一种“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】一种“转录激活子样效应因子(Transcription?Activator?Like?Effectors，TALE)-功能基团-雌激素受体(Estrogen?Receptor，ER)”功能蛋白及其应用，所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和功能基团依次连接而成，或者由转录激活子样效应因子、功能基团和雌激素受体依次连接而成。所述功能基团选自转录激活因子(Activation?Domain，AD)、核酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、重组酶中的一种或两种以上的组合。实际应用的时候，通过在细胞质中引入他莫昔芬(tamoxifen，TAM)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-OH-TAM)来控制上述功能蛋白在特定时间进入细胞核。
【专利说明】—种“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种“转录激活子样效应因子(Transcription Activator LikeEffectors, TALE)-功能基团-雌激素受体(Estrogen Receptor, ER) ”功能蛋白以及上述功能蛋白的应用，特别涉及上述功能蛋白可控地进入细胞核中对特定基因进行操控的应用。
【背景技术】
[0002]在后基因组时代，我们迫切需要高效的基因操纵、合成等新型的生物工程技术。比如，我们常常需要抑制或沉默一个基因的表达。传统的基因敲除(Gene Knockout)技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率非常低，通常为10_6级；RNAi技术虽然简单易行，但是又很难获得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我们常常还需要针对特定基因，进行某几个碱基，甚至某一段序列的修改。同样只依赖于同源重组技术，很难获得理想的效果。
[0003]TALE (Transcription Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的,特异性地结合到DNA,在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。TALE蛋白可以穿过核膜进入细胞核内与特定的DNA结合域结合，调控植物基因组中与疾病和抵抗力相关基因的表达。简单讲，TALE是由4个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成，而每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双氨基酸残基(repeat variablediresidue,或者RVDs)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。
[0004]理论上，针对A、T、G、C任何一个碱基，都能找到与之特定结合的RVDs。因此，对任何一段DNA序列，我们可以方`便的设计、合成出对应蛋白模块组成的TALE。需要指出的问题是，I)虽然针对A、T、G、C都可以设计出对应的RVD，但是，它们之间的对应关系还有待于进一步优化；2)设计合成的TALE能否高效地靶向结合基因组上的预期位置，还决定于很多其它因素；3)蛋白模块的组成也有进一步优化的空间。
[0005]虽然TALE还有很多问题有待于深入研究加以解决，但是这并不妨碍它的应用。一个最大的应用前景是TALEN。TALEN是一个融合蛋白，由与某段DNA序列特异性识别TALE与能在DNA序列上产生双链断裂(double strand break, DSB)的内切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是异源二聚体分子(即两单位的TALE-Nuclease共同作用)，能够在两个相隔较近的特异识别序列间切割DNA。
[0006]TALEN产生的DSB能够通过以下两种途径进行修复:1)非同源末端连接(NonHomologous End Joining, NHEJ):NHEJ是以自然修复机制,能被用来引入核苷酸缺失以便失活或敲除一个特异性的祀基因；2)同源重组(Homologous Recombination,HR):DSB促进同源重组，在一个DNA模版存在下，能够产生特异性DNA序列改变，也能够将转基因整合到DNA序列上。NHEJ途径可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(Gene Knock-1n)。无论是哪种途径,TALEN产生的修复与单纯依赖于同源重组相比，基因发生重组的效率大大提高，这为我们从事基因组订制化(genome customization)提供方便的技术手段，为开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。
[0007]TALE 另外一个大的应用前景是 TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)。TALEA是一个融合蛋白，将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA。该融合蛋白将结合基因启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与Polymerase II结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列(一般12-18个碱基)，构建TALE识别模块。 [0008]TALE技术已经开始在生命科学领域崭露头角。2011年，法国和美国两个小组合作，利用TALEN技术，在大鼠中敲除失活IgM功能，效率高达60 %。2011年，包括中国在内的几个小组，利用TALEN技术，在斑马鱼中，敲除失活hey2等基因，效率也达到了 30%以上。
