专利名称：编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因，该基因编码的蛋白质可用于降解纤维素。
背景技术：
生物质能是由植物的光合作用固定于地球上的太阳能。每年，太阳辐射到地球表面的能量为2. 6 X IO21千焦耳，这个能量大部分通过光合作用以碳源的形式储藏起来。这个以碳源形式储藏的能量大大超过了目前人类每年所消耗的2. IXlO17千焦耳的能(DemainA. L，Newcomb M.，Wu J. H.，2005，Cellulase, clostridia，and ethanol. Microbiol. Mol.Biol. Rev.，69 (I) :124-154.)纤维素是世界上储量最大的生物质，占地球总生物量的40%。这么大的生物质来源，可以提供取之不尽的能源供应(Lin Y. , and S. Tanaka, 2006, Ethanol fermentationfrom biomass resources:current state and prospects. Appl.Microbiol.Biotechnol.，69 (3) :627-642.)。而且纤维素是一种廉价的可再生自然资源,每年通过光合作用产生的纤维素高达I. 55X IO9吨，其中有近80%没有被人类所利用。因此纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食和饲料短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素是由吡喃型-D-葡萄糖通过β -I, 4糖苷键连接而成的多聚物，一般由7，000 - 15，000个葡萄糖组成。利用纤维素酶降解纤维素转化生产的燃料酒精代替石油作为能源可解决世界面临的能源危机，是可持续发展的战略(Mielenz J. 2001, Ethanol productionfrom biomass: technology and commercialization status. Current Opinion inBiotechnology, 4:324-329.)。这是备受世界关注的问题。 纤维素的生物降解涉及到一组复合的纤维素酶系，酶系由三种作用方式不同但相互协同作用的酶组成①内切葡聚糖酶(endo-Ι, 4_β -D-glucanase, EC3. 2. I. 4)，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β_1，4-糖苷键，产生大量的短纤维素链。这些纤维素链产生了新的末端；②外切葡聚糖酶(exo-1, 4-β-D-glucanase, EC3. 2. I. 91),这类酶作用于纤维素链的末端，水解β_1，4糖苷键，每次从链上切下一个纤维二糖分子；
③β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, EC3. 2. 1.21),这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子，以消除二糖的底物抑制作用。在三类纤维素酶的协同作用下才能降解纤维素(Zverlov V.V. , G. A. Velikodvorskaya, and ff. H. Schwarz, 2002, A newly described cellulosomalcellobiohydrolase,CelO, from Clostridium thermocellum:investigation of theexo-mode of hydrolysis, and binding capacity to crystalline cellulose.Microbiology, 148(1) :247-255.)。其中内切葡聚糖酶优先作用于无定形纤维素，切割β_1，4主键，进而由外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶完成彻底降解(Glazer Α. N. ,NikaidoH. , Microbial Biotechnology. New York:ff. H. Freeman and Company,1995.)。
国内外对纤维素酶有近40多年的研究，生产纤维素酶的生物也非常广泛，绝大部分纤维素酶主要是由微生物发酵而产生，如细菌、真菌(木霉、青霉和曲霉)、放线菌等(Immanuel, R. Dhanusha, P. Prema, et al, 2006, Effect ofdifferent growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteriaisolated from coir retting effluents of estuarine environment. InternationalJournal of Environmental Science and Technology,3:25 - 34.),目前石开究最清楚的是里氏木霉(Shin CS, Lee JP, Lee JS, et al，2000，Enzyme production ofTrichoderma reesei Rut C—30 on various lignocellulosic substrates. AppliedBiochemistry and Biotechnology,84/86:237245.)。除此之外，部分动物体内也可以产生纤维素酶，如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蜗牛的胃液等都含有丰富的纤维素酶(DuanCJj Feng JX.，2010，Mining metagenomes for novel cellulase genes. BiotechnolLett. 32(12) :1765-75. ) 目前，纤维素酶已经被广泛地应用于多个领域，主要有食品、酿酒、环保、饲料加工、纺织、农业、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物细胞壁的主要成分是果胶、纤维素和半纤维素等，因此，在水果与蔬菜加工的过程中适当使用纤维素酶，可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面，还可使植物细胞壁发生不同程度变化，如软化、膨胀、崩溃等，提高果蔬的可消化性，并使其口感更好；在白酒及其酒精生产中以纤维素为原料发酵生产酒精，使用的是二段法，即先用纤维素酶将纤维素糖化，再经酵母发酵成酒精；在茶叶加工中用酶法低温抽提，即先用纤维素酶将茶叶的细胞壁裂解抽提其中的有效成分，最后将含有有效成分的抽提液浓缩干燥便可制成可溶性茶。