一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法
【专利摘要】本发明涉及医学研究领域，涉及隐睾特异性生精细胞模型的制备方法。本发明公开了一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法，包括下列步骤：收集隐睾患者新鲜尿液，离心沉淀种子细胞；细胞加入种子细胞培养液，培养；iPS细胞的建立和鉴定；iPS细胞体外诱导分化为生精细胞。本发明方法具有以下突出优点和特点：一，所选种子细胞为来源于尿液的细胞，其取材方式完全无创，易于被患儿接受，对于研究儿科疾病尤为重要；二，从尿源性细胞得到的iPS细胞通过各种鉴定，证实其具有和ES细胞类似的特性，可体外诱导分化为生精细胞，为研究隐睾发病的分子机制和药物筛选提供了实验平台。
【专利说明】一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学研究领域，涉及隐睾特异性生精细胞模型的制备方法。
【背景技术】[0002]睾丸是男性主要性器官，其功能是产生精子，精子与卵子结合，形成新的个体。隐睾是指男婴出生后单侧或双侧睾丸末降至阴囊而停留在其正常下降通路之任何一处，是最常见的男性生殖器先天性畸形之一，近年来其发病率呈上升趋势，其分子生物学机制至今尚未明确。隐睾患者常见的并发症之一是成年后生育功能异常。双侧睾丸未降者如果未进行早期干预，大多数成年后都会引起男性不育；但即便对隐睾患儿进行了早期干预如双侧睾丸固定术后，仍有约19%的病例成年后发生不育，提示在此病理过程中除了阴囊提供的适宜的微环境因素之外，单独的早期睾丸固定术不足以完全恢复隐睾患儿睾丸的生精功能，其病理过程还涉及其他的在生精过程中发挥作用的分子和遗传学因素，而针对这些分子和遗传学因素进行研究并寻找合适的治疗靶点是探索治疗隐睾性不育的重要途径。
[0003]研究对象的局限性往往限制了研究的进展。由于伦理的限制和实验技术的制约，以上这些发育早期和生殖相关的基因研究很难在人体上进行。细胞生物学的飞速发展有望克服这个领域的研究对象的局限性，为之提供理想的细胞模型。2007年，具有胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ES细胞)样特性的可诱导的多能干细胞(induced pluripotentstem cells, iPS细胞)的出现，利用相应的疾病特异性的细胞模型研究该疾病发生和发展的分子机制及其干预措施，具有研究周期短、细胞易于培养和扩增、细胞水平上易于进行基因干扰或过表达以研究该基因的功能等优势，正成为研究者手中的有力工具。ES细胞具有2个特性:自我更新和多向分化潜能，在相应条件下具有分化成机体三个胚层各种细胞的潜能，自建系以来除了为再生医学提供种子细胞，利用其体外的分化过程模拟人类胚胎早期发育并对其进行研究也一直受到关注。在ES研究的基础上，通过向体细胞中导入0CT4、S0X2、KLF4、CMYC4个转录因子，体细胞可被重编程为iPS细胞，其特征类似于ES细胞。人的iPS细胞的成功诱导后，建立携带有人类疾病的遗传背景的疾病特异性的iPS细胞系作为研究该疾病的细胞模型，引起了生物和医学领域的广泛关注，是研究相应疾病的分子机制和治疗方法的重要工具。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题为提供一种隐睾特异性细胞模型的制备方法。
[0005]为此，本发明提供了一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法，包括下列步骤:
[0006]a)收集隐睾患者新鲜尿液，离心沉淀种子细胞；
[0007]b)细胞加入种子细胞培养液，培养；
[0008]c) iPS细胞的建立和鉴定；
[0009]d) iPS细胞体外诱导分化为生精细胞。
[0010]在优选实施例中，所述种子细胞培养液为[0011]A.Keratinocyte-SFM + supplement (BPE20ng/ml, EGFlOng/ml)+l%L-glutamine+l%P/S
[0012]B.330ml DMEM (H-G) +11Oml F-12nutr i ent mixure + 50ml FBS + 5mlL-glutamine+5ml P/S+Hydrocortisone(0.4ug/ml)+EGF(lOug/ml)
[0013]上述A和B两种培养液，以体积比2:1混合即为最终培养液。
[0014]在优选实施例中，所述iPS细胞的建立为通过将0CT4、S0X2、KLF4、CMYC4个转录因子导入种子细胞，接种在辐照后的饲养层细胞上，每天更换人胚胎干细胞培养液，将出现的集落样生长的细胞用机械法挑出克隆，所述人胚胎干细胞培养液为DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺 +4ng/ml bFGF。
