人胱抑素c纳米抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测的试剂盒。本发明揭示了针对胱抑素C不同表位的纳米抗体以及单克隆抗体，所述的抗体与胱抑素C具有良好的亲和性。利用所述的纳米抗体与单克隆抗体，可制备出方便、快速且准确地检测胱抑素C的系列试剂盒。本发明解决的技术问题：提供一种可用于配对检测胱抑素C的纳米抗体；本发明的试剂盒解决的技术问题一：灵敏检测胱抑素C抗原，重复性好，结果稳定；本发明的试剂盒解决的技术问题二：快速检测，方便快捷，纳米抗体生产成本低且易于获得。
【专利说明】人胱抑素C纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]自比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学家Hamers Casterman从骆5它血液中分离出的天然缺失轻链，仅含两条重链，相比传统抗体在结构上简单许多的天然抗体后，基于一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，因其晶体结构直径为2.5nm、长4nm，纳米抗体概念得以提出。纳米抗体一经发现，它所具有的一些独特特征便引起研究者们的注意。作为一种小分子抗体，纳米抗体有很多的优点。包括:1、分子小，结构稳定，耐热性好。研究证实，将纳米抗体在37°C放置一周或在高温条件(90°C)下保存，都能保持比较好的生物活性。另外，纳米抗体在强变性剂的条件下表现出不易变性或者变性后易复性的特点，研究表明纳米抗体比常规抗体更容易储藏和运输，作为诊断试剂更具有优势。2、亲和力较高。虽然纳米抗体缺少VL，但是VHH自身的一些性质使得纳米抗体仍然保持了较高的亲和力。研究发现从免疫的单域VHH抗体库中分离出来的VHH单体具有nmol/L级的亲和力，并且特异性好；3、对人体的免疫原性弱。目前已有的抗体大都是鼠源的，作用于人体会产生人抗鼠抗体的免疫反应。Revets等将其制备的纳米抗体反复注射小鼠后未见有针对这种单域VHH抗体的抗体产生。所以纳米抗体的免疫原性较弱，与人的生物相容性较好，可能是由于骆驼VHH基因与人VH3家族序列高度同源的原因；4、易表达、易纯化。由于纳米抗体单独能够形成完整的独立结合抗原的结构域，很容易实现可溶性表达，从而使得纳米抗体的生产比一般抗体的生产更加容易，作为诊断试剂 的制备也更快、更便宜。
[0003]另一方面，血清胱抑素C是首次在鸡蛋清中被发现的，然后分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine Protease Inhibitor, CPI),后被命名为Cys C,属于CPI超家族，是一种非糖基化的碱性低分子蛋白，相对分子质量为13.6KDa,由120个氨基酸组成，带正电荷，等电点为9.3，编码基因位于20号染色体短臂，长约615kb。胱抑素C是一种分泌性蛋白，广泛存在于各种体液中，如脑脊液、唾液、尿液、精液等，其中脑脊液中的浓度最高，为5.8±2.2mg/L,唾液中胱抑素C含量为1.8±0.88mg/L，血清中的胱抑素C的含量在0.7±0.23mg/L，而尿液中胱抑素C的含量最低，约为0.095 ±0.057mg/L。胞外胱抑素C含量高可能是由于局部的高分泌速率，或是低的组织液更新速率的结果。
[0004]胱抑素C由看家基因控制，在所有有核细胞内表达，并且以恒定的速度产生。在人体多数组织中持续恒定表达，由于胱抑素C相对分子质量低、等电点高，使胱抑素C能被肾小球自由滤过，然后在近曲小管上皮细胞内分解代谢，不被肾小管重吸收和分泌，其排泄仅受肾小球滤过率(GRF)的影响，而不受其它因素如性别、年龄、饮食、炎症和血脂水平等的影响，且与性别、年龄、肌肉量无关。
[0005]利用胱抑素C对一些疾病的显著指示作用为人们对某些疾病的早期诊断和及时救治提供了可能性，胱抑素C已在临床评价心脑血管疾病，肾脏移植，血液疾病，甲亢，肿瘤，化疗，儿童、老年人疾病等多个领域得以应用，并显示了良好的应用前景。
[0006]然而，现有技术中的检测胱抑素C的检测试剂，如用于配对的单克隆的制备存在困难，专利“一种制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法(201110254775.8) ”为解决这一困难提供了一种途径。然而，即便如此，此种方法仍然操作繁杂，且所研制出来的单克隆抗体仍然存在部分缺陷，例如敏感性低、再现性差、抗体不易获得等问题。因此，本领域迫切需要开发改进的检测胱抑素C的检测试剂，以满足市场所需。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测试剂盒。
[0008]在本发明的第一方面，提供一种来源于驼羊或骆驼的纳米抗体(单域重链抗体，VHH)，能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有如SEQ IDNO=Il所示的共同特征氨基酸序列。
[0009]在一个优选例中，所述的纳米抗体中，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列:IT* * GNT，其中“ ”代表一个随机氨基酸。
[0010]在另一优选例中，所述的纳米抗体具有SEQ ID NO: 1-10任一所示的氨基酸序列。
[0011]在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码前面任一所述的纳米抗体。
[0012]在本发明的另一方面，提供一种表达载体，该表达载体中含有所述的多核苷酸。
[0013]在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞中含有所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0014]在本发明的另一方面，提供一种产生纳米抗体的方法，包括:培养所述的宿主细胞，使之表达所述的纳米抗体。
[0015]在本发明的另一方面，提供一种纳米抗体噬菌体(噬菌粒)，其包括:噬菌体(噬菌粒)，以及展示于噬菌体表面的前面任一所述的纳米抗体。
[0016]在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的噬菌体。较佳地，所述的噬菌体是Μ13Κ07。
[0017]在本发明的另一方面，提供一种特异性检测人胱抑素C的试剂盒，包括:前面任一所述的纳米抗体；或任一所述的纳米抗体曬菌体。
[0018]在一个优选例中，所述试剂盒还包括人胱抑素C特异的单克隆抗体；所述的单克隆抗体与所述的纳米抗体结合人胱抑素C蛋白的不同表位。