[0009]TALE具有特殊的结构特征，包括氮端(N端)分泌信号、中央的DNA结合域、和核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)和碳端(C端)的激活域。DNA结合域中，几乎所有已经发现的TALE蛋白都是有数量不同(12~30)、高度保守的重复单元组成，这些重复单元(一般含有33~35个氨基酸)中，除了第12和13位氨基酸不近相同之外，其他组成部分都十分保守。其中第12和13位可变的氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基RVD (repeat variable d1-residues)。TALE主要是通过重复单兀中的RVD识别DNA序列。目前已经报道的RVD共有14种。NI (氨基酸名称)特异性识别A，HD(氨基酸名称)特异性识别C，NN(氨基酸名称)可以识别G和A，NK(氨基酸名称)特异性识别G，NS(氨基酸名称)可以识别G、A、C和T，NG (氨基酸名称)特异性识别T，NH(氨基酸名称)特异性识别G，N* (氨基酸名称)可以识别T、C、G和A，NP (氨基酸名称)可以识别T、A和C，HN(氨基酸名称)可以识别G和A，NT (氨基酸名称)可以识别G和A，SN(氨基酸名称)特异性识别G，SH(氨基酸名称)特异性识别G。
[0010]TALE技术的主要部分是在TALE蛋白碳端或者氮端融合进入功能分子，例如转录激活因子(Activation Domain, AD)核酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、重组酶等等。在TALE融合蛋白特异性识别DNA序列并结合之后，它碳端的功能集团发挥作用，从而达到对功能蛋白调控的效果。现在有关TALE的相关技术应用的报道中一般都是通过质粒转染、病毒侵染或者注射信使的RNA的方法直接表达TALE融合蛋白，让其发挥作用。但是在整个过程中，只要核酸导入到细胞里面之后，就没有办法对其进行相应的控制，很多实验中，例如核酸酶实验或重组酶实验，很多时候，需要在特定的时间，在特定的组织里表达TALE融合蛋白，让其发挥作用，从而对特定的组织里显现出特定的表性。这些实验，现在的TALE技术没有办法达到这样的效果。我们希望通过一些工程学的方法，来实现对TALE蛋白时间和空间上的控制。
【发明内容】
[0011]本发明的目的正是为了解决上述技术问题，希望通过工程设计对TALE蛋白进行一些改进，实现同时在时间和空间上对TALE蛋白的控制。
[0012]本发明中的“功能基团”是一种蛋白分子，这种蛋白分子能对基因产生特定的生物化学作用，例如，该“功能基团”可以是一种能促进启动子表达的转录激活因子，也可以是促进核酸水解的核酸酶，也可以是一种能阻止基因表达的阻抑蛋白，还可以是一种能甲基化核酸的甲基化酶，等等。
[0013]“多聚核苷酸(polynucleotide) ”是一类生物大分子物质,分脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。
[0014]“他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者 4_ 羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)的衍生物”是指一系列结构各异的化合物，能与雌激素受体结合，包括但不限制于包括 raloxifene、clomifene、droloxifene 等。
[0015]据报道，人的雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)蛋白功能域中有一个配基结合功能域，它在细胞中，会和细胞质中的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)结合,整个蛋白复合体会停留在细胞质中，当有他莫昔芬(tamoxifen，ΤΑΜ)，或者4_羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0H-TAM)，或者衍生物存在的时候，他莫昔芬或4-羟基-他莫昔芬或衍生物会更强的与ER结合，此时ER就和热休克蛋白分离开，处于游离状态。如果ER蛋白上有核定位序列(Nuclear localization signal, NLS), ER蛋白就可以入核,并行使功能。
[0016]本发明中，我们将TALE融合蛋白和ER配基结合功能域结合，通过对ER蛋白入核的控制，来实现对TALE融合蛋白入核的控制，从而实现对TALE最后功能上的控制。在本发明的一个实施例中，我们在TALE的碳端融合加入转录激活因子(AD)，通过对AD功能结果的检测来检测ER的控制结果。
[0017]在实验中，我们首先构建了一个检测体系，在人子宫颈癌细胞系(Hela)中，通过病毒侵染的方法整合到 基因组中，在整合的序列中，含有微型的启动子序列，在启动子之前含有TALE的结合位点。当有能识别对应结合位点的TALE进入到细胞核内结合在结合位点时，和TALE融合的转录激活因子发挥作用，增强启动子后边的报告基因的表达量。我们将ER配基结合功能域和TALE-AD蛋白融合，分别放在TALE-AD融合蛋白前面，TALE和AD之间，TALE-AD融合蛋白后边。当没有他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxi fen，4-0H-TAM)或者衍生物存在的时候，细胞质中的热休克蛋白会和整个融合蛋白会结合，阻止其入核；当有他莫昔芬(tamoxifen，ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物存在的时候,他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0H-TAM)或者衍生物具有比热休克蛋白和ER更强的结合能力，所以它会和ER结合，此时，ER融合蛋白可以入核，发挥TALE的作用，从而达到对TALE的作用进行控制的目的。
[0018]本发明采用的技术方案如下。