[0015]在优选实施例中，所述iPS细胞体外诱导分化为生精细胞步骤为基础诱导液为DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加IMm L-Glutamine，第一阶段诱导因子为BMP4，其作用浓度为100ng/ml，作用时间为I周；第二阶段诱导因子为FGF9，其作用浓度为50ng/ml，作用时间为2周；第三阶段诱导因子为RA，其作用浓度为lUm，作用时间为I周。
[0016]本发明方法具有以下突出优点和特点:一，所选种子细胞为来源于尿液的细胞，其取材方式完全无创，易于被患儿接受，对于研究儿科疾病尤为重要；二，从尿源性细胞得到的iPS细胞通过各种鉴定，证实其具有和ES细胞类似的特性，可体外诱导分化为生精细胞，为研究隐睾发病的分子机制和药物筛选提供了实验平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1隐睾特异性iPS细胞表达ES细胞特异性的蛋白。
[0018]图2隐睾特异性iPS细胞内源性表达ES细胞特异性基因。
[0019]图3隐睾特异性iPS细胞和种子细胞具有相同的STR位点和正常核型。
[0020]图4隐睾特异性iPS细胞畸胎瘤实验。
[0021]图5细胞VASA染色。
【具体实施方式】
[0022]为进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomasand embryonic stem cell: A practical approach[E.J.Robertson 编，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P.M.Wasserman 等编，学术出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[Μ.V.Wiles, Meth.Enzymol.225:900, 1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10:31，1998]。
[0023]细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案” [J.E.Colligan等编辑，Wiley & Sons]、“细胞生物学中的当前方案” [J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons]和“兔疫学功时当亦方案” [J.Ε.Colligan等编辑，Wiley & Sons]中找到。与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、Stratagene> InvitrogeruClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。[0024]细胞培养方法通常在“动物细胞培养:基本技术手册”最新版本(R.1.Freshney编辑，Wiley & Sons)细胞培养一般技术”(Μ.Α.Harrison和1.F.Rae,剑桥大学出版);和“胚胎干细胞:方法和操作规定” (K.Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养基和试剂可从商业供应商那得到，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalC0.、以及 ICN Biomedicals。
[0025]对本发明使用的培养基的类型没有限制，只要可用于相应类型细胞培养的培养基即可。在这类培养基中CO2的浓度优选是5%，但本发明不限于此。 [0026]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027]实施例1
[0028]实验方案:
[0029]1.从尿液中获取种子细胞
[0030]I)经医院伦理委员会讨论通过、患儿家长签署知情同意书后，取隐睾患儿尿液100-200ml进行原代培养。饮水后收集200-300ml清洁中断尿液，超净台内平均分装至若干50ml离心管内，室温，1000rpm离心5min，弃上清，用24ml培养液重悬所有离心管内细胞，平均种植于24孔板内，Iml细胞悬液/孔，静置于培养箱内，于第3天补充新鲜培养液，Iml/孔，于第5天更换新鲜培养液，约7-10天后会有细胞出现，细胞呈现短梭形，起初呈簇状生长，待细胞融合至70-80%左右，持续传代，细胞形态均一，常规冻存