[0019]在一个优选中，所述的试剂盒中，所述的人胱抑素C特异的单克隆抗体选自:
[0020](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；或
[0021](b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0022]在另一优选例中，所述的试剂盒中包括:
[0023](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体；或
[0024](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体；或[0025](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体；或[0026](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体；或
[0027](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或
[0028](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或
[0029](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或
[0030](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或
[0031](a)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的纳米抗体,和(b)表面展不有具有SEQID NO:7所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或
[0032](a)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的纳米抗体,和(b)表面展不有具有SEQID N0:8所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或
[0033](a)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的纳米抗体,和(b)表面展不有具有SEQID NO: 10所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体。
[0034]在另一优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)；或所述的单克隆抗体被固定于固相载体。
[0035]在另一优选例中，所述试剂盒中还包括:能与所述的纳米抗体或单克隆抗体连接的可检测标记物(如HRP)，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或单克隆抗体或分离地存在于试剂盒；
[0036]胱抑素C标准品；和/或
[0037]与可检测标记物相对应的底物；和/或
[0038]酶联免疫反应试剂(包括但不限于:包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液);和/或
[0039]说明检测人胱抑素C的方法的使用说明书。
[0040]在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体选自:
[0041](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；或
[0042](b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0043]在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体或所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人胱抑素C的检测试剂盒。[0044]在本发明的另一方面，提供产生特异性结合人胱抑素C的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选自:
[0045](a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株；或
[0046](b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株。
[0047]在本发明的另一方面，提供一种检测(较佳地，为非诊断性地)待测样品中胱抑素C存在情况的方法，所述方法包括:
[0048]以所述的试剂盒中(a)抗体作为包被抗体(第一抗体)，(b)抗体作为检测抗体(第二抗体)，且在所述的检测抗体上设置一可检测标记物；通过双抗夹心酶联免疫反应法来检测待测样品中胱抑素C的存在情况。
[0049]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1、单抗5F2的亲和系数测定。
[0051]图2、单抗4E4的亲和系数测定。
[0052]图3、单抗IEll的亲和系数测定。
[0053]图4、镍柱纯化后的纳米抗体SDS-PAGE(左图)，以及各个克隆纳米抗体的理论分子量(右图)。`
[0054]图5、以单抗5F2作为包被抗体，以相应纳米抗体进行检测的结果。
[0055]图6、以单抗IEll作为包被抗体，以相应纳米抗体进行检测的结果。
[0056]图7、以单抗5F2作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。
[0057]图8、以单抗IEll作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。
[0058]图9、以纳米抗体3-2作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。
[0059]图10、以单抗5F2作为包被抗体，以相应纳米抗体噬菌粒进行检测的结果。
[0060]图11、精密度检测结果。
【具体实施方式】
[0061]本发明人经过长期的研究和试验，找到了针对胱抑素C不同表位的纳米抗体以及单克隆抗体(即可用于配对检测胱抑素C)，所述的抗体与胱抑素C具有良好的亲和性。利用所述的纳米抗体与单克隆抗体，可制备出方便、快速且准确地检测胱抑素C的试剂盒。本发明解决的技术问题:提供一种可用于配对检测胱抑素C的纳米抗体；本发明的试剂盒解决的技术问题一:灵敏检测胱抑素C抗原，重复性好，结果稳定；本发明的试剂盒解决的技术问题二:快速检测，方便快捷，纳米抗体生产成本低且易于获得。