[0019]一种“转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE)-功能基团-雌激素受体(Estrogen Receptor, ER) ”功能蛋白，其特征在于所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和功能基团依次连接而成，或者由转录激活子样效应因子、功能基团和雌激素受体依次连接而成。优选地，所述功能基团选自转录激活因子(Activation Domain,AD)、核酸酶、阻抑蛋白、甲基化酶、去甲基化酶、重组酶中的一种或两种以上的组合。
[0020]上述功能蛋白具有这样的特性:我们可以通过他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物来控制该功能蛋白在特定的时刻进入细胞核。具体操作方法如下:在细胞质中引入所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，由于细胞质中存在的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)会和功能蛋白中的雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)结合,阻止上述功能蛋白进入细胞核；当我们希望功能蛋白进入细胞核发挥其作用的时候，可以在细胞质中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，上述物质具有比热休克蛋白和ER更强的结合能力，所以它们会和雌激素受体(ER)结合，此时，结合了 TAM或者4-0H-TAM或者衍生物的功能蛋白(雌激素受体(ER)融合蛋白)可以入核，发挥功能蛋白的作用。该“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白同时具有转录激活子样效应因子、功能基团、雌激素受体三者的作用，雌激素受体的作用很明显，就是可以与他莫昔芬(tamoxifen，TAM)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)或者衍生物一起控制上述功能蛋白进入细胞核；而转录激活子样效应因子(TALE)的作用是定位，通过它可以识别特定的DNA并与之结合，通过TALE定位完成以后，功能基团就可以发挥其自身的作用了，例如，如果该功能基团是核酸酶，它就可以促进与之结合的核酸的分解，如果它是甲基化酶，它就可以促进与之结合的核酸的甲基化。
[0021]特别的，当功能基团是一种转录激活因子(Activation Domain, AD)的时候,可以利用上述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白在特定时间促进细胞核中特定基因表达:所述功能基团为转录激活因子(Activation Domain, AD),所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和转录激活因子(Activation Domain, AD)依次连接而成，简称为TALE-ER-AD，在细胞质中引入TALE-ER-AD，然后，在预先设定的时间，在细胞质中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)或者衍生物或它们的混合物，则TALE-ER-AD将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-ER-AD上的转录激活因子AD将促进目标DNA的转录和表达。上述技术方案中，雌激素受体ER和转录激活因子AD的连接顺序可以颠倒，变为TALE-AD-ER。
[0022]特别的，当功能基团是一种核酸酶(nuclease)的时候,可以利用“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激`素受体”功能蛋白在特定时间剪切细胞核中特定基因:所述功能基团为核酸酶(nuclease)，所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和核酸酶(nuclease)依次连接而成，简称为TALE-ER-nuclease,在细胞质中引入TALE-ER-nuclease,然后,在预先设定的时间,在细胞质中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则TALE-ER-nuclease将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-ER-nuclease上的核酸酶(nuclease)将对目标DNA进行剪切。上述技术方案中，雌激素受体ER和核酸酶(nuclease)的连接顺序可以颠倒，变为TALE-nuclease-ER。
[0023]特别的，当功能基团是一种阻抑蛋白(repressor)的时候,可以利用“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白在特定时间抑制细胞核中特定基因的表达:所述功能基团为阻抑蛋白(repressor)，所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和阻抑蛋白(repressor)依次连接而成，简称为TALE-ER-repressor,在细胞质中引入TALE-ER-repressor,然后,在预先设定的时间,在细胞质中引入他莫昔芬(tamoxifen,ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则TALE-ER-repressor将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-ER-repressor上的阻抑蛋白(repressor)将抑制目标DNA的转录和表达。上述技术方案中，雌激素受体ER和阻抑蛋白(repressor)的连接顺序可以颠倒,变为TALE-repressor-ER。