专利名称：具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒与其制备方法及体外评价方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化铁纳米颗粒的制备方法，具体地说是具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒与其制备方法及体外评价方法。
背景技术：
我国每年大约有250万名新增癌症病人，其中大多数在确诊时，已进入癌症中晚期。如果要实现对肿瘤的有效治疗，重要的一点是能通过各种技术来实现肿瘤的早期诊断。 因此，检查技术优劣直接关系到癌症治疗效果的好坏。肿瘤纳米技术与纳米药物研究刚刚起步，需要利用纳米技术、生物学、化学、物理、 医学、药学和公共卫生等领域的知识和研究手段。纳米药物既是国际科学前沿，也是与人类健康和生活密切相关的重要社会问题，充满了创新的机遇。随着纳米研究的深入和人们对纳米控制能力的提高，纳米技术为工程科技研究和技术变革带来了激动人心的机会。就医药科学而言，纳米技术有望在癌症、心血管病、糖尿病、脊髓损伤等的药物治疗等领域取得突破。纳米技术将对生物医学研究中产生新的变革， 并将为疾病的预防、检测、早期诊断和治疗提供新的方法和药物。纳米药物全新的治疗机理将有可能从观念上改变人类疾病预防和治疗的模式和途径，是取得纳米药物研究突破的关键，但是难度也更大。纳米科学的快速进步，为生物医药的发展带来了新的机遇。如何通过发展和利用纳米技术去预防、检测、早期诊断和治疗人类疾病，如何确保纳米药物的安全性是摆在各国科学家面前的极富挑战的课题。癌症是21世纪最具挑战性的医学问题之一。尽管为攻克癌症，中外科学家进行了数十年的不懈努力，但至今绝大多数的癌症的预防、早期诊断和治疗仍不尽如人意。世界范围内癌症的死亡率居高不下，成为人类主要健康“杀手”。纳米技术为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的思路和方法。科学发现，人类的一些恶性肿瘤细胞具有对于叶酸受体的高表达。如果能制备一种具有叶酸配体修饰的靶向试剂或药物就能很好地检测和治疗癌症。虽然很多专利可能都提到了如何制备四氧化三铁氧化铁纳米颗粒等，但是制备葡聚糖-氧化铁纳米粒或叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的方法由于制备工艺本身就具有经验性的特点，而且，各专利发明人或者厂家对于工艺细节的刻意保密，公开提供的信息有限， 使得许多文献中提到的许多制备方法和实验方案难以重复实施，或者即使能够重复实施， 所制得的纳米颗粒或其悬液等状态也不稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状，而提供核心是氧化铁，其外壳主要为叶酸的氧化铁纳米颗粒，能有效识别肿瘤细胞的具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒与其制备方法及一种体外评价方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为
具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒，其中，氧化铁纳米颗粒以氧化铁为内核，该氧化铁纳米颗粒的表面以叶酸进行共价修饰。为优化上述技术方案，采取的措施还包括
氧化铁纳米颗粒的表面吸附有活性剂粒子，所述的活性剂粒子为葡聚糖分子；该氧化铁纳米颗粒为叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒。制备经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒的方法，其中，包括以下步骤 步骤1、合成!^e3O4粒子悬浮液；
步骤2、将以去离子水为载液的葡聚糖溶液与!^e3O4粒子悬浮液混合后加热、回流，冷却后透析，离心过滤，得稳定的葡聚糖-氧化铁纳米粒悬浮液；
步骤3、取步骤2制备的葡聚糖-氧化铁纳米粒悬浮液，加入一半体积的无水乙醇，离心处理，倾去上清液，取沉淀物，并将沉淀物分别用无水乙醇、二甲亚砜清洗，再经无水二甲亚砜超声分散，得葡聚糖-氧化铁纳米粒的无水二甲亚砜溶液；