[0062]术语
[0063]如本文所用，所述的“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
[0064]如本文所用，所述的“纳米抗体”是指缺失轻链的重链抗体(如:来源于骆驼体内)，克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量(Mr)仅为15000。纳米抗体具有Mr小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。
[0065]如本文所用，所述的“双抗夹心法”是酶联免疫反应(ELISA)的一种，将包被抗体固定于载体，然后包被抗体与抗原反应，洗涤后再与带标记的检测抗体反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。
[0066]如本文所用，所述的“包被抗体”、“第一抗体”、“捕获抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于固定于固相载体上的、特异性抗胱抑素C的抗体。
[0067]如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二抗体”、“酶标(记)抗体”与“二抗”可互换使用，都是指特异性地抗胱抑素C且对应于所述试剂盒中相应的包被抗体的抗体。对于抗原胱抑素C而言，相应的包被抗体和检测抗体是不同的，并且可同时结合于所述的胱抑素C的不同表位(抗原决定簇)。
[0068]如本文所用，所述的“可检测标记物”是指位于检测抗体上的，用于确定待检测样品中胱抑素C的存在与否以及存在的量的标志物。如:酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。优选的，所述的标记物选自:辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0069]如本文所用，所述的“与可检测标记物相对应的底物”是指可被检测抗体的标记物所催化显色，用于显示检测抗 体与胱抑素C发生结合的识别信号。所述的底物比如:用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯憐酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP);等等。
[0070]胱抑素C
[0071]胱抑素C是一种已知的蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本领域已知的。例如，其氨基酸序列如GenBank:AAHl3083.1所示。
[0072]生产胱抑素C的方法也是已知的。例如，通过常规的重组DNA技术(Science，1984 ；224:1431),可利用胱抑素C的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的胱抑素C蛋白。一般来说有以下步骤:
[0073](I).用编码人胱抑素C蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0074](2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；和
[0075](3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0076]上述获得的重组胱抑素C蛋白可被加工成具有一定纯度的蛋白，用于配制标准品O
[0077]抗胱抑素C蛋白的纳米抗体
[0078]本发明提供了一种纳米抗体，所述的纳米抗体筛选自驼源性天然单域重链抗体库。
[0079]本发明所述的纳米抗体，能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有共同特征氨基酸序列GGSLRL ;更佳地，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列:IT**GNT，其中*为随机氨基酸。
[0080]较佳地，所述的纳米抗体具有SEQ ID NO: 1-10任一所示氨基酸序列。
[0081]本发明也包括所述的纳米抗体的变异体、衍生物和类似物，只要它们保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT**GNT。如本文所用，术语“变异体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的纳米抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(?)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根据本文的定义这些变异体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0082]本发明的“纳米抗体”还包括保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT * * GNT结构、且具有特异性结合胱抑素C功能的、SEQ ID NO: 1-10任一所示氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
[0083]本发明还提供保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT * * GNT的、纳米抗体的类似物。这些类似物与天然纳米抗体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。
[0084]此外，在所述的纳米抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所述的纳米抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6XHis序列)，或其它可促进所述的纳米抗体的活性、表达量或稳定性的序列。
[0085]本发明还包括编码本发明的纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得 。
[0086]为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。
[0087]在获得了编码本发明新纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA序列之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的纳米抗体。