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1本发明的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白检测体系原理图。首先，为了建立检测体系，通过病毒侵染的方法，把含有TALE结合位点的序列整合到目的细胞的基因组上(实际应用的时候，也可以在知道目标基因序列的前提下，选取目标基因中的一段序列，根据该序列设计合成与该序列结合的TALE)，在这段序列上，TALE结合位点后面紧接着微型启动子，在没有激活域(即转录激活因子(Activation Domain,AD))刺激的情况下，下游报告基因的表达水平很低。然后我们平行做了两个实验，第一步同时转染含有ER-TALEa (即同时含有TALE、ER和AD的融合蛋白)的质粒，转染之后6小时，把一个实验组的培养液换成含有IOOnM的4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-0H-TAM)的细胞生长培养液，另外一个实验组换成普通的细胞生长培养液。没有4-羟基-他莫昔芬的实验组里，细胞质里的热休克蛋白会和表达出来的ER-TALEa蛋白结合，阻止其入核，ER-TALEa就不能和细胞核里基因组上的结合位点结合，不能行使功能。在有4-羟基-他莫昔芬的实验组里，4-羟基-他莫昔芬比起热休克蛋白，具有和ER-TALEa更强的结合能力，所以它会和ER-TALEa结合，ER-TALEa就可以入核，结合到基因组上的结合位点上，行使功能，在此检测体系里 ，就是增强下游基因的表达。
[0025]图2荧光显微镜拍摄的经过48小时的检测结果。图中的阳性对照组是指TALE上没有融合ER基因，它本是可以行使功能的。加上ER基因是为了达到对TALE进入细胞核行使其功能的控制。图中亮点区域越多、亮点亮度越大，表示目标基因的表达越多。
[0026]图3把图2中的显微镜的拍摄结果通过软件计算荧光强度分析的结果。
[0027]图4把检测体系中的激活域换成具有酶切活性的蛋白结合域(即核酸酶，nuclease),用 ER 来控制 TALEn (TALE-nuclease)的作用效果。
[0028]图5把检测体系中的激活域换成具有抑制基因表达的蛋白结合域(即阻抑蛋白，repressor),用 ER 来控制 TALEr (TALE-repressor)的作用效果。
[0029]图6把检测体系中的激活域换成具有甲基化核酸的蛋白结合域(methylase)，用ER来控制TALEm (TALE-methylase)的作用效果。
[0030]图7把检测体系中的激活域换成具有整合酶的蛋白结合域(integrase)，用ER来控制 TALEi (TALE-1ntegrase)的作用效果。
【具体实施方式】
[0031]以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。实施例中使用的TALE氨基酸序列、被上述TALE识别的目标DNA中的片段的序列、以及ER的氨基酸序列如核苷酸序列表所示。核苷酸序列表中列出了 3组TALE氨基酸序列和能被上述TALE识别的DNA序列，实验中使用的TALE氨基酸序列和对应的被TALE识别的DNA序列是同一组的，但是并不限于某一个特定的组。在实际应用的时候，一般是知道目标DNA序列后，选取目标DNA序列中的一段作为TALE的识别位点，然后根据该目标DNA片段合成出能识别该片段的TALE。
[0032]实施例1原理如图1所示，实验结果如图2和图3所示。实验过程如下:首先，为了建立检测体系，通过病毒侵染的方法，把含有TALE结合位点的序列整合到目的细胞的基因组上，这样做是出于操作方便的考虑，在实际应用的时候，可以在知道目标基因序列的前提下，选取目标基因中的一段序列，根据该序列设计合成与该序列结合的TALE。在这段序列上，TALE结合位点后面紧接着微型启动子，在没有激活域(即转录激活因子(ActivationDomain7AD))刺激的情况下，下游报告基因的表达水平很低。然后我们平行做了两个实验，第一步同时转染含有ER-TALEa (即同时含有TALE、ER和AD的融合蛋白)的质粒，转染之后6小时,把一个实验组的培养液换成含有IOOnM的4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen,4-0H-TAM)的细胞生长培养液，另外一个实验组换成普通的细胞生长培养液。没有4-羟基-他莫昔芬的实验组里，细胞质里的热休克蛋白会和表达出来的ER-TALEa蛋白结合，阻止其入核，ER-TALEa就不能和细胞核里基因组上的结合位点结合，不能行使功能。在有4-羟基-他莫昔芬的实验组里，4-羟基-他莫昔芬比起热休克蛋白，具有和ER-TALEa更强的结合能力，所以它会和ER-TALEa结合，ER-TALEa就可以入核，结合到基因组上的结合位点上，行使功能，在此检测体系里，就是增强下游基因的表达。
[0033]实验定性结果见附图2，在阳性对照结果中，由于没有在TALE上融合ER蛋白(直接将AD与TALE融合)，因此不论加与不加4-羟基-他莫昔芬，TALE-AD蛋白都可以自由进入细胞核发挥其功能。由图2可见，不论有没有4-羟基-他莫昔芬存在，目标蛋白都大量表达，说明TALE-AD在两种情况下都进入了细胞核，并通过TALE识别了目标DNA，而且TALE-AD上的AD蛋白正常发挥了其促进目标DNA表达的功能。ER-TALE-AD的实验结果中，加与不加4-羟基-他莫昔芬的荧光强度相差不多，这表明ER、TALE、AD顺序连接得到的功能蛋白实验效果并不太好；TALE-ER-AD的实验结果中，不加4-羟基-他莫昔芬的荧 光强度比加入4-羟基-他莫昔芬的荧光强度要低很多，这表明不加4-羟基-他莫昔芬的情况下，TALE-ER-AD功能蛋白并没有大量进入细胞核，而加入4-羟基-他莫昔芬的情况下，TALE-ER-AD功能蛋白大量进入了细胞核，并发挥了促进目标DNA表达的功能，表现为荧光强度增加。TALE-AD-ER的实验结果与TALE-ER-AD的类似，只不过两者荧光强度的差别更加明显了，表明与TALE-ER-AD相比，TALE-AD-ER可控效果更好。结论就是，TALE-ER-AD和TALE-AD-ER两种功能蛋白都可以通过4-羟基-他莫昔芬对其进入细胞核的行为进行控制，而TALE-AD-ER的可控性更好。