步骤4、将无水二甲亚砜加至叶酸溶液并搅拌使其充分溶解后，再加入二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺溶液，避光，充氮，待混合液反应后，过滤出去沉淀物，将过滤后溶液加入含丙酮的乙醚溶液中，充分搅拌，滤去溶液，将余物真空干燥即得叶酸活性
步骤5、将叶酸活性酯加入葡聚糖-氧化铁纳米粒的无水二甲亚砜溶液，使叶酸活性酯溶解，充氮，避光，加热，并加入三乙胺作为催化剂，待溶液停止反应后，对溶液进行磁性分离，并对分离物分别用无水乙醇和蒸馏水清洗，真空干燥，即得叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒。步骤1中的Fe53O4粒子悬浮液的制备方法为采用混合有狗3+和狗2+的铁盐溶液，无氧条件下，加入碱溶液，通氮除氧处理，快速搅拌并逐渐加温，待其反应后滤去上层液体，得到!^e3O4沉淀物，将R3O4沉淀物加少量蒸馏水超声分散，透析过滤得!^e3O4粒子悬浮液。Fe3+和!^2+的铁盐溶液中三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2:1至3:2之间，且PH 值为2至4之间，加碱液过程中，PH值逐步变化为9至11，最高不得超过12，快速搅拌并逐渐加温至55°C，最高不得超过60°C。步骤2中葡聚糖溶液中的葡聚糖与加入葡聚糖溶液的铁之间的质量比为5:1，且混合后的溶液加热至100°c回流时间为1小时。步骤4中的过滤后溶液逐滴在充分搅拌的情况下加入到5°C以下含30%丙酮的乙醚溶液中。体外评价经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒的肿瘤细胞叶酸受体靶向性的方法， 其特征是将相同的口腔表皮癌细胞株分为A、B两组，将叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒与A 组细胞株孵化，葡聚糖-氧化铁纳米粒与B组细胞株孵化，然后采用菲洛嗪法测定细胞内铁含量、普鲁士蓝铁染色法定量和定性考察叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒与葡聚糖-氧化铁纳米粒的肿瘤选择性。菲洛嗪法测定细胞内铁含量的方法是将人口腔表皮癌细胞悬液以每孔2*105接种于12孔板中，每孔体积1ml，接种两个板，孵化24h后，用PBS溶液充分洗涤两遍，在两板分别加入同纳米粒浓度的葡聚糖-氧化铁纳米粒和叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的全培溶
5液，并各做三个复孔，且分别以未加入人口腔表皮癌细胞、但已加入等浓度纳米粒的培养基溶液作为对照，同时以只有人口腔表皮癌细胞而未加纳米粒的孔作为控制、未加入人口腔表皮癌细胞及纳米粒的孔作为空白，对结果进行校正。细胞置于37°C培养箱继续培养Mh 后，用PBS溶液充分洗涤三次，然后将人口腔表皮癌细胞混悬于500 μ 1的0. OlMHCl溶液中，向每个孔内加入由等体积4. 5%ΚΜη04溶液和2%HC1且在临用时混合的试剂A，于60°C下反应2小时，待冷却至室温，加入50μ 1由6. 5mM菲洛嗪、13. ImM锌铜试剂、2M维生素C、5M 乙酸铵组成的试剂B，反应10分钟后，用酶标仪于490nm波长处读数。普鲁士蓝铁染色法是将孵化M小时的A组细胞株和B组细胞株分别加入普鲁士蓝染色，观察两组细胞株的颜色浓度。与现有技术相比，本发明的具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒，其中，氧化铁纳米颗粒以氧化铁为内核，该氧化铁纳米颗粒的表面以叶酸进行共价修饰。体外肿瘤细胞靶向作用的机理源于人类的一些恶性肿瘤细胞对于叶酸受体的高表达。经过试验检测，叶酸受体高表达的叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒组的人口腔表皮癌细胞内铁含量高于未经叶酸修饰的葡聚糖-氧化铁纳米粒组，可见叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒具有比较强的肿瘤靶向性。如果要实现对肿瘤的有效治疗，重要的一点是能通过各种技术来实现肿瘤的早期诊断。因此，检查技术优劣直接关系到癌症治疗效果的好坏。叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的研发将有效提升肿瘤早期诊断的成功率。
