一种植物乳杆菌的电穿孔遗传转化方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用优化后的电穿孔技术对植物乳杆菌进行外源基因的高效遗传转化方法：利用添加最适浓度外源基因(质粒)、菌体最适生长状态，恢复培养基制成最适浓度的蔗糖溶液、以及控制电击后的恢复时间，从而实现了一种高效的电转化的方法使得外源DNA进入植物乳杆菌中。本发明的有益效果体现在：可以用于植物乳杆菌的分子生物学研究，如研究该菌降胆固醇的分子机制以及产酸耐胆盐的分子学机制；可以用来对植物乳杆菌实施基因工程从而进行遗传改良，提高降胆固醇的能力。
【专利说明】一种植物乳杆菌的电穿孔遗传转化方法
(—)【技术领域】
[0001]本发明涉及植物乳杆菌的电穿孔遗传转化技术，适用于植物乳杆菌的遗传工程以及植物乳杆菌分子生物学研究等领域。
(二)【背景技术】
[0002]乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的(Generally regarded as safe,GRAS)。由于乳酸菌在发酵、农业、食品、生物加工乃至医药方面的重要应用，早在20世纪80年代，国外就已经开展了对乳酸菌遗传学的研究。对乳酸菌遗传系统的研究对于分析乳酸菌的重要工业特性，以及通过遗传、代谢和蛋白质工程对其进行改造有着非常重要的意义。到90年代中期，此研究已经在不同国家内大范围的展开。
[0003]最近十多年来，对乳酸菌分子生物学的研究取得了很大进步，并且已经发展了一些基于广泛接合质粒的适用于乳酸菌的克隆载体、整合载体和表达载体。
[0004]近年来，乳杆菌的分子微生物学研究取得了重大进展，一些具有不同用途的乳酸乳球菌基因表达载体已经构建，用来表达抗原蛋白、细胞因子和生物酶等，推动食品工业快速向前发展。人们通过对乳酸菌质粒的研究，并用其作为一种基因克隆载体极大地推动了乳酸菌遗传学的发展，在食品工业生产中，也得到了广泛应用。
[0005]植物乳杆菌作为乳酸菌的一种，此菌与别的乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，革兰氏阳性菌，最适生长温度为30~37°C，兼性厌氧。菌种呈短杆状，不产芽孢；在MRS培养基中呈暗白色、不透明、圆形、光滑、微小细密的菌落。属于同型发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L-山梨糖、乳糖、纤维二糖、木糖、蜜二糖、果糖、核糖、葡萄糖酸钠产酸。
[0006]乳酸菌的转化需要一套稳定的转化方法。目前乳酸菌的主要转化方法有原生质体转化法和电转化法。前者操作复杂，转化效率较低，不利于广泛应用，特别是有工业应用价值的菌株，而后者操作相对简便，转化效率相对较高，因而当今主要采用电转化法。
[0007]本发明利用了电穿孔技术对植物乳杆菌实施了外源基因转化，找到了合适的转化参数并优化了参数的组合，转化程序较现有的其他方法更简单，提高了转化效率，此法可用于乳酸菌的遗传工程以及分子生物学研究。
(三)
【发明内容】
[0008]本发明目的是提供利用电穿孔(electroporati`on)技术对植物乳杆菌进行外源基因遗传转化方法，并找到转化效率较高的转化参数组合，可用于乳酸菌的遗传工程以及分子生物学研究等领域，以解决其它的遗传转化方法的不足之处。
[0009]本发明达到发明目的所采用的技术方案是:利用菌体最适生长状态，将所得感受态细胞和适量外源基因(质粒DNA)水溶液混合，利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击后的菌体细胞加入最适浓度的蔗糖溶液恢复培养基，然后控制电击后的恢复时间，从而实现了一种高效的电转化的方法使得外源DNA进入植物乳杆菌MA2中。
[0010]所述的植物乳杆菌的电穿孔遗传转化方法按如下步骤进行:
[0011]I)将植物乳杆菌用MRS培养基，以显微镜检查计数，调整植物乳杆菌菌浓在108cfu/mL ；
[0012]2)用于转化的外源质粒pMG36e扩增提取后溶于无菌去离子水0.5ng~5ng/ μ L，每50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀；
[0013]3)冰上预冷的2cm电击杯中加入步骤2)所得混合液51 μ L，准备电穿孔仪，设定电压2.49KV，进行电击；
[0014]4)电击后电击杯中加入ImL含蔗糖浓度为O~0.4Μ的MRS液体培养基，冰浴10分钟，37 V复苏2.5h，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现；所述的MRS培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0015]5)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基中长出，其红霉素的浓度为5 μ g/μ L。
[0016]所述的菌体浓度及菌体生长状态的方法:收集在OD6tltlnm在0.3~0.8之间的菌体制备感受态细胞。
[0017]所述的恢复培养基的制备方法:蔗糖浓度在O~0.4Μ之间。
[0018]所述的电击后的菌体复苏时间确定方法:1~3h之间其特征在于所述的菌体复苏时间应在37°C培养箱中进行复苏培养。
[0019]由于转化子需要抗性筛选，植物乳杆菌野生菌不具有红霉素抗性，故本发明中所述的外源DNA选为带有红霉素抗性基因的质粒pMG36e，与其对应的抗生素为红霉素。如质粒PEP4351等同样适用于本发明。其它任何可以转化乳酸菌的DNA或质粒，也可采用本发明所述的方法进行转化。
[0020]具体的，所述的方法按如下步骤进行:
[0021]1)将植物乳杆菌用MRS培养基，以显微镜检查计数，调整植物乳杆菌菌浓在108cfu/mL ；
[0022]2)用于转化的外源质粒pMG36e扩增提取后溶于无菌去离子水0.5ng~5ng/ μ L，每50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀；
[0023]3)冰上预冷的2cm电击杯中加入步骤2)所得混合液51 μ L，准备电穿孔仪，设定电压2.49KV，进行电击；
[0024]4)电击后电击杯中加入ImL含蔗糖浓度为O~0.4Μ的MRS液体培养基，冰浴10分钟，37 V复苏2.5h，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现；所述的MRS培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0025]5)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基中长出，其红霉素的浓度为5 μ g/ μ L。
