专利名称：骨形成蛋白-2的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2 ；BMP-2)的制备方法，特别地，本发明涉及藉由改变培养基成分来増加骨形成蛋白_2的产量。
背景技术：
骨形成蛋白，简称BMPs，为骨基质中的糖蛋白聚胜肽，其包含双硫键结构。骨形成蛋白的分子量介于26，000-32，000，属于生长因子家族，且彼此具有类似的结构及功能。迄今为止，已发现43种骨形成蛋白。骨形成蛋白为ー种区域性的生长因子，可単独促进骨组织的形成，促使未分化间叶细胞(mesenchymal cells)进入软骨及骨。骨形成蛋白具有各种促进骨生成的能力。
BMPs的能力不限于骨生成，在其它组织，例如脑及肾脏也可发现高浓度的BMPs。已有相关文献揭露BMPs在发生及分化上可能也扮演重要的角色(Wall，N.A. , Blessing, M. , Wright, C. V. E. , and Hogan, B. L. M. , J Cell Biol.，120:493-502 (1993);Ozkaynak, E. , Schnegelsberg, P. N. J. , Jin, D. F. , Clifford, G. M. , Warren, F. D. , Drier, E.A. , and Oppermann, H. , J. Biol. Chem. , 267: 25220-25227 (1992) ; Lyons, K. M. , Jones, C.M. , and Hogan, B. L. M. , Trends in Genetics, 7:408-412 (1991))。目前，BMPs 已被证实可促进神经细胞分化(Basler, K. , Edlund, T. , Jessell, T. M. , and Yamada, T. , Cell, 73:687-702(1993) ;Paralkar, V. M. , Weeks, B. S. , Yu, Y. M. , Kleinman, H. K.，and Reddi1A. H.，J. CellBiol.，119:1721-1728(1992))。在整个BMP家族中，BMP-2具有广泛的骨生成能力，且被研究的最为透彻。具有骨生成活性的重组人类BMP-2已被证明具有安全性，可应用于骨的治疗及再生。BMP-2的应用对传统骨科、整型外科、牙周和颅面重建手术产生重大的影响。目前获得BMP-2的方法主要有ニ种，分别为由脱I丐皮质骨(demineralized cortical bone)萃取BMP-2蛋白，和利用表达系统表达重组BMP-2蛋白。由骨组织分离BMP-2蛋白的方法需要大量的骨组织且产量非常低，每40kg的牛骨粉仅可获得约 40 ii g 的 BMP 混合物(ffozney etal.，Science 242 (1988)，1528-1534)。再者，若由人骨组织分离BMP-2蛋白，会产生道徳上的问题，且会有致病源污染的风险(贾库氏症、HCV等)。同样，由猪或牛分离BMP同源蛋白也会产生类似的污染风险。因此，目前主要是通过表达重组BMP-2来获得BMP-2蛋白，表达方法包括真核表达系统及原核表达系统。原核表达系统的优点为操作简单、成本低，且可获得较高的产量。相对于真核表达系统，原核细胞无法表达正确的BMP-2前驱物，因此难以形成成熟的BMP-2蛋白。真核表达系统的缺点为需要较高的技术且产量较低。虽然真核表达系统可产生具活性的BMP-2蛋白，但真核表达系统的产量极低。先前有文献指出添加低分子量(5，OOOMw)及高分子量(500，OOOMw)的硫酸葡聚糖可增加BMP-2蛋白的产量，但其产量仍显不足。因此业界亟需ー种可增加BMP产量的方法。
发明内容
本发明提供了ー种骨形成蛋白-2的制备方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白_2基因的细胞株，将该细胞株培养于培养基中，其中所述培养基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，对本发明作详细说明。
图I显示硫酸葡聚糖分子量与浓度对BMP-2蛋白产量的影响。图2显示分子量为6，500-10, 000MW或12，000MW的硫酸葡聚糖浓度对BMP-2蛋白