具体实施例方式以下对本发明的实施例作进一步详细描述。本发明的氧化铁纳米颗粒采用化学共沉淀法进行制备。采用混合有!^3+和 Fe2+的铁盐溶液(如=FeCl2, FeCl3> FeSO4、Fe2 (S04) 3、柠檬酸铁、草酸亚铁、磷酸铁、富马酸亚铁、硫酸铁胺、硫酸亚铁胺、柠檬酸铁胺及硝酸盐、盐酸盐等)，其三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2:1至3:2之间，在25°C、无氧条件下，加入碱溶液(氨水、NaOH，最佳浓度为0. 5mol/L)，PH初始值为3. 0，加碱液过程中，逐步变化为9至11，最高不得超过 12 ；通氮(如果不能达到无氧环境，在有氧情况下，制备出的颗粒会发生变化，其反应式为:Fe304+0 . 2 502+4. 5H20 — 3Fe (OH) 3,这就造成了制备的颗粒的理化性质的不稳定。所以，为防止这一现象的发生，在制备过程中采取通氮的方法除掉溶液中的氧，同时还能达到降低氧化铁纳米颗粒的粒径的作用)、快速搅拌并逐渐加温至阳！，最高不得超过 60°C。反应时间为30分钟，完全沉淀而制备出(黑色沉淀物)。化学反应式为Fe2+ + 2Fe3++80r-Fe3O4丨+4H20，静置，倾去上层液体，水洗4次后，加少量蒸馏水超声分散10分钟，透析过滤得!^e3O4粒子悬浮液(一种胶体溶液)。但此液体如长时间放置(例如几天)会发生相分离，产生聚沉或聚析现象。故而需要一种含有某种表面活性剂的载液，使I^e3O4表面吸附表面活性剂，稳定存在于载液中。2、葡聚糖-氧化铁纳米粒的制备
由于葡聚糖在人体内无毒、无抗原性、可降解，具有很好的生物相容性和生物可溶解性，是一种理想的表面活性剂，此外，葡聚糖分子上的活性羟基经化学修饰，可连接具有生物活性的多功能分子，如叶酸，根据链接的基团或分子不同，制备出的氧化铁纳米颗粒可以扩展作为靶向药物载体、分子影像标记物等不同用途。
因此，我们选择葡聚糖(按照葡聚糖与铁含量质量比5:1的比例，铁含量在上述制备的狗304粒子悬浮液采用比色法测定)作为包衣材料，以去离子水为载液，与上述制备的 !^e3O4粒子悬浮液混合后加热至100°C回流1小时，冷却后透析，离心过滤，即得稳定的葡聚糖-氧化铁纳米粒悬浮液。用激光散射粒度测定仪测得此法制得的!^e3O4氧化铁纳米颗粒粒径为18-20nm左右(激光光源的波长为663nm，测试温度为25°C )，表面吸附葡聚糖后，其整体粒径约为35nm
左右ο3、以叶酸进行共价修饰
取上述制备的葡聚糖-氧化铁纳米粒悬浮液，加入一半体积的无水乙醇，高速离心，倾去上清液，取沉淀用无水乙醇、二甲亚砜各洗三遍，无水二甲亚砜超声分散，得葡聚糖-氧化铁纳米粒的无水二甲亚砜溶液。另称取叶酸300mg，加入IOml无水二甲亚砜，搅拌使其充分溶解后，加入二环己基碳二亚胺(DDC) 99mg, N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 78mg,加入500 μ 1三乙胺溶液，避光，充氮反应过夜，过滤除去反应的副产物，减压蒸馏除去部分溶剂后，逐滴在充分搅拌的情况下加入到冰冷的含30%丙酮的乙醚溶液中，过滤，真空干燥即得产物叶酸活性酯。将叶酸活性酯加入上述葡聚糖-氧化铁纳米粒的无水二甲亚砜溶液，充分涡旋使叶酸活性酯溶解，充氮，避光，加热至50°C，加入三乙胺作为催化剂，反应4小时。停止反应后，磁性分离，用无水乙醇和蒸馏水各洗三遍，真空干燥，即得产物叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒，其粒径约为50nm。4、叶酸受体肿瘤靶向作用的体外验证方法。为了体外评价叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的叶酸受体肿瘤靶向性，以未经叶酸修饰的葡聚糖-氧化铁纳米粒作为对照，以细胞表面叶酸受体高表达的人口腔表皮癌细胞 (KB细胞)作为模型(经从液氮罐中取出复苏、传代、冻存、配制培养液制成单细胞悬液)，分别将叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒或葡聚糖-氧化铁纳米粒与该细胞株孵化Mh，菲洛嗪法测定细胞内铁含量、普鲁士蓝铁染色法定量和定性考察其肿瘤选择性。