专利名称：无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法
技术领域：
本发明专利属于骨髓间充质干细胞培养领域，具体涉及到一种无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法。
背景技术：
骨髓间充质干细胞位于骨髓的基质细胞系中，属于多潜能成体干细胞，不仅能分 化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞等中胚层组织，而且能向神经细胞、肝细胞、胰岛细胞等外胚层和内胚层组织分化。骨髓间充质干细胞由于具有易被分离获取、高分裂增殖性、多组织分化潜能、免疫抑制性、便于自体移植、伦理的合法化等诸多优点，是当前干细胞研究领域的热点之一。干细胞缺乏的疾病如眼部碱烧伤、皮肤热烧伤等在临床治疗中相当棘手。干细胞的发现及干细胞移植的应用给这些患者带来一线希望。而骨髓间充质干细胞因其多潜能性的特点成为治疗此类疾病的主要种子细胞之一。如何将其移植于体表成为研究的热点。目前，较成熟的方法是将其接种于脱细胞的羊膜上形成羊膜复合干细胞膜片。但是，羊膜并非完全透明的组织，因此透过羊膜观察细胞状态及细胞密度较困难，此外羊膜具有降解速度快、降解产物堆积的不良之处。目前，组织工程领域一直在寻找一种能够使培养的干细胞完整脱落形成膜片用于临床治疗的材料。研究较多的是温敏材料，希望通过温度的改变使细胞脱离，虽然取得了一定的效果，但仍不成熟。乙二胺四乙酸(EDTA)是一种二价阳离子螯合剂，而细胞表面很多与培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有钙镁离子的，因此，加入EDTA后可以螯合这些二价离子，使细胞和培养皿脱离。
发明内容
本发明的目的是提供一种无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，为临床提供可供移植的单纯细胞膜片。本发明制备方法如下首先，用贴壁法将骨髓间充质干细胞培养于培养皿中，隔天全量换干细胞培养基一次，待骨髓间充质干细胞完全融合后，再培养7天以上作为待用的骨髓间充质干细胞；然后，取待用的骨髓间充质干细胞，用不含二价阳离子的缓冲液冲洗2次以上，在培养皿中加入配置好的二价阳离子螯合剂，待骨髓间充质干细胞膜片脱离培养皿，去除培养皿中的螯合剂，即获得无载体骨髓间充质干细胞膜片；最后，将无载体骨髓间充质干细胞膜片用干细胞培基冲洗2次以上，再加入干细胞培基保存。使用时用镊子夹住制备好的骨髓间充质干细胞膜片一角或者将整个植片吸入枪头内，置于需要移植的部位，加入少量生理盐水或平衡盐溶液，将其展平，然后进行缝合/粘合固定，用接触镜、半透膜或者人工合成材料等进行覆盖，定期观察被移植部位状态。本发明是利用二价阳离子螯合剂螯合细胞表面与培养皿或培养瓶结合的蛋白上的钙镁离子使细胞和培养皿脱离的原理而实现的，相比以往的细胞膜片，本发明避免了载体代谢所产生的不良作用；该操作方法简单、经济、对细胞无害，得到纯细胞膜片，细胞密度大；膜片上的细胞可以通过显微镜轻易观察。
具体实施例方式本发明专利以BN大鼠的骨髓间充质干细胞为材料制成无载体的骨髓间充质干细胞膜片，具有骨髓间充质干细胞的特性，用于治疗干细胞缺乏等疾病的移植治疗。 本发明的制备方法一、骨髓间充质干细胞的培养无菌条件下取IOOg 150g的BN大鼠双侧股骨、胚骨入无菌皿中带入无菌操作台中。0. 9%氯化钠注射液冲洗下肢骨，无菌组织剪刀将股骨、胫骨表面软组织去除干净，0. 9%氯化钠注射液冲洗股骨、胫骨。20ml无菌注射器吸取IOml骨髓间充质干细胞培基(含10%胎牛血清FBS+90% DMED液体)反复冲洗股骨、胫骨的骨髓腔，冲洗液入培养皿中37°C,5% CO2饱和湿度条件下培养，培养48小时进行首次换液，以后每2天换液I次，去除未贴壁的细胞，待细胞融合后，用胰蛋白酶消化，按I : 3传代培养，每2天换液I次，融合后，继续传代。该发明取用的是培养于35mm塑料培养皿中的P2代骨髓间充质干细胞，细胞融合后每日换液继续培养七天以上备用。二、乙二胺四乙酸(EDTA)的配制将20mgEDTA溶于IOOml不含二价阳离子、PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或D-HankJ s液中制得0. 02% EDTA,滤膜孔径为0. 22 y m的无菌滤器将上述EDTA液体过滤置于无菌容器中，用时用无菌的PBS或D-Hank’ s液稀释，浓度范围在0. 01 % 0. 004%之间均可。三、无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备将备好的带有骨髓间充质干细胞的培养皿从孵箱中取出，置于无菌操作台，吸净培养皿中的干细胞培基，将无菌PBS或D-Hank’ s液2ml加入培养皿中以洗去培养皿内残余培基中的二价阳离子，吸净，重复一次以上。加入稀释好的乙二胺四乙酸(EDTA)液体100 L，培养皿周边的骨髓间充质干细胞首先脱离培养皿，脱离的骨髓间充质干细胞与相邻骨髓间充质干细胞相连形成片状，骨髓间充质干细胞脱离范围从周边逐渐向中央发展，最终完全脱离，形成无载体骨髓间充质干细胞膜片，随骨髓间充质干细胞的脱离，无载体骨髓间充质干细胞膜片逐渐缩小变厚。完全脱离时间为40秒 I分钟，脱离后无载体骨髓间充质干细胞膜片面积大小为皿底的1/3，无载体骨髓间充质干细胞膜片所含细胞数量为IO6数量级。