[0034]图3是将图2的实验结果定量化而得到的。从图3可以得出与图2相同的结论:TALE-ER-AD和TALE-AD-ER两种功能蛋白都可以通过4-羟基-他莫昔芬对其进入细胞核的行为进行控制，而TALE-AD-ER的可控性更好；而可控的原因就在于功能蛋白中融合了 ER蛋白。
[0035]实施例2实验过程与实施例1类似，只是将AD蛋白换为了核酸酶(nuclease)，我们在基因组上选取了一个基因进行实验(不需要把目的序列通过病毒的方法整合到基因组上)。实验结果见图4。由图4可以看出，TALE-ER-nuclease和TALE-nuclease-ER两种功能蛋白都可以通过4-羟基-他莫昔芬对其进入细胞核的行为进行控制，而TALE-nuclease-ER的可控性更好。[0036]实施例3实验过程与实施例1类似，只是将AD蛋白换为了阻抑蛋白Oppressor)，跟实施例2类似，选取了基因组上的一个基因进行实验。实验结果见图5。由图5可以看出，TALE-ER-repressor和TALE-repressor-ER两种功能蛋白都可以通过4-羟基-他莫昔芬对其进入细胞核的行为进行控制，而TALE-r印ressor-ER的可控性更好。
[0037]实施例4实验过程与实施例1类似，只是将AD蛋白换为了甲基化酶(methylase)，跟实施例2类似，选取了基因组上的一个基因进行实验。实验结果见图6。由图6可以看出，TALE-ERnethylase和TALE-methylase-ER两种功能蛋白都可以通过4_羟基-他莫昔芬对其进入细胞核的行为进行控制，而TALE-methylase-ER的可控性更好，而且与前面3个实验结果横向相比，TALE-methylase-ER的可控性更优于TALE-repressor-ER、TALE-nuclease-ER 以及 TALE-AD-ER。
[0038]实施例5实验过程与实施例1类似，只是将AD蛋白换为了整合酶(integrase)，跟实施例2类似，选取了基因组上的一个基因进行实验。实验结果见图7。由图7可以看出，TALE-ER-1ntegrase和TALE-1ntegrase-ER两种功能蛋白都可以通过4-羟基-他莫昔芬对其进入细胞核的行为进行控制，而TALE-1ntegrase-ER的可控性更好。
[0039]由上述实施例的结果可以看出，4-羟基-他莫昔芬或他莫昔芬控制“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白进入细胞核与上述功能蛋白中的功能基团种类无关，只要是功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和功能基团依次连接而成，或者由转录激活子样效应因子、功能基团和雌激素受体依次连接而成就行，至于功能基团发生变化，带来的影响只是可控的效果稍好一点或者稍差一点，不会对可控性带来根本的影响。
[0040]核苷酸序列表: [0041](I)
[0042]TALE 识别序列(ATCACCGAACTACTACT)
[0043]TALE氨基酸序列:
[0044]MAPKKKRKVYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGSYPYDVPDYAAHGTVDLRTLGYSQQQQEKI
[0045]KPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVG
[0046]KQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNL
[0047]TPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPV
[0048]LCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALET
[0049]VQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHD
[0050]GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQ
[0051]VVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQA
[0052]HGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQR
[0053]LLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQ
[0054]ALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIA
[0055]SNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT
[0056]PAQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHA
[0057]PALIKRTNRRIPERTSHRVA
[0058](2)
【权利要求】
1.一种“转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE)-功能基团-雌激素受体(Estrogen Receptor, ER) ”功能蛋白，其特征在于所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和功能基团组成，各个单元之间不分前后顺序。
2.根据权利要求1所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和功能基团依次连接而成，或者由转录激活子样效应因子、功能基团和雌激素受体依次连接而成。
3.根据权利要求1或2所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白可以是由多聚核苷酸转录、翻译或表达获得。