[0031]2)培养液成分
[0032]A.Keratinocyte-SFM + supplement (BPE20ng/ml, EGFlOng/ml)+l%L-glutamine+l%P/S
[0033]B.330ml DMEM (H-G) +110ml F-12nutr i ent mi xur e + 50ml FBS + 5mlL-glutamine+5ml P/S+Hydrocortisone(0.4ug/ml)+EGF(lOug/ml)
[0034]上述I和2两种2:1混合即为最终培养液，此种培养液配方得到的种子细胞的生长状态最佳。
[0035]2.基因突变检测
[0036]I)抽提基因组DNA，按照商品化试剂盒的说明书进行，大致经过为:贴壁细胞用胰酶消化，离心收集，细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集，加入5mlDNA提取缓冲液，(IOmmoI/LTris-cI，0.lmol/LEDTA, 0.5%SDS)，混匀后加入 25ul 蛋白酶 K，使终浓度达到100ug/ml，混匀，50°C水浴3h,用等体积的酹抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚，氯仿，异戊醇)混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相，再用等体积的氯仿，异戊酉享抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，IOmin.。2500rpm离心IOmin.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温IOmin后2500rpm,离心lOmin。弃上清，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积_20°C预冷无水乙醇。_20°C 20min。12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
[0037]2)针对隐睾常见的突变基因INSL3，ZNF214, ZNF215设计其各个外显子的引物，由上海生工合成引物；
[0038]3)基因PCR扩增。PCR产物送测序。测序结果和NCBI网站的基因序列进行比对。
[0039]3.隐睾患儿特异性iPS细胞系的建立和鉴定
[0040]I)逆转录病毒包装:培养293T细胞，待细胞生长至70%融合时进行转染实验:将质粒 pMX_h0ct4、pMX_hSox2、pMX-hc-Myc、pMX_hKlf4 (购自 Addgene 公司)以 FUGENE6 (购自罗氏公司)转染细胞，48小时后收集含病毒的细胞培养上清，0.45 μ m滤器过滤。 [0041]2)病毒感染尿源性细胞:将以上步骤中得到的逆转录病毒颗粒感染人尿源性细胞，感染48小时后换入新的人胚胎干细胞的培养液，4小时后将细胞用0.05%的胰酶消化成单细胞，重新接种于丝裂霉素C处理后的饲养层细胞上，在人胚胎干细胞的培养液中进行培养，每日观察及换液。
[0042]3) iPS细胞的培养和扩增:选取多个边界清楚、细胞排列紧密、较高核质比的类似人胚胎干细胞的克隆在倒置相差显微镜下用机械法挑至新的饲养层细胞上，分别按照常规的人胚胎干细胞的培养方法，早期进行机械法传代、扩增，十代后方可进行酶消化法传代。
[0043]4)碱性磷酸酶染色--从Chemicon公司购买碱性磷酸酶的检测试剂盒，按照使用说明对诱导得到的iPS细胞进行常规的碱性磷酸酶染色鉴定及拍照。
[0044]5) RT-PCR检测内源和外源基因的表达:分别设计并合成人胚胎干细胞内源性的特异性表达的基因的检测引物、针对外源转入基因的检测引物，按照常规的RT-PCR实验程序对iPS细胞的表达基因进行检测。结果:隐睾特异性iPS细胞内源性表达ES细胞特异性基因如0CT4、S0X2、NANOG、FGF4等；对该细胞系0CT4基因启动子区域的CpG岛甲基化水平进行检测，结果表明该区域是高度去甲基化的，和人ES细胞类似，不同于其种子细胞(图2)。
[0045]6)免疫染色鉴定:通过商业途径购买人胚胎干细胞特异性的检测抗体如Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等对iPS细胞进行免疫染色鉴定，激光显微镜拍照分析。结果:细胞免疫荧光检测结果证实本培养体系中建立的隐睾特异性iPS细胞表达人ES细胞标志性基因:0CT4、S0X2、NAN0G、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-81、TRA-l-60 (图1)
