专利名称：编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6，该基因编码的蛋白质可用于降解纤维素。
背景技术：
纤维素类物质是自然界中含量最丰富、最廉价却又未得到充分利用的可再生资源。纤维素是葡萄糖通过β_1，4糖苷键结合而成的高分子聚合物，纤维素是植物细胞壁的主要组分之一，占植物秸杆干重的40 50% (Lin Y, and S. Tanaka, 2006, Ethanolfermentation from biomass resources: current state and prospects.Appl. Microbiol.Biotechnol.，69(3):627-642.)。随着燃油价格的持续不断的增长和石油资源的匮乏，生物资源发酵生产酒精和寡糖类物质越来越成为人类研究的热点。纤维素通过水解作用生产葡萄糖，然后经过生物发酵生成酒精，前景十分广阔，不仅能降低二氧化碳的排放，还可以减少对汽油等非再生能源的依赖(于斌，齐鲁，2006，木质纤维素生产燃料乙醇的研究现状，化工进展，25 (3) :244 —249.)。目前降解纤维素的主要手段有酸水解、酶水解、热水解、机械水解、离子辐射水角军(John R, Whitaker, 1994, Principles of Enzymology for the FoodScience(SecondEdition). New York:Marcel Dekker :415-416.)。其中利用纤维素酶进行水解的条件温和，易于控制，产物较为单纯等方面的优点，在降解纤维素生产粮食和能源方面具有相当巨大的潜力。通常纤维素酶可根据其不同的催化反应功能分为三种水解酶，分别为内切葡聚糖酶(endoglucanase,EC 3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase 或 exoglucohydrolase,EC3. 2. I. 91)和β -葡聚糖苷酶(β -glucosidase, EC3. 2. I. 21)。纤维素在这三种酶共同作用下可降解为葡萄糖，这三种酶被称为“完全纤维素酶系”。内切葡聚糖酶作用在纤维素分子内部的非结晶区域，随机切割纤维素多糖链1，4_糖苷键，产生不同长度的有非还原末端的小分子纤维素。纤维素酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，糖基水解酶有一个催化功能域和一个或多个其它的功能域组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(Davies G, Henrissat B. , 1995, Structures andmechanismsof glycosyl hydrolases. Structure 3:853-859·)。根据 Cazy 服务器(hi:tp ://afmb.cnrs-mrs. fr/CAZY/)上所列糖基水解酶类，糖基水解酶类有108个家族，内切葡聚糖酶分属于糖基水解酶类家族 1，3，5，6，7，8，9，10，12，26，44，45，48，51，61，74。国内外对纤维素酶有近40多年的研究，生产纤维素酶的生物也非常广泛，绝大部分纤维素酶主要是由微生物发酵而产生，如细菌、真菌(木霉、青霉和曲霉)、放线菌等(Immanuel, R. Dhanusha, P Prema, et al, 2006, Effect of differentgrowthparameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated fromcoirretting effluents of estuarine environment.International Journal ofEnvironmentalScience and Technology, 3:25 - 34.),目前研究最清楚的是里氏木霉(Shin CS, LeeJP, Lee JS, et al,2000, Enzyme production of Trichodermaressei Rut C—30 onvarious lignocellulosic substrates. Applied Biochemistryand Biotechnology,84/86:237 - 245.)。除此之外，部分动物体内也可以产生纤维素酶，如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蜗牛的胃液等都含有丰富的纤维素酶(DuanCJ, Feng JX. , 2010, Miningmetagenomes for novel cellulase genes.BiotechnolLett. 32(12) :1765-75.)。目前，纤维素酶已经被广泛地应用于多个领域，主要有食品、酿酒、环保、饲料加工、纺织、农业、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物细胞壁的主要成分是果胶、纤维素和半纤维素等，因此，在水果与蔬菜加工的过程中适当使用纤维素酶，可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面，还可使植物细胞壁发生不同程度变化，如软化、膨胀、崩溃等，提高果蔬的可消化性，并使其口感更好；在白酒及其酒精生产中以纤维素为原料发酵生产酒精，使用的是二段法，即先用纤维素酶将纤维素糖化，再经酵母发酵成酒精；在茶叶加工中用酶法低温抽提，即先用纤维素酶将茶叶的细胞壁裂解抽提其中的有效成分，最后将 含有有效成分的抽提液浓缩干燥便可制成可溶性茶。与传统的热浸提法相比，此方法可提高有效成分的得率，同时还可保持茶叶原有的色香味；在活性物质的提取中，如淀粉、蛋白质、活性多糖等物质的提取过程中，加入纤维素酶能大幅提高产品的收率(杜翠娇，任河，杜建敏等，2011，纤维素酶及其应用，食品工程，2 :6-7.)以内切葡聚糖酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现69项发明专利。其中有23项发明专利是描述编码内切葡聚糖酶的基因及其应用，而其他46项是与内切葡聚糖酶在各种领域上的应用有关。在这23项与编码内切葡聚糖酶的基因及其应用相关的发明专利中的内切葡聚糖酶基因分别来自于各种细菌、霉菌、未培养微生物或人工合成的，在这23项专利中还没有一个内切葡聚糖酶基因是来自于链霉菌的。
发明内容
本发明从广西南宁筛选到的链霉菌GX6的基因组中克隆到一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产内切葡聚糖酶，并能以纤维素为原料降解生成葡萄寡糖。本发明涉及一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。是从链霉菌GX6的基因组中克隆得到。该内切葡聚糖酶基因Cel6的序列是由999个碱基组成，含有完整的内切葡聚糖酶基因Cel6的开放阅读框(Open ReadingFrame, ORF), Cel6基因的起始密码子为GTG，终止密码子为TGA。SEQ ID N0:2的蛋白质是基因Cel6编码的内切葡聚糖酶产物Cel6，由332个氨基酸组成，和Cel6催化功能域同源性最高的是与Streptomyces sp. el4 (链霉菌el4)的secreted endoglucanase (分泌型的内切葡聚糖酶),两者的一致性=255/296(86%),相似性=278/296(94%)。基因Cel6在大肠杆菌中表达的重组产物Cel6能够分解纤维素。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。
本发明提供了一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6，该基因所编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶在分解纤维素的用途。