产量的影响。图3a显示肌肽浓度(10-30mM)对细胞密度的影响。图3b显示肌肽浓度(10-30mM)对细胞存活的影响。图3c显示肌肽浓度(10-30mM)对BMP-2产量的影响。图4a显示肌肽浓度(30_50mM)对细胞密度的影响。图4b显示肌肽浓度(30_50mM)对细胞存活的影响。图4c显示肌肽浓度(30-50mM)对BMP-2产量的影响。图5a显示硫酸葡聚糖(100-500 ii g/ml)与肌肽(30mM)对细胞密度的影响。图5b显示硫酸葡聚糖(100-500 u g/ml)与肌肽(30mM)对细胞存活的影响。图5c显示硫酸葡聚糖(100-500 U g/ml)与肌肽(30mM)对BMP-2产量的影响。图6a显示硫酸葡聚糖(500 U g/ml)与肌肽(10-30mM)对细胞密度的影响。图6b显示硫酸葡聚糖(500li g/ml)与肌肽(10_30mM)对细胞存活的影响。图6c显示硫酸葡聚糖(500 u g/ml)与肌肽(10-30mM)对BMP-2产量的影响。图7a显示丙氨酸与组氨酸(10-50mM)对细胞密度的影响。图7b显示丙氨酸与组氨酸(10-50mM)对细胞存活的影响。图7c显示丙氨酸与组氨酸(10-50mM)对BMP-2产量的影响。图7d显示丙氨酸与组氨酸(100-200mM)对细胞存活的影响。图7e显示丙氨酸与组氨酸(100-200mM)对细胞密度的影响。
具体实施例方式本发明提供ー种骨形成蛋白-2的制备方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白_2基因的细胞株，将此细胞株于适当的条件下培养于培养基中，其中所述培养基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。本发明所述“细胞株”指任何用于蛋白质表达的细胞株，包括动物细胞、低等真核生物或原核生物，优选动物细胞。所述动物细胞包括，但不限于，猴COS细胞、CHO细胞、人类肾脏293细胞、人类表皮A431细胞、人类Colo205细胞、3T3细胞、CV-I细胞、其它经转殖的灵长类细胞、正常的双套细胞、由体外培养的原生组织衍生的细胞株、原生移殖体、HeLa细胞、老鼠し细胞、8皿、1-60、现37、他1(、？61^6、勵5或11^1 ^细胞等。在一个实施方式中，本发明的细胞株优选CHO细胞。所述细胞株中具有骨形成蛋白_2(以下简称BMP-2)基因，所述BMP-2基因可为所述细胞自源性的BMP-2基因，也可为转染至细胞内的外源性BMP-2基因或重组BMP-2基因。BMP-2基因可来自人类或非人类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔子或骆驼等)。在ー个实施方式中，所述BMP-2基因为人类BMP-2基因，并将此BMP-2基因转染至CHO细胞中。本发明中所述的“适当条件”指可促进细胞存活、细胞生长和/或特定物质表达的条件。所述适当条件可为一般的细胞培养条件，且本领域技术人员可依照不同的需求而选择不同的培养条件。在一个实施方式中，所述适当条件为动物细胞的培养条件，优选CHO细胞的培养条件。在一个实施方式中，所述适当条件可为37°C下，含3%至10%C02及5%至7%02的潮湿空气。本发明中所述的培养基特别为用于动物细胞的培养基。本发明使用的细胞培养基并无特别限制，其可为任何动物细胞培养基。所述动物细胞培养基包括含血清培养基 以及不含动物成分的培养基，例如，无血清培养基、无蛋白质培养基及其类似物。在本发明中优选使用无血清或无蛋白质培养基，例如，RPMI 1640培养基、Eagle' sMEM培养基、Dulbecco' s modified MEM(DMEM)培养基、199 培养基、F12 培养基、Iscove' s modifiedDulbecco' s 培养基(頂DM)、EX_CELL 302 培养基、EX-CELL -CD-CH0 及 EX-CELL 325 培养基、CHO培养基、CD-CH0 培养基、CD Opti CH0 培养基、CD FortiCHO 培养基、BD CHO培养基、及⑶DG 44 培养基、IS⑶-CH0 培养基及Ultra CH0 培养基，或上述经修饰、混合或浓缩的培养基，及其类似物，更优选DMEM培养基、IMDM培养基、CD Opti CH0 培养基、CD FortiCHO 培养基、Ultra CH0 培养基或其类似物。