与传统的热浸提法相比，此方法可提 高有效成分的得率，同时还可保持茶叶原有的色香味；在活性物质的提取中，如淀粉、蛋白质、活性多糖等物质的提取过程中，加入纤维素酶能大幅提高产品的收率(杜翠娇，任河，杜建敏等，2011，纤维素酶及其应用，食品工程，2 6-7.)以内切葡聚糖酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现69项发明专利。其中有23项发明专利是描述编码内切葡聚糖酶的基因及其应用，而其他46项是与内切葡聚糖酶在各种领域上的应用有关。在这23项与编码内切葡聚糖酶的基因及其应用相关的发明专利中的内切葡聚糖酶基因分别来自于各种细菌、霉菌、未培养微生物或人工合成的，在这23项专利中还没有一个内切葡聚糖酶基因是来自于链霉菌的。
发明内容
本发明从广西南宁筛选到的链霉菌GX6的基因组中克隆到一个编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产内切葡聚糖酶，并能以纤维素为原料降解生成葡萄寡糖。本发明涉及一个编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。是从链霉菌GX6的基因组中克隆得到。该内切葡聚糖酶基因Cel5A的序列是由1605个碱基组成，含有完整的内切葡聚糖酶基因Cel5A的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF), Cel5A基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。SEQ ID NO :2的蛋白质是基因Cel5A编码的内切葡聚糖酶产物Cel5A，由535个氨基酸组成，和Cel5A催化功能域同源性最高的是与Streptomyces sp. el4 (链霉菌el4)的endoglucanase El (内切葡萄糖苷酶El)，两者的一致性=411/473 (87%)、相似性=435/473 (92%)。基因Cel5A在大肠杆菌中表达的重组产物Cel5A能够分解纤维素。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。本发明提供了一个编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因，该基因所编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶在分解纤维素的用途。
图I是筛选含有内切葡聚糖酶基因Cel5A重组 菌株的CMC选择平板图。图2是内切葡聚糖酶Cel5A的SDS-PAGE图。从图I 了解到，含有内切葡聚糖酶基因Cel5A的重组菌株能够在CMC选择选平板上形成透明圈。从图2 了解到，内切葡聚糖酶Cel5A纯化物的分子量为56kDa。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系XLl-blue，购自TaKaRa公司，表达载体pQE30和表达宿主M15，购自Qiagen公司，CMC(carboxylmethylcellulose,羧甲基纤维素钠，购自Sigma公司以及购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述I)链霉菌Streptomyces GX6基因组DNA的提取链霉菌Sti^ptomyces GX6的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目录号 BSC12S1)的使用说明来提取的。将提取好的链霉菌Sti^ptomyces GX6的基因组DNA送华大基因公司测定基因组序列。2)链霉菌Sti^ptomyces GX6的基因组序列中编码内切葡聚糖基因序列的分析将获得的链霉菌Streptomyces GX6的基因组序列用NCBI (National Centerfor Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. rov)上的软件 ORFfinder (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/orfiR. cri)和Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行分析。结果共获得 3 个与内切葡聚糖酶具有较高同源性的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF),本发明只涉及其中一个0RF。3)编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A的核苷酸序列分析基因Cel5A的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)由1605个核苷酸组成,序列如SEQ ID NO :1。其中，Cel5A基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。4)编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A编码的产物Cel5A的氨基酸序列分析