菲洛嗪法测定细胞内铁含量将制得的KB细胞悬液以每孔2*105接种于12孔板中，每孔体积1ml，接种两个板，孵化24h后，用PBS溶液充分洗涤两遍，在两板分别加入同纳米粒浓度的葡聚糖-氧化铁纳米粒和叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的全培溶液，并各做三个复孔，且分别以未加入细胞、但已加入等浓度纳米粒的培养基溶液作为对照，同时以只有细胞而未加纳米粒的孔作为控制、未加入细胞及纳米粒的孔作为空白，对结果进行校正。细胞置于37°C培养箱(5%C02)继续培养24h后，用PBS溶液充分洗涤三次，混悬于500 μ 1的 0. OlMHCl溶液中，向每个孔内加入试剂A (等体积4. 5%ΚΜη04溶液和2%HC1、临用时混合)， 于60°C下反应2小时，待冷却至室温，加入50 μ 1试剂B (6. 5mM菲洛嗪、13. ImM锌铜试剂、 2M维生素C、5M乙酸铵)反应10分钟后，用酶标仪于490nm波长处读数，发现叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒组，细胞内铁含量明显高于葡聚糖-氧化铁纳米粒组。普鲁士蓝染色法考察KB细胞与含叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒培养基孵化Mh， 普鲁士蓝染色，细胞被染成亮蓝色，而含葡聚糖-氧化铁纳米粒培养基与KB细胞孵化24h 后，只有少许细胞被染成浅蓝色。结果与菲洛嗪法测定结果一致。综上所述，本专利公开了一种具有体外肿瘤细胞靶向作用的基于叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒的制备方法。其体外肿瘤细胞靶向作用的机理源于人类的一些恶性肿瘤细胞对于叶酸受体的高表达。本例中，叶酸受体高表达的叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒组的 KB细胞内铁含量高于未经叶酸表面修饰组，叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒通过叶酸受体调控的内吞机制进入KB细胞，可见叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒具有比较强的肿瘤靶向性。
本发明的最佳实施例已阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
权利要求
1.具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒，其特征是氧化铁纳米颗粒以氧化铁为内核，该氧化铁纳米颗粒的表面以叶酸进行共价修饰。
2.根据权利要求1所述的具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒，其特征是所述的氧化铁纳米颗粒的表面附有活性剂粒子，所述的活性剂粒子为葡聚糖分子；该氧化铁纳米颗粒为叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒。
3.制备如权利要求1所述的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒的方法，其特征是包括以下步骤步骤1、合成!^e3O4粒子悬浮液；步骤2、将以去离子水为载液的葡聚糖溶液与!^e3O4粒子悬浮液混合后加热、回流，冷却后透析，离心过滤，得稳定的葡聚糖-氧化铁纳米粒悬浮液；步骤3、取步骤2制备的葡聚糖-氧化铁纳米粒悬浮液，加入一半体积的无水乙醇，离心处理，倾去上清液，取沉淀物，并将沉淀物分别用无水乙醇、二甲亚砜清洗，再经无水二甲亚砜超声分散，得葡聚糖-氧化铁纳米粒的无水二甲亚砜溶液；步骤4、将无水二甲亚砜加至叶酸溶液并搅拌使其充分溶解后，再加入二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺溶液，避光，充氮，待混合液反应后，过滤出去沉淀物，将过滤后溶液加入含丙酮的乙醚溶液中，充分搅拌，滤去溶液，将余物真空干燥即得叶酸活性步骤5、将叶酸活性酯加入葡聚糖-氧化铁纳米粒的无水二甲亚砜溶液，使叶酸活性酯溶解，充氮，避光，加热，并加入三乙胺作为催化剂，待溶液停止反应后，对溶液进行磁性分离，并对分离物分别用无水乙醇和蒸馏水清洗，真空干燥，即得氧化铁纳米颗粒，该氧化铁纳米颗粒为叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤1中的!