图I是筛选含有内切葡聚糖酶基因Cel6重组菌株的CMC选择平板图。从图I 了解到，含有内切葡聚糖酶基因Cel6的重组菌株能够在CMC选择平板上形成透明圈。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系XLl-blue,购自TaKaRa公司，表达载体pSE380,购自Invitrogen公司，CMC (carboxylmethylcellulose,羧甲基纤维素钠，购自Sigma公司，以及购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述I)链霉菌Streptomyces GX6基因组DNA的提取链霉菌Sti^ptomyces GX6的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目录号 BSC12S1)的使用说明来提取的。将提取好的链霉菌Sti^ptomyces GX6的基因组DNA送华大基因公司测定基因组序列。2)链霉菌Sti^ptomyces GX6的基因组序列中编码内切葡聚糖基因序列的分析将获得的链霉菌Streptomyces GX6的基因组序列用NCBI (NationalCenterfor Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的软件 ORFfinder(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/orfiR. cri)和 Blast(http://blast. ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行分析。结果共获得3个与内切葡聚糖酶具有较高同源性的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF),本发明只涉及其中一个0RF。3)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6的核苷酸序列分析基因Cel6的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)由999个核苷酸组成,序列如SEQ ID NO :1。其中，Cel6基因的起始密码子为GTG，终止密码子为TGA。4)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6编码的产物Cel6的氨基酸序列分析内切葡聚糖酶基因Cel6编码一个含332个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为34932. 69道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析内切葡聚糖酶 Cel6 的组件结构，结果是自N端的47 — 322位氨基酸残基为糖基水解酶家族6 (glycosyl hydrolase)的纤维素酶功能域。5)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6的克隆和表达
使用上游引物5’ -TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACGTCGTGGGGACGGCGCTGCTGGCCG-3 ’(含有 Nco I 位点和 6 X Hi s-tag )和下游引物 5 ’ -ACTAAGCTTTCACCCGCCGGCCCGGGCCAGCTGC-3’(含有HindIII位点)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增内切葡聚糖酶基因Cel6，用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切内切葡聚糖酶基因Cel6后，与经NcoI和HindIII酶切的表达载体PSE380进行连接。再将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌XLl-blue中，涂布到含100 μ g/mL氨苄青霉素的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100 μ g/mL氨苄青霉素和O. 5% (ff/V) CMC (羧甲基纤维素钠)的LA平板上，将平板置于37°C恒温箱培养8小时，对每个转点菌落逐个滴加I μ I 1% (ff/V)的IPTG诱导表达，然后将平板置于37°C恒温箱继续培养7小时。时间到后，进行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒温箱使表达的Cel6酶与CMC反应7小时。用O. 1%的刚果红溶液染色15分钟后，再用IM的NaCl溶液脱色。观察选择平板。然后进一步提取在选择平板上能形成透明圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pSE-Cel6，用限制性内切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE_Cel6后，进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-Cel6除有一个约4. Ikb的DNA片段外，还有一条大小约为Ikb的DNA片段。 将含有质粒pSE_Cel6的大肠杆菌单菌落接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养，待OD6tltl为O. 4时，加入终浓度为O. 5mmol/L IPTG、终浓度为100mmol/L山梨醇和终浓度为2. 5mmol/L甜菜喊,20°C诱导20小时。IlOOOrpm离心3min,收集菌体，用4mL 100mmol/L的pH 7. O磷酸缓冲液重悬菌体,超声波破胞9min。12000rpm离心lOmin，上清即为含有内切葡聚糖酶Cel6的粗酶液。6)编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶Cel6酶活力的测定取10 μ I内切葡聚糖酶Cel6的粗酶液，加入250 μ I IOOmmoI/L的pH 7. O磷酸缓冲液，与250 μ I 2% CMC溶液混合，在37°C作用30分钟后，加入1000 μ I DNS溶液，放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD53tl。吸光度测定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。所述DNS试剂配制称取I克NaOH用约40mL ddH20溶解，再称取I克二硝基水杨酸、0. 2克苯酚、0. 05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mLddH20中，两种溶液混合，定容到100mL。内切葡聚糖酶的酶活力单位(IU)定义为每分钟催化产生Iymol还原糖所需的酶量。内切葡聚糖酶Cel6的水解CMC活性为16. 78U。
权利要求
1.一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
2.权利要求I的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.—种表达载体,其特征在于,它含有权利要求I所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求2所述的蛋白质在降解纤维素中的应用。
全文摘要
一个编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，上述基因编码的内切葡聚糖酶Cel6，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，该酶在分解纤维素中的应用。
文档编号C12R1/465GK102899340SQ20121041898
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月27日 优先权日2012年10月27日
发明者黄日波, 杜丽琴, 韦宇拓, 谭慧敏, 韦航, 吴倩倩 申请人:广西大学