[0088]如本文所用，术语“载体”包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新纳米抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。
[0089]在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达纳米抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞。
[0090]在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明纳米抗体的条件下培养该细胞，从而表达出纳米抗体；然后再分离出表达的纳米抗体。
[0091]抗胱抑素C蛋白的单克隆抗体
[0092]用于本发明的单克隆抗体是对人胱抑素C具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人胱抑素C蛋白或其片段。更特别地，指那些能与人胱抑素C蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
[0093]本发明利用针对胱抑素C不同表位的高特异性纳米抗体和单克隆抗体，根据双抗夹心法原理，制备了可方便、快速且准确地检测胱抑素C的试剂盒。本发明中涉及的2种高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系代号以及保藏号对应如下:
[0094]杂交瘤细胞系5F2，保藏号为:CCTCC N0:C201239 ；
[0095]杂交瘤细胞系1E11，保藏号为:CCTCC N0:C201253。
[0096]上述的单克隆抗体的抗体亚型均为IgGp
[0097]本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256 ; 495,1975 ; Kohler 等 Α? Eur.J.1mmunol.6:511,1976; Kohler 等 Α? Eur.J.Tmmunol.6:292,1976;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and TCellHybridomas,Elsevier,N.Y., 198`1)。本发明的单克隆抗体可以利用人胱抑素C基因产物或片段或功能区，通过常规免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。
[0098]本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以采用多种方法方便地获得所述的抗体。
[0099]在本发明的一个实例中，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤:(I)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种优选方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是:收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的胱抑素C单克隆抗体。
[0100]此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。
[0101]试剂盒
[0102]本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行比较和筛选，才能找到适合于特异性结合的、效果优异的抗体。
[0103]通常情况下，若是采用一种抗体来结合胱抑素C，可能在测定过程中不可避免地发生非特异性结合；而基于双抗夹心法原理来制备检测试剂盒，采用的是结合于胱抑素C抗原不同表位的双抗体，这种情况下出现非特异性结合的几率大大降低，因此结果的准确性和精密度大大提高。并且，采用两种特异性非常高的抗体来将目标抗原胱抑素C吸附及定位，其定位和放大效果更好，从而使得特异性和精密度更高。且测定时仅需要很少的样品量即可。
[0104]因此，本发明提供一种检测胱抑素C的试剂盒，所述的试剂盒可用于胱抑素C的特异性检测，所述的试剂盒含有:本发明所述的纳米抗体或纳米抗体噬菌体(噬菌粒)。更佳地，所述的试剂盒中还包括人胱抑素C特异的单克隆抗体；所述的单克隆抗体与所述的纳米抗体结合人胱抑素C蛋白的不同表位。
[0105]作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中包括:
[0106](a)单克隆抗体5F2,和(b)纳米抗体3-2 ;或
[0107](a)单克隆抗体5F2,和(b)纳米抗体4-5 ;或
[0108](a)单克隆抗体IElUP (b)纳米抗体3-2 ;或
[0109](a)单克隆抗体IElUP (b)纳米抗体4-5 ;或
[0110](a)单克隆抗体5F2，和(b)纳米抗体噬菌体P-3-2 ;或
[0111](a)单克隆抗体5F2，和(b)纳米抗体噬菌体P-4-5 ;或
[0112](a)单克隆抗体1Ell，和(b)纳米抗体噬菌体P-3-2 ;或
[0113](a)单克隆抗体1Ell， 和(b)纳米抗体噬菌体P-4-5 ;或
[0114](a)纳米抗体3-2，和(b)纳米抗体噬菌体P-5-10 ;或
[0115](a)纳米抗体3-2,和(b)纳米抗体曬菌体P-6-l ;或
[0116](a)纳米抗体3-2，和(b)纳米抗体噬菌体P-7-4。
[0117]本发明人出乎意料地发现，这样的一种组合能够产生最好的胱抑素C检测效果，其检测灵敏度非常高。
[0118]在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规可用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中胱抑素C的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于):辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记。抗体标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗体。