^e3O4粒子悬浮液的制备方法为采用混合有狗3+和狗2+的铁盐溶液，无氧条件下，加入碱溶液，通氮除氧处理，快速搅拌并逐渐加温，待其反应后滤去上层液体，得到!^e3O4沉淀物，将!^e3O4沉淀物加少量蒸馏水超声分散，透析过滤得狗304粒子悬浮液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述的1 3+和1 2+的铁盐溶液中三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2 1至3 2之间，且PH值为2至4之间，加碱液过程中，PH值逐步变化为9至11，最高不得超过12，快速搅拌并逐渐加温至55°C，最高不得超过60°C。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤2中葡聚糖溶液中的葡聚糖与加入葡聚糖溶液的铁之间的质量比为5:1且混合后的溶液加热至100°C回流时间为1 小时。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的步骤4中的过滤后溶液逐滴在充分搅拌的情况下加入到5°C以下含30%丙酮的乙醚溶液中。
8.体外评价如权利要求1所述的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒的方法，其特征是将相同的口腔表皮癌细胞株分为A、B两组，将叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒与A组细胞株孵化，葡聚糖-氧化铁纳米粒与B组细胞株孵化，然后采用菲洛嗪法测定细胞内铁含量、 普鲁士蓝铁染色法定量和定性考察叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒与葡聚糖-氧化铁纳米粒的肿瘤选择性。
9.根据权利要求8所述的体外评价方法，其特征是所述的菲洛嗪法测定细胞内铁含量的方法是将人口腔表皮癌细胞悬液以每孔2*105接种于12孔板中，每孔体积1ml，接种两个板，孵化24h后，用PBS溶液充分洗涤两遍，在两板分别加入同纳米粒浓度的葡聚糖-氧化铁纳米粒和叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的全培溶液，并各做三个复孔，且分别以未加入人口腔表皮癌细胞、但已加入等浓度纳米粒的培养基溶液作为对照，同时以只有人口腔表皮癌细胞而未加纳米粒的孔作为控制、未加入人口腔表皮癌细胞及纳米粒的孔作为空白，对结果进行校正；细胞置于37°C培养箱继续培养24h后，用PBS溶液充分洗涤三次，然后将人口腔表皮癌细胞混悬于500 μ 1的0. OlMHCl溶液中，向每个孔内加入由等体积 4. 5%ΚΜη04溶液和2%HC1且在临用时混合的试剂A，于60°C下反应2小时，待冷却至室温，加入50 μ 1由6. 5mM菲洛嗪、13. ImM锌铜试剂、2M维生素C、5M乙酸铵组成的试剂B，反应10 分钟后，用酶标仪于490nm波长处读数。
10.根据权利要求8所述的体外评价方法，其特征是所述的普鲁士蓝铁染色法是将孵化M小时的A组细胞株和B组细胞株分别加入普鲁士蓝染色，观察两组细胞株的颜色浓度。
全文摘要
本发明公开了具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒与其制备方法及体外评价方法，所制得的具有体外肿瘤靶向作用的经叶酸配体修饰的氧化铁纳米颗粒对体外肿瘤细胞具有靶向作用，其机理源于人类的一些恶性肿瘤细胞对于叶酸受体的高表达。经过试验检测，叶酸受体高表达的叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒组的人口腔表皮癌细胞内铁含量高于未经叶酸修饰的葡聚糖-氧化铁纳米粒组。叶酸-葡聚糖-氧化铁纳米粒的研发将有效提升肿瘤早期诊断的成功率。
文档编号C12Q1/02GK102539760SQ201210029970
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月11日 优先权日2012年2月11日
发明者刘 东 申请人:刘 东