内切葡聚糖酶基因Cel5A编码一个含534个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为55966. 20道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析内切葡聚糖酶 Cel5A 的组件结构，结果是自N端的I 一 34位氨基酸残基是信号肽序列，73 - 390位氨基酸残基为糖基水解酶家族5 (glycosyl hydrolase)的纤维素酶功能域和438 — 531位氨基酸残基为碳水化合物结合功能域。5)编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A的克隆和表达使用上游引物5 ’ -ATAGGATCCGCCGGGGCCACCACCGCAGCGCCCG-3 ’和下游引物 5 ’ -ATCAAGCTTTCAGCTCGCGGTGCAGCTCACGCTC-3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增内切葡聚糖酶基因Cel5A，用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切内切葡聚糖酶基因Cel5A后，与经BamHI和HindIII酶切的表达载体PQE30进行连接。再将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌 XLl-blue中，涂布到含100μ g/mL氨苄青霉素的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100 μ g/mL氨苄青霉素和0. 5% (ff/V) CMC (羧甲基纤维素钠)的LA平板上，将平板置于37°C恒温箱培养6小时，对每个转点菌落逐个滴加I μ 11% (W/V)的IPTG诱导表达，然后将平板置于37°C恒温箱继续培养6小时。时间到后，进行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒温箱使表达的Cel5A酶与CMC反应5小时。用0. 1%的刚果红溶液染色15分钟后，再用IM的NaCl溶液脱色。观察选择平板。然后进一步提取在选择平板上能形成透明圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pQE-Ce15A,用限制性内切酶BamHI和Hindi 11完全酶切pQE_Cel5A后，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pQE-Cel5A除有一个约3. 4kb的DNA片段外，还有一条大小约为I. 6kb的DNA片段。将质粒pQE_Cel5A用CaCl2法转化入大肠杆菌表达宿主M15，涂布到含100 μ g/mL氨苄青霉素和25 μ g/mL卡那霉素的LA平板上。挑取转化得到的单菌落接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素和25 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，待0D600为0. 4时，力口入IPTG使其终浓度为0. 5mmol/L，2(TC、180转诱导22小时。IlOOOrpm离心3min，收集菌体，用4mL pH7. 0100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min,取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入lmL50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL冲洗缓冲液(50mmol/LNaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH8. 0)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤 4 次。加入洗脱缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8. 0)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。6)编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶Cel5A酶活力的测定取2 μ I内切葡聚糖酶Cel5A的纯化物，加入250 μ 11OOmmoI/L的ρΗ7. O磷酸缓冲液，与250 μ 12% CMC溶液混合，在37°C作用10分钟后，加入1000 μ I DNS溶液，放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度0D53(i。吸光度测定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。所述DNS试剂配制称取I克NaOH用约40mL ddH20溶解，再称取I克二硝基水杨酸、0. 2克苯酚、0. 05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mLddH20中，两种溶液混合，定容到lOOmL。内切葡聚糖酶的酶活力单位(IU)定义为每分钟催化产生Iymol还原糖所需的酶量。内切葡聚糖酶的比活力的定义每mg蛋白质所含的酶活力(U/mg)。内切葡聚糖酶 Cel5A的水解CMC比活力为34. 56U/mg。
权利要求
1.一个编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
2.权利要求I的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.—种表达载体,其特征在于,它含有权利要求I所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求2所述的蛋白质在降解纤维素中的应用。
全文摘要
一个编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A及其应用,含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，上述基因编码的内切葡聚糖酶Cel5A，含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，以及该酶在分解纤维素中的应用。
文档编号C12N1/15GK102888417SQ20121041839
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月27日 优先权日2012年10月27日
发明者庞浩, 黄日波, 韦宇拓, 杜丽琴, 韦航, 裴建新 申请人:广西科学院