[0119]当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如(但不限于):用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯憐酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)。
[0120]为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控(对照)。所述的质控品例如采用胱抑素C标准品。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个胱抑素C的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。利用所述的标准品，标准曲线如下设置:用标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成胱抑素C试剂盒的定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中胱抑素C的浓度。
[0121]此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是酶联免疫试验中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于):显色剂、洗涤液、终止液，增敏稀释液。
[0122]所述的包被抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自:微量滴定板(又称为多孔板，如96孔板)或微球。
[0123]在本发明的一个实例中，采用的固相载体是微量滴定板(酶标板)，所述的微量滴定板是一种聚苯乙烯板，规格是12X8可拆卸条板。
[0124]由于本发明的试剂盒采用的纳米抗体配合单克隆抗体对于胱抑素C具有极其优异的结合特性(高特异性)。按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的胱抑素C含量。
[0125]本发明的主要优点在于:
[0126](I)首次将纳米抗体用于胱抑素C的检测，使得胱抑素C检测用的配对抗体的制备变得容易，所制备的试剂盒成本更低，且更易于储藏和运输。
[0127](2)由于本发明的试剂盒采用对胱抑素C具有高亲和力，且高特异性识别胱抑素C不同表位的纳米抗体和单克隆抗体，灵敏度和准确性非常高。其中尤以单抗5F2包被，纳米抗体噬菌粒3-2检测的效果最佳，其线性范围值为0.5-31.3ng/ml，检测的准确度为94.8%。
[0128](3)由于采用的纳米抗体和单克隆抗体对于胱抑素C具有极其优异的结合特性，因此本发明的试剂盒可以极其快速地检测出血液中胱抑素C。
[0129](4)由于纳米抗体的优点，本发明试剂盒还具有简便、稳定等特点。
[0130]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0131 ] 实施例1、胱抑素C重组表达
[0132]一、聚合酶链式反应(PCR)扩增胱抑素C的全长基因
[0133](一 )模板:人肾上皮细胞293T总RNA。
[0134]( 二)引物设计:以成熟胱抑素C的全长基因363bp，设计出用于扩增除去信号肽序列后的胱抑素C基因的引物，上下游引物分别带有内切酶BamHI和XhoI的酶切位点序列。
[0135]h游引物:5’ GGATCCAGTCCCGGCAAGCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；
[0136]下游引物:5’-CCTCGAGCTAGGCGTCCTGACAGGT-3’ (SEQ ID NO: 13)；；
[0137](三)抽提细胞总1?應，使用引物01丨80((11')18和反转录酶，反转录为(^嫩。
[0138]RT-PCR获得成熟胱抑素C的基因(363bp)，并连接到克隆载体(pEASY-Tlsimple[购自北京全式金生物技术有限公司])，菌落PCR验证后，测序结果证明克隆到的基因序列100%与胱抑素C已知基因序列(GenBank:BC013083.1)相同。
[0139]二、原核表达质粒pET_32a_Cys C的构建
[0140](一 )胱抑素C(Cys C)天然蛋白结构的分析:除掉信号肽的胱抑素C是包含120个氨基酸残基和2对二硫键的非糖基化多肽链。[0141](二)内切酶BamHI和XhoI双酶切含有目的基因的克隆载体和原核表达载体pET-32a (Novagen)，胶回收目的片段后使用T4连接酶连接，转化感受态细胞，涂抗生素琼脂板，经测序证明，成功构建了 pET-32a-Cys C。
[0142]三、胱抑素C在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化以及浓度测定
[0143](一)载体pET_32a_CysC在Rosseta (DE3)菌种中诱导出了融合蛋白的理论序列是:
[0144]MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFffAEffCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGVRRALDFAVGEYNKASNDMYHSRALQVVRARKQIVAGVNYFLDVELGRTTCTKTQPNLDNCPFHDQPHLKRKAFCSFQIYAVPWQGTMTLSKSTCQDA-(SEQ ID NO:14)；
[0145]RG是凝血酶酶切位点，KA是肠激酶酶切位点。
[0146]凝血酶酶切蛋白之后，目的蛋白大小为16984Da，带有多余蛋白序列。
[0147]( 二)融合蛋白诱导表达的诱导条件是:
[0148]I)培养基:含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基；
[0149]2)诱导温度:30°C ;
[0150]3)1卩丁6浓度:0.51111;
[0151]4)诱导时间:4小时。
[0152](三)包涵体的复性
[0153]I)蛋白诱导表达4小时后，5000rpm离心,5min。
[0154]2)按照裂解缓冲液:原菌液=1:4的体积比例，用缓冲液重悬菌体，加PMSF至终浓度0.5mM，超声破碎3s超、5s停，总共100循环。
[0155]3) 12，OOOrpm, IOmin,舍上清,沉淀,按照洗漆缓冲液:原菌液=1: 10的体积比例加入含有2M尿素的洗涤缓冲液，超声洗涤10分钟。
[0156]4)洗涤液倒入透析袋中，4°C透析过夜，融合蛋白包涵体的复性率高达90%以上。
[0157](四)Ni2+_琼脂糖凝胶亲和层析柱对透析液中的含有组氨酸标签的融合蛋白进行大量纯化，纯化的融合蛋白使用截留分子量为IOKDa的Millipore超滤管对表达的融合蛋白进行浓缩，提高融合蛋白浓度，经过考马斯亮蓝结合法的检测，重组蛋白浓度高达3mg/ml ο