在细胞培养的过程中，可加入硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)以增加BMP-2蛋白的产量。所使用的硫酸葡聚糖并无特别限制，其分子量可介于5，000至500，OOOMw之间，优选介于6，500至12，OOOMw之间，或8，000至10，OOOMw之间。硫酸葡聚糖的添加量并无特别限制，原则上硫酸葡聚糖浓度与BMP-2蛋白的产量具有浓度依赖性(dose dependent)，換言之，BMP-2蛋白的产量会随着硫酸葡聚糖浓度的增加而增加。培养基中硫酸葡聚糖的浓度可为约0. Iy g/ml以上，优选为约IOy g/ml以上，更优选为约200 u g/ml以上，最优选介于约500至约1，000 u g/ml之间。在一个实施方式中，硫酸葡聚糖可将BMP-2蛋白的产量增加I倍以上，优选为1-5倍。此外，在细胞培养的过程中，亦可加入肌肽(Carnosine，C9H14N403)。肌肽为N-3 -Alanyl-L-histidine，其为由P -丙氨酸和组氨酸组成的肽。肌肽为哺乳动物细胞的氮源，可作为组氨酸的来源，在紧迫时可有助于组氨酸的合成。肌肽存在于哺乳动物的心脏和骨骼肌肉组织，受紧迫(例如，骨折，感染)的动物会消耗心脏的肌肽。受紧迫(败血症)时，会降低心脏的收縮。本发明中所使用的肌肽可为一般的市售肌肽，优选为左旋肌肽。由于高浓度的肌肽会抑制细胞生长，因此最好在不影响细胞存活的条件下，选择肌肽的添加量。一般来说，肌肽的浓度可为约50mM以下，优选为约40mM以下，更优选为约10 至约 30mM。相较于单独使用硫酸葡聚糖或肌肽，同时加入硫酸葡聚糖与肌肽更可提升BMP-2
的产量。
在一个实施方式中，当培养基中肌肽的浓度为10至30mM，且硫酸葡聚糖(6，500至12，OOOMw)的浓度介于500至1，000 u g/ml时，可获得最大的BMP-2产量。相较于对照组(不含肌肽与硫酸葡聚糖)，当培养基中具有30mM肌肽或500 U g/ml硫酸葡聚糖吋，BMP-2的产量皆可增加1-2倍，然而，当培养基同时具有30mM肌肽和500 u g/ml硫酸葡聚糖时，BMP-2的产量可增加5_7倍。相较于30mM的肌肽，当培养基同时具有30mM肌肽和500 U g/ml硫酸葡聚糖时，BMP-2的产量可增加约2-3倍。相较于500 U g/ml的硫酸葡聚糖(8，OOOMw)，当培养基同时具有30mM肌肽和500 u g/ml硫酸葡聚糖时，BMP-2的产量可增加约2_3倍。一般来说，BMP-2的产量可为约10mg/L至200mg/L。另ー方面，由于高浓度的丙氨酸与组氨酸会抑制细胞生长，若培养基中含有高浓 度的丙氨酸及/或组氨酸，会造成细胞死亡，因此丙氨酸及/或组氨酸的浓度小于约200mM，优选为约IOOmM以下，更优选为约50mM以下。实施例I.宿主表达细胞本实施例的宿主表达细胞使用缺少ニ氢叶酸还原酶的中国仓鼠卵巢细胞(CH0dfhr-)，其购买自台湾食品エ业发展研究所的生物资源保存及研究中心(CCRC，60133)。将 CHO dfhr-细胞培养于 IMDM 培养基(Isocoves Modified DulbeccoJ s MediumIMDM; GibcoCat. 12200-36)中，其中含有 10% 的胎牛血清(Gibco Cat. 10091148)、次黄嘌呤与胸腺嘧啶(Gibco，Cat. 11067-030)以及2mM的L-谷氨酰胺(GibcoCat. 25030-081)。Dhfr (-)标志用于表达及筛选。通过使用ニ氢叶酸还原酶抑制剂“甲氨蝶呤(methotrexate,MTX) ”(Sigma Catno. M8407)使 dhfr 基因表达。当 dfhr 基因表达时，其它邻近基因也被一起表达，使用ELISA (PEPR0TECH 900-K255)选择表达量高的细胞株，将细胞培养于 37°C、5%C02 的培养箱中(Model 3326，Forma scientific)。 