专利名称：一种小芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种降解牛奶过敏原的小芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
牛奶是人类最主要的乳资源营养非常丰富几乎含有人体所有的必需氨基酸在发达国家乳蛋白及其制品提供了 209^30%的食物蛋白显示了牛奶蛋白广泛的应用前景。然而牛奶亦给过敏体质的特殊人群带来麻烦世界粮农组织(FAO) 1995年报告90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝类、海产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起。牛乳过敏常见于婴幼儿在发达国家有29T7. 5%的婴幼儿发生牛奶过敏症。牛奶单含有20多种蛋白质，其中有5种引起过敏反应，包括a si-酪蛋白、a-乳白蛋白、￠-乳球蛋白、牛血清蛋白和Y-球蛋白。其中，a si-酪蛋白被认为是引起小儿过 敏的主要过敏原。在不破坏牛奶营养成分的基础上，如何降解a Si-酪蛋白成为低致敏性的多肽以及氨基酸类物质，成为当前食品生物技术急需解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种降解牛奶过敏原的小芽孢杆菌BBE201110，分类学命名为小芽孢杆菌Exiguobacterium sp. BBE201110，于2011年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2011305，地址中国武汉、武汉大学。提取BBE201110总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，两次扩增实验PCR反应体系都为50 ii L反应体系中加入重蒸馏水34. 5 ii L，10 X PCR缓冲液 5 u L, 2. 5moL*L_1Dntp4 u U1A. 4 u moL*L-1 引物 A 和 B 各 I u L,模板 DNAl u L,Pyrobest (5U*u L_1)0. 5u L0第一次扩增实验PCR按下述反应条件进行94°C 5min;94°C60s, 50°C 90s, 72°C 60s，循环30次；72°C IOmin0 PCR产物用小量回收产物纯化试剂盒进行纯化回收。序列测定工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，16SrDNA序列如SEQ ID NO. I 所示。16SrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株BBE201110与微小杆菌Exiguobacterium有100%的同源性,可以认为是小芽抱杆菌Exiguobacterium。研究发现，小芽孢杆菌BBE201110发酵24小时后蛋白酶活最高可达346. 48U/mL,收集发酵上清液，在Omin到20min时间段内对a si-酪蛋白发生特异性降解,说明该菌株分泌a si-酪蛋白蛋白酶。
图I小芽孢杆菌BBE201110在脱脂奶粉培养基上产生透明圈(脱脂奶粉培养基组成为脱脂奶粉2%,琼脂2%)图2定时取发酵液上清进行SDS-PAGE图(I泳道未添加酶液；2、泳道酶解反应时间为 5、10、15、20、30、40、50、60min)
具体实施例方式实施例I(一)酪氨酸标准曲线的绘制取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表I分别加入标准酪氨酸、去离子水、0. 4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40°C水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0 y g/mL酪氨酸溶液做空白对照。表I蛋白酶活曲线
(二)样品酶活的测定酶液适当稀释。取4支试管编号(I号为空白对照)，分别加入酶液lmL，I号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入ImL pH 7. O、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液，迅速混匀，并立即放入40°C恒温水浴准确计时，保温IOmin后，立即加入0. 4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向I号空白管中加入ImL 2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液lmL，分别移入另4支试管中，再加入0. 4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂lmL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。将复筛的菌株接到培养菌株培养基中，组成如下脱脂奶粉2%，磷酸二氢钾
0.15%，磷酸氢二钾0. 25%，碳酸钙2%，pH 7. 0 ;经蛋白酶活测定发现，发酵24小时后蛋白酶活最闻可达346. 48U/mL。实施例2如图I所示，采用脱脂牛奶平板法，将富集培养后的土壤悬液稀释到10_4，37°C培养2天观察，单菌落能产生透明圈。实施例3如图2所示，将发酵液添加到2%奶粉溶液中，发酵液添加比例可以为1%_10%，当发酵液添加比例为4%时，降解效果最优,在Omin到20min的时间段内a si-酪蛋白的条带优先于其他条带变淡消失，说明在此时间段内蛋白酶主要降解ct si-酪蛋白，在Omin到20min内BBE201110产的蛋白酶对牛奶蛋白有一定的特异性降解的现象。根据此现象，在生产低过敏性牛奶制品时，按4%的比例添加酶制剂，并在20min时加热或采用其他方式来终止酶解反应，使a Si-酪蛋白尽可能专一性得到降解，但不破坏其他蛋白组分，从而较好的保持了牛奶中原有的营养成分。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种小芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2011305。
2.权利要求I所述小芽孢杆菌，其特征在于，该菌株16SrDNA如SEQID NO. I所示。
3.权利要求I所述小芽孢杆菌用于降解aSi-酪蛋白。
4.权利要求3所述方法，其特征在于，将1%_10%所述小芽孢杆菌发酵上清液添加于奶粉溶液中。
5.权利要求4所述方法，其特征在于，将4%所述小芽孢杆菌发酵上清液添加于2%奶粉溶液中，反应20分钟。
全文摘要
本发明涉及一种小芽孢杆菌，该菌株为小芽孢杆菌Exiguobacterium sp.BBE201110，该菌株发酵24小时后蛋白酶活最高可达346.48U/mL，收集发酵上清液，在0min到20min时间段内对αs1-酪蛋白发生特异性降解，说明该菌株分泌αs1-酪蛋白蛋白酶，该菌株可用于降解牛奶过敏原。
文档编号C12N1/20GK102732454SQ20121017776
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者堵国成, 张娟, 朱婷, 谈铭, 陈坚 申请人:江南大学