芯片和固定化试剂都是GE HealthCare Japan公司生产的)。将Gammagard (Baxter公司生产)按I. Omg/ml溶解在标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4,150mMNaCl,pH7. 4)中，调制人IgG溶液。用固定化用缓冲液(IOmM醋酸-醋酸钠，pH4. 5)将人IgG溶液稀释100倍，依照Biacore 3000附带的规程，将人IgG固定在传感芯片上。此外，对于芯片上其他的流动池，在用EDC/NHS活化后，进行乙醇胺固定的处理，准备好作为阴性对照的参照池。使用上样缓冲液(20mMNaH2PO4-Na2HPO4,150mM NaCl，O. 005%Ρ_20, ρΗ7· 4)，在 IO^lOOOnM 的范围内恰当配制(将各种蛋白质分别配制3种不同的蛋白质浓度的溶液)各种蛋白质，将各种蛋白质溶液以20 μ Ι/min的流速利用30秒添加至传感芯片中。测定温度为25°C，依次观测添加时(结合相，30秒)和添加结束后(解离相，60秒)的结合反应曲线。在各种观测结束后，添加50mMNa0H(15秒)，使传感芯片再生(目的是去除传感芯片上残留的添加蛋白质，确认固定化的人IgG的结合活性几乎完全恢复)。针对所获得的结合反应曲线(减去参照池的结合反应曲线的结合反应曲线)，使用系统附带的BIA evaluation软件，通过I: I结合模型进行适合度解析，计算出结合速率常数(km)、解离速率常数(kj、亲和常数(KA=km/\ff)和解离常数(KD=koff/kon) ο根据表I所示，各种蛋白质与人IgG的结合参数和C-G29A. 5d(比较例I)是相同程度的。具体而言，对于任一种蛋白质，与人IgG的亲和常数(Ka)落入5. O X ΙΟΙ1 5. OXlO8M-1的范围。表I
权利要求
1.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中， 所述蛋白质具有下述氨基酸序列在来源于 选自蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的至少一个结构域的氨基酸序列中，将至少I个氨基酸取代突变导入至A、B和C结构域的第37位的氨基酸残基、E结构域的第29 35位的氨基酸残基、或D结构域的第34 40位的氨基酸残基中而得到的氨基酸序列，所述蛋白质A的E、D、A、B和C结构域由序列号f 5所记载， 与导入突变前的蛋白质相比，所述蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低。
2.权利要求I所记载的蛋白质，其中，导入突变前的来源于结构域的氨基酸序列是 序列号I飞所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列，或 序列号6 10所记载的来源于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列。
3.权利要求I或2所记载的蛋白质，其中，导入突变前的来源于结构域的氨基酸序列是 序列号5所记载的蛋白质A的C结构域的氨基酸序列，或 序列号10所记载的来源于蛋白质A的C结构域的氨基酸序列。
4.权利要求广3中任一项所记载的蛋白质，其中，在导入突变前的氨基酸残基中， 各结构域中的对应于C结构域的第33位的氨基酸残基是Ser， 各结构域中的对应于C结构域的第35位的氨基酸残基是Lys， 各结构域中的对应于C结构域的第36位的氨基酸残基是Asp，或 各结构域中的对应于C结构域的第37位的氨基酸残基是Asp。
5.权利要求广4中任一项所记载的蛋白质，其中，所导入的氨基酸取代突变是 将对应于C结构域的第33位的Ser取代为Glu、Leu或Thr的突变， 将对应于C结构域的第35位的Lys取代为Arg的突变， 将对应于C结构域的第36位的Asp取代为Arg或Ile的突变，或 将对应于C结构域的第37位的Asp取代为Glu的突变。
6.权利要求5所记载的蛋白质，其中，所导入的氨基酸取代突变是将对应于C结构域的第33位的Ser取代为Glu的突变。
7.一种蛋白质，其是将2个以上的权利要求I飞中任一项所记载的蛋白质相互连接而得到的由多个结构域所构成的蛋白质。
8.权利要求7所记载的蛋白质，其中，相互连接的蛋白质是不同种类的蛋白质。
9.权利要求7或8所记载的由多个结构域构成的蛋白质，其中，相互连接的蛋白质的个数为2、个。
10.编码权利要求广9中任一项所记载的蛋白质的DNA。
11.权利要求10所记载的DNA，其中， 构成相互连接的结构域的碱基序列的序列同一性在90%以下。
12.含有权利要求10或11所记载的DNA的载体。
13.用权利要求12所记载的载体对宿主进行转化而得到的转化体。
14.权利要求13所记载的转化体，其中 宿主是革兰氏阳性菌。
15.权利要求14所记载的转化体，其中，革兰氏阳性菌是短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌。
16.权利要求15记载的转化体，其中， 短芽孢杆菌属细菌是桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)。
17.权利要求I、中任一项所记载的蛋白质的制造方法，该方法采用权利要求13 16中任一项所记载的转化体，或者采用使用了权利要求10或11所记载的DNA的无细胞蛋白质合成体系。
18.权利要求17所记载的制造方法，其中， 将蛋白质积蓄在转化体的细胞内和/或周质区域中，和/或将蛋白质分泌到转化体的细胞外。
19.亲和分离基质，其中， 该亲和分离基质是将权利要求广9中任一项所记载的蛋白质作为亲和配体固定于由水不溶性基体材料构成的担载体而得到。
20.权利要求19所记载的亲和分离基质，其中， 水不溶性基体材料包括合成高分子或多糖类。
21.权利要求20所记载的亲和分离基质，其中，多糖类是纤维素。
22.权利要求19 21中任一项所记载的亲和分离基质，其中， 该亲和分离基质与含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质结合。
23.权利要求22所记载的亲和分离基质，其中， 含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质是免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物。
24.权利要求1扩23中任一项所记载的亲和分离基质在分离含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质中的用途。
25.权利要求24所记载的亲和分离基质的用途，其中， 分离含有免疫球蛋白的Fe区域的蛋白质是以分离回收只含有免疫球蛋白的Fab区域的蛋白质为目的。
全文摘要
本发明的目的是制作出新的修饰型蛋白质A配体，其具有比现有的修饰型蛋白质A配体更好的抗体酸解离特性。本发明提供了对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中该蛋白质是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列相对于来源于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的任何结构域的氨基酸序列，将至少1个氨基酸取代突变导入至在与所有结构域中都保守的、A、B和C结构域的第31~37位(E结构域的第29~35位，D结构域的第34~40位)相对应的氨基酸残基上而得到的氨基酸序列，并且，与具有导入该突变前的氨基酸序列的蛋白质相比，本发明的蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低。
文档编号C12N15/09GK102844432SQ201180015330
公开日2012年12月26日 申请日期2011年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者吉田慎一, 村田大, 平良俊一, 高野昌行, 井口惠太, 中野喜之 申请人:株式会社钟化