2. pND/BMP2表达载体的构建利用PCR，以全长人类 cDNA(LIFESEQ Catno. IHS1380-97652076)为模板复制出人类BMP-2基因片断(正义引物ccttaattaagccaccatggtggccgggacccgc,反义引物gatatcctagcgacacccacaaccctc),并将 BMP-2 基因片断摘入 pcDNA3. 1/Neo (+) /DHFR载体，形成pND/BMP2载体。此表达载体包含作为筛选标志的抗新霉素基因(neomycin-resIstance gene)。3.重组细胞株的建立将含有人类BMP-2基因的载体以电脉冲法(PA4000 PulseAgi le electroporator, Cyto Pulse Sciences)转染至CHO dhfr-细胞内。首先将细胞以膜蛋白酶处理后，将细胞悬浮于CP-T缓冲液(Cyto pluse Cat. CP-T)中使细胞密度为3x IO6细胞/ml。将200 u I的细胞悬浮液(6xl05细胞)与10 ii g的pND/BMP2混合后进行电脉冲处理，将经电脉冲处理的细胞培养于不含筛选物质的完全培养基(含10%胎牛血清和HT补充物(HT Supplement)的MDM)使细胞恢复生长。在不含筛选物质的培养基中培养48小时后，将细胞移至含有頂DM、10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和5nM甲氨蝶呤的含筛选物质的完全培养基中。在培养2周后，将细胞株移至96孔盘中，并利用ELISA (PEPR0TECH 900-K255)定量分析筛选出高表达rhBMP-2的细胞株。将筛选出的细胞培养于筛选培养基中。将细胞稀释至I细胞/100 u I的浓度后移至96孔盘中培养至生长成细胞丛。利用ELISA检测并定量BMP-2蛋白，再依据ELISA的结果筛选出高产量细胞并逐步增加MTX浓度从0. 005,0.01,
0.02、0. 05、0. I 至 0. 2 u M。4.硫酸葡聚糖对BMP-2产量的影响在本实施例中，分别使用分子量为5000MW(Fluka，FL_31404)、8000MW(Spectrum, DE131)、6500_10000MW(Sigma, D4911)、12000MW(Spectrum, DE133)和500000MW(Sigma, D8906)的硫酸葡聚糖。首先，将浓度IxlO5的实施例I的细胞培养于2. 5ml的IMDM培养基中，分别加入不同剂量的硫酸葡聚糖使其最终浓度为0、10、20、50、100、200、300,500,750及1，000 u g/ml后，将细胞于37°C下、5%C02的培养箱内培养7天后，收集培养基进行ELI SA分析。參照图1，当硫酸葡聚糖的分子量介于6，500-12，000时，可有效促 进BMP-2蛋白的表达，且BMP-2蛋白的产量会随着硫酸葡聚糖浓度的增加而增加。然而，若硫酸葡聚糖的分子量小于8，000或大于12，000吋，则不会对BMP-2蛋白的产量造成明显影响。此外，与分子量5，OOOMw和500，OOOMw的硫酸葡聚糖相比，分子量介于6，500-12，000硫酸葡聚糖更可增加BMP-2蛋白的产量，分子量6，500Mw-12, OOOMw硫酸葡聚糖比分子量5，OOOMw及500，OOOMw硫酸葡聚糖所增加BMP-2蛋白的产量大I倍以上。另外，进ー步选用6，500-10，OOOMw(Sigma, D4911)及 12，000MW(Spectrum, DE133)的硫酸葡聚糖，分析硫酸葡聚糖在0、10、20、50、100、200、300、500、750、l，000ii g/ml浓度下时，BMP-2蛋白的产量。參照图2，不管分子量为6，500-10, 000MW或12，000MW的硫酸葡聚糖，BMP-2蛋白的产量皆会随着硫酸葡聚糖浓度的升高而增加，产量约可増加1-4倍。然而，当浓度大于500ug/ml后，BMP-2蛋白的产量就无明显改变。5.肌肽对BMP-2产量的影响将浓度3xl06的实施例I的细胞培养于IOml的培养基中，分别加入不同剂量的肌肽(Sigma，Lot. BCBD7868V)使其最终浓度为10、20、30、50、IOOmM,以及不同剂量的硫酸葡聚糖(8000MW, Spectrum, DE131)使其最终浓度为 100、300、500 y g/ml，将细胞于 37°C 下、5%C02的培养箱内培养，每天收集培养基进行ELISA分析。