4.根据权利要求1-3任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团选自转录激活因子(Activation Domain,AD)、核酸酶、阻抑蛋白、甲基化酶、去甲基化酶、重组酶中的一种或两种以上的组合。
5.一种控制权利要求1-4任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于在动物或细胞中引入所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，然后，在特定需要时间，在动物体内或细胞生长的环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白能够进入细胞核。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团为转录激活因子(Activation Domain,AD),所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和转录激活因子(Activation Domain,AD)依次连接而成，简称为TALE-ER-AD，在特定需要时间，当在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则细胞质内的TALE-ER-AD将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，转录激活因子AD将促进目标DNA的转录和表达。
7.一种利用权利要求1-5任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团为转录激活因子(Activation Domain,AD),所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、转录激活因子(Activation Domain,AD)和雌激素受体依次连接而成，简称为TALE-AD-ER，在特定需要时间，当在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者上述两者的混合物，则细胞质内的TALE-AD-ER将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，转录激活因子AD将促进目标DNA的转录和表达。
8.一种利用权利要求1-5任一项所述的“转 录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团为核酸酶(nuclease)，所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和核酸酶(nuclease)依次连接而成，简称为TALE-ER-nuclease，在特定需要的时间，当在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则细胞质内的TALE-ER-nuclease将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-ER-nuclease上的核酸酶(nuclease)将对目标DNA进行剪切。
9.一种利用权利要求1-5任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团为核酸酶(nuclease)，所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、核酸酶(nuclease)和雌激素受体依次连接而成，简称为TALE-nuclease-ER，在特定需要的时间，当在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则细胞质内的TALE-nuclease-ER将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-ER-nuclease上的核酸酶(nuclease)将对目标DNA进行剪切。
10.一种利用权利要求1-5任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团为阻抑蛋白(repressor)，所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和阻抑蛋白(^pressor)依次连接而成，简称为TALE-ER-repressor,在特定需要的时间，当在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则细胞质内的TALE-ER-1^pressor将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-ER-repressor上的阻抑蛋白(repressor)将抑制目标DNA的转录和表达。
11.一种利用权利要求1-5任一项所述的“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白，其特征在于所述功能基团为阻抑蛋白(repressor)，所述功能蛋白由转录激活子样效应因子、阻抑蛋白(^pressor)和雌激素受体依次连接而成，简称为TALE-repressor-ER,在特定需要的时间，当在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen, ΤΑΜ)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen, 4-0Η-ΤΑΜ)或者衍生物或者它们的混合物，则细胞质内TALE-repressor-ER将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，TALE-repressor- ER上的阻抑蛋白(repressor)将抑制目标DNA的转录和表达。
【文档编号】C12N15/00GK103772506SQ201210401364
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】庄峰锋, 李娟
申请人:北京唯尚立德生物科技有限公司