权利要求
1.一种无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是 首先，用贴壁法将骨髓间充质干细胞培养于培养皿中，隔天全量换干细胞培养基一次，待骨髓间充质干细胞完全融合后，再培养7天以上作为待用的骨髓间充质干细胞； 然后，取待用的骨髓间充质干细胞，用不含二价阳离子的缓冲液冲洗2次以上，在培养皿中加入配置好的二价阳离子螯合剂，待骨髓间充质干细胞膜片脱离培养皿，去除培养皿中的螯合剂，即获得无载体骨髓间充质干细胞膜片； 最后，将无载体骨髓间充质干细胞膜片用干细胞培基冲洗2次以上，再加入干细胞培基保存。
2.根据权利要求I所述的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是所述不含二价阳离子的缓冲液为PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或D-Hank’ s液。
3.根据权利要求I所述的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是所述配置好的二价阳离子螯合剂为浓度在0.01% 0.004%之间的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述乙二胺四乙酸(EDTA)配置方法为将20mg乙二胺四乙酸(EDTA)溶于IOOmlPH值为7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或D_Hank’ s液中配置成浓度为0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，再将0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液稀释，获得浓度范围在0.01% 0. 004%之间的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。
5.根据权利要求I所述的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征是加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液后，培养皿周边的骨髓间充质干细胞首先脱离培养皿，脱离的骨髓间充质干细胞与相邻骨髓间充质干细胞相连形成片状，骨髓间充质干细胞脱离范围从周边逐渐向中央发展，最终完全脱离，形成无载体骨髓间充质干细胞膜片，随骨髓间充质干细胞的脱离，无载体骨髓间充质干细胞膜片逐渐缩小变厚。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是35mm大小的培养皿完全脱离时间为40秒 I分钟，脱离后无载体骨髓间充质干细胞膜片面积大小为皿底的1/3，无载体骨髓间充质干细胞膜片所含细胞数量为IO6数量级。
7.—种如权利要求I 6中任意一种方法制得的无载体骨髓间充质干细胞膜片，其特征是无载体骨髓间充质干细胞膜片的细胞密度大；可以有效避免因载体代谢所产生的不良作用；无载体骨髓间充质干细胞膜片经胰酶消化、培养后，其增殖能力、形态及活性无明显改变。
全文摘要
一种无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法。首先用贴壁法培养骨髓间充质干细胞于培养皿中，细胞融合后继续培养7天以上，磷酸盐缓冲液(PBS)或D-Hank’s液冲洗两次，将浓度范围在0.01％～0.004％之间的乙二胺四乙酸(EDTA)100μL加入皿中，细胞膜片逐渐从周围向中央脱离培养皿，完全脱离后，吸除EDTA液，培基轻轻冲洗两次上述膜片后，再次加入培基备用。相比以往有载体的细胞膜片，本发明制备的膜片细胞密度大；操作方法简单、经济；膜片上的细胞可轻易通过显微镜观察；植入体内避免了载体代谢所产生的不良作用；膜片脱离后经胰酶消化、培养，细胞增殖能力、形态及活性无明显改变。
文档编号C12N5/0775GK102628028SQ20121009079
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者彭荣梅, 洪晶, 靳瑛 申请人:北京大学第三医院