对照组中不含肌肽和硫酸葡聚糖。參照图3a_3c，肌肽可增加BMP-2蛋白的产量，且BMP-2蛋白的产量会随着肌肽浓度的增加而增加。相较于对照组，当肌肽浓度为30mM吋，BMP-2蛋白的产量可增加2. 5倍。參照图4a_4c，肌肽可增加BMP-2蛋白的产量。然而，高浓度的肌肽会抑制细胞生长，因此若肌肽浓度过高，BMP-2蛋白产量增加的程度会变小。參照图5a_5c，当培养基中肌肽的浓度固定为30mM时，BMP-2蛋白的产量会随着硫酸葡聚糖浓度的増加而增加。当培养基中含有30mM的肌肽和500 u g/ml的硫酸葡聚糖吋，可获得最大的BMP-2产量。參照图6a_6c，当培养基中硫酸葡聚糖的浓度固定为500 U g/ml吋，BMP-2蛋白的产量会随着肌肽浓度的增加而增加。当培养基中含有30mM的肌肽和500 u g/ml的硫酸葡聚糖时，可获得最大的BMP-2产量。由图3-6可知，相较于对照组，当培养基中含有30mM的肌肽与500 U g/ml的硫酸葡聚糖吋，BMP-2蛋白的产量可增加5-7倍。6.丙氨酸和/或组氨酸对BMP-2产量的影响
将浓度3xl06的实施例I的细胞培养于IOml的培养基中，分别加入不同剂量的丙氨酸与组氨酸使其最终浓度为10、15、30、50、100、200mM，将细胞于37°C下、5%C02的培养箱内培养，每天收集培养基进行ELI SA分析。对照组中不含肌肽和硫酸葡聚糖。參照图7a_7e所示，当丙氨酸与组氨酸的浓度在10_15mM时，不会影响细胞的生长。然而，当丙氨酸与组氨酸的浓度增加至50mM以上时，会抑制细胞的生长，导致细胞浓度降低，进而减少BMP-2的产量。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技 艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
权利要求
1.ー种骨形成蛋白-2的制备方法，包括 提供ー细胞株，其含有骨形成蛋白_2基因， 将该细胞株培养于培养基中，其中该培养基含有硫酸葡聚糖和/或肌肽。
2.如权利要求I所述的骨形成蛋白-2的制备方法，其中所述硫酸葡聚糖的分子量介于5，OOO 至 500，OOOMw 之间。
3.如权利要求I所述的骨形成蛋白-2的制备方法，其中所述硫酸葡聚糖的分子量介于6，500 至 12，OOOMw 之间。
4.如权利要求I所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述硫酸葡聚糖的浓度大于10u g/mlo
5.如权利要求I所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述硫酸葡聚糖的浓度介于500 至 l，000ii g/ml 之间。
6.如权利要求I所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述肌肽为左旋肌肽。
7.如权利要求I所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述肌肽的浓度为50mM以下。
8.如权利要求I所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述肌肽的浓度为IOmM至30mMo
9.如权利要求I所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述培养基还含有丙氨酸和/或组氨酸。
10.如权利要求5所述的骨形成蛋白_2的制备方法，其中所述丙氨酸和/或组氨酸的浓度为200mM以下。
全文摘要
本发明提供了一种骨形成蛋白-2的制备方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白-2基因的细胞株，将该细胞株于适当的条件下培养于培养基中，其中所述培养基含有硫酸葡聚糖和/或肌肽。此外，本发明还提供一种增加骨形成蛋白-2产量的方法。
文档编号C12R1/91GK102796791SQ20121016650
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者彭文君, 杨淑萍, 杨英如 申请人:联亚生技开发股份有限公司