[0158](五)标签蛋白的切除
[0159]由于融合蛋白带有融合标签蛋白序列，为了确保免疫动物时，抗体的专一性和高效价，所以应该尽量切除多余的外源蛋白序列，于是使用肠激酶对融合蛋白进行酶切，但发现酶切效果不佳，在37°C酶切12小时后，大部分融合蛋白未被切开，可能的原因是肠激酶的酶切位点被遮蔽在蛋白的三维结构内部，而凝血酶的酶切效果却十分显著，将融合标签与目的蛋白酶切后，再次过Ni2+-NTA亲和层析柱，将融合标签吸附，将其与目的蛋白片段分开，超滤管再次浓缩目的蛋白。
[0160](六)胱抑素C标准品以及重组胱抑素C的免疫比浊法测定
[0161]使用抗胱抑素C包被的颗粒与抗原反应，反应体系发生的浊度变化，在546nm波长处吸光度值与胱抑素C的浓度成比例，用标准品标准曲线便可测定胱抑素C的浓度。试验参数:37°C，波长546nm，样品:试剂=1:100 ;吸光度范围0-2A。[0162]胱抑素C标准品购自Enzo life sciences公司，是从人类的尿液里面纯化而来，纯度大于95%。所使用的试剂盒为上海景源医疗器械有限公司的《胱抑素C检测试剂盒(免疫比浊法)》，胱抑素C浓度的有效检测范围是0.4-7.5 μ g/ml。
[0163]操作流程如下:
[0164]
【权利要求】
1.一种纳米抗体，其特征在于，能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有如SEQ ID NO: 11所示的共同特征氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列:IT ~k -k GNT，其中代表一个随机氨基酸。
3.权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，具有SEQID NO: 1-10任一所示的氨基酸序列。
4.一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1-3任一所述的纳米抗体。
5.—种纳米抗体曬菌体,其特征在于,其包括:曬菌体，以及展不于曬菌体表面的权利要求1-3任一所述的纳米抗体。
6.一种特异性检测人胱抑素C的试剂盒，其特征在于，包括: 权利要求1-3任一所述的纳米抗体；或 权利要求5所述的任一纳米抗体噬菌体。
7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括人胱抑素C特异的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的人胱抑素C特异的单克隆抗体选自: (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；或` (b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括: (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或 (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC C201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或 (a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体，和(b)表面展示有具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或 (a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体，和(b)表面展示有具有SEQ IDN0:8所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体；或 (a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的纳米抗体，和(b)表面展示有具有SEQ IDNO: 10所示的氨基酸序列的纳米抗体的纳米抗体噬菌体。
10.如权利要求6-9任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体被固定于固相载体；或所述的单克隆抗体被固定于固相载体。
11.如权利要求6-9任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括: 能与所述的纳米抗体或单克隆抗体连接的可检测标记物，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或单克隆抗体或分离地存在于试剂盒； 胱抑素C标准品；和/或 与可检测标记物相对应的底物；和/或 酶联免疫反应试剂；和/或 说明检测人胱抑素C的方法的使用说明书。
12.—种单克隆抗体,其特征在于,所述的单克隆抗体选自: (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体；或 (b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
13.权利要求1-3任一所述的纳米抗体或权利要求12所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测人胱抑素C的检测试剂盒。
14.产生特异性结合人胱抑素C的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该其特征在于，选自: (a)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201239的杂交瘤细胞株；或 (b)中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCC201253的杂交瘤细胞株。
15.一种检测待测样品中胱抑素C存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括: 以权利要求9的试剂盒中(a)抗体作为包被抗体，(b)抗体作为检测抗体，且在所述的检测抗体上设置一可检测标记物；通过双抗夹心酶联免疫反应法来检测待测样品中胱抑素C的存在情况。
【文档编号】C12N5/20GK103509115SQ201210206704
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2012年6月21日
【发明者】姚刚, 许超, 季军捷 申请人:中国科学院上海生命科学研究院