[0046]7)核型分析:iPS细胞处于对数生长期时向培养液中加入秋水仙素(终浓度为0.1 μ g/ml)37°C孵育3小时，消化成单细胞悬液后以0.075M KC137°C低渗30分钟，加入固定液(甲醇:冰醋酸3:1)预固定15分钟后再重复固定3遍，然后冰片滴片、室温晾干后再置室温老化2-3天，60°C老化3小时，之后用0.125%胰酶消化处理，Giemsa染色，油镜观察，照像分析。结果:建立的隐睾特异性iPS细胞和种子细胞具有相同的STR位点和正常核型，说明隐睾特异性iPS细胞和种子细胞具有相同的遗传学背景，细胞重编程和体外培养过程也未影响隐睾特异性iPS细胞的核型。(图3)
[0047]8)iPS细胞的体内分化实验:iPS细胞扩增后以0.05%胰酶消化细胞3分钟，将细胞从培养板底部吹打下来，重悬于含5%FBS的生理盐水或者PBS中，以Iml注射器注射进
4-8周龄NOD-SCID小鼠的后腿肌肉中，约2-5X 106个细胞/100 μ I/注射。视长成的畸胎瘤的大小，通常在注射后10-12周左右，取出畸胎瘤，常规石蜡包埋切片或者冰冻切片后染色观察三个胚层的细胞的形态。结果:畸胎瘤实验(体内分化)形成实验(体外分化)结果表明这群细胞能够分化成三胚层来源的细胞。(图4Α)
[0048]9) iPS细胞的体外分化实验:将iPS细胞扩增后悬浮生长，形成拟胚体，12天后再贴壁生长。所用培养液为含15%FBS的DMEM。长出的细胞呈现不同的形态特征，RT-PCR检测其表达三个胚层的分子标记物如外胚层的nestin和NF，中胚层的BMP4和MYOGLOBIN，内胚层的GATA4和AFP，说明其具有体外分化全能(图4B)。
[0049]4.向生精细胞诱导分化，我们改进了诱导液的配方:基础诱导液为DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加IMm L-Glutamine0第一阶段诱导因子为BMP4，其作用浓度为IOOng/ml，作用时间为I周；第二阶段诱导因子为FGF9，其作用浓度为50ng/ml，作用时间为2周；第三阶段诱导因子为RA，其作用浓度为lUm，左右时间为I周。
[0050]按照常规细胞组化所列举试剂和步骤，进行VASA染色，发现iPS细胞诱导分化后细胞VASA染色阳性(图5)，这表明iPS细胞诱导分化成了生精细胞。
[0051]本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
【权利要求】
1.一种隐睾特异性生精细胞模型的制备方法，包括下列步骤: a)收集隐睾患者新鲜尿液，离心沉淀种子细胞； b)细胞加入种子细胞培养液，培养； c)iPS细胞的建立和鉴定； d)iPS细胞体外诱导分化为生精细胞。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述种子细胞培养液为
A.Keratinocyte-SFM+supplement(BPE20ng/ml, EGF10ng/ml)+l%L-glutamine+l%P/S
B.330ml DMEM+1IOml F_12nutrient mixure+50ml FBS+5mlL-glutamine+5ml P/S+0.4ug/ml Hydrocortisone+lOug/ml EGF上述A和B两种培养液，以体积比2:1混合即为最终培养液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述iPS细胞的建立为通过将0CT4、S0X2、KLF4、CMYC4个转录因子导入种子细胞，接种在辐照后的饲养层细胞上，每天更换人胚胎干细胞培养液，将出现的集落样生长的细胞用机械法挑出克隆，所述人胚胎干细胞培养液为 DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺 +4ng/ml bFGF。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述iPS细胞体外诱导分化为生精细胞步骤为基础诱导液为DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加IMmL-Glutamine，第一阶段诱导因子为BMP4，其作用浓度为100ng/ml，作用时间为I周；第二阶段诱导因子为FGF9，其作用浓度为50ng/ml,作用时间为2周；第三 阶段诱导因子为RA，其作用浓度为IUm,作用时间为I周。
【文档编号】C12N5/076GK103540567SQ201210241585
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月12日 优先权日:2012年7月12日
【发明者】陈方, 周君梅 申请人:上海市儿童医院