[0026]本发明的有益效果体现在:可以用于植物乳杆菌的分子生物学研究，如研究该菌降胆固醇的分子机制以及产酸耐胆盐的分子学机制；可以用来对植物乳杆菌实施基因工程从而进行遗传改良，提高降胆固醇的能力。(四)【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0028]实施例1:利用电穿孔法对植物乳杆菌进行外源抗红霉素基因的遗传转化
[0029]利用
【发明内容】
中所述的方法，将含红霉素抗性基因的外源质粒pMG36e导入植物乳杆菌，通过红霉素筛选获得稳定转化的工程菌，得到较高的转化效率。具体方法如下:[0030]1.植物乳杆菌感受态细胞的制备:
[0031]I)在MRS培养基平板上进行植物乳杆菌菌种活化，培养温度为37°C。MRS固体培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g，2%的琼脂粉，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121 °C下灭菌，20分钟。
[0032]2)挑取平板上的单菌落接入MRS液体培养基活化，培养温度为37°C。MRS液体培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g,加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0033]3)将菌种接种于MRS液体培养基中，厌氧培养至OD6tltlnm为0.3 ;
[0034]4)将菌液放入离心管中，4°C，4000rmp离心15-20分钟，弃上清，得菌体；
[0035]5)用1/10体积冰冷的洗涤液洗涤细胞，4°C，4000rmp离心15-20分钟，弃上清；
[0036]6)将上述离心管在冰上放置5min ；
[0037]7)用1/10体积冰冷的洗涤液洗涤细胞，4°C，4000rmp离心15-20分钟，弃上清；
[0038]8)用1/100体积冰冷的洗涤液重悬菌液；
[0039]9)将上述得到的感受态细胞以50 μ L/支的体积分装，用封口胶封口，冰上放置IOmin, _80°C保存(每次使用前于冰上溶化)。
[0040]2.电穿孔法对原生质体进行外源DNA转化:
[0041]1)DNA制备。用于转化的外源质粒pMG36e扩增提取后溶于无菌去离子水，浓度为
0.5ng/ μ L,用于转化。
[0042]2)每50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀，将混合液加入冰上预冷的2cm电击杯中，准备电穿孔仪，设定电压2.49KV，进行电击；
[0043]3)电击后电击杯中加入ImL含蔗糖浓度为0.4M的MRS液体培养基，冰浴10分钟，37 V复苏Ih，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现；所述的MRS培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温
1.0g，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0044]4)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基中长出，其红霉素的浓度为5 μ g/ μ L。
[0045]结果:
[0046]转化效率相对于之前有较大的提高。
[0047]实施例2:利用电穿孔法对植物乳杆菌进行外源抗红霉素基因的遗传转化
[0048]利用
【发明内容】
中所述的方法，将含红霉素抗性基因的外源质粒pMG36e导入植物乳杆菌，通过红霉素筛选获得稳定转化的工程菌，得到较高的转化效率。具体方法如下:
[0049]1.植物乳杆菌感受态细胞的制备:
[0050]I)在MRS培养基平板上进行植物乳杆菌菌种活化，培养温度为37°C。MRS固体培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g，2%的琼脂粉，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121 °C下灭菌，20分钟。
[0051 ] 2)挑取平板上的单菌落接入MRS液体培养基活化，培养温度为37°C。MRS液体培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g,加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0052]3)将菌种接种于MRS液体培养基中，厌氧培养至OD6tltlnm为0.8 ;
[0053]4)将菌液放入离心管中，4°C，4000rmp离心15-20分钟，弃上清，得菌体；
[0054]5)用1/10体积冰冷的洗涤液洗涤细胞，4°C，4000rmp离心15-20分钟，弃上清；
[0055]6)将上述离心管在冰上放置5min ；
[0056]7)用1/10体积冰冷的洗涤液洗涤细胞，4°C，4000rmp离心15-20分钟，弃上清；
[0057]8)用1/100体积冰冷的洗涤液重悬菌液；
[0058]9)将上述得到的感受态细胞以50 μ L/支的体积分装，用封口胶封口，冰上放置IOmin, _80°C保存(每次使用前于冰上溶化)。
[0059]2.电穿孔法对原生质体进行`外源DNA转化:
[0060]1)DNA制备。用于转化的外源质粒pMG36e扩增提取后溶于无菌去离子水，浓度为5ng/ μ L,用于转化。
[0061 ] 2)每50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀，将混合液加入冰上预冷的2cm电击杯中，准备电穿孔仪，设定电压2.49KV，进行电击；
[0062]3)电击后电击杯中加入ImL含蔗糖浓度为0.1M的MRS液体培养基，冰浴10分钟，37V复苏3h，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现；所述的MRS培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温
1.0g,加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0063]4)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基中长出，其红霉素的浓度为5 μ g/ μ L。
[0064]结果:
[0065]转化效率相对于之前有较大的提高。
[0066]实施例3:利用电穿孔法对植物乳杆菌进行外源抗红霉素基因的遗传转化
[0067]利用
【发明内容】
中所述的方法，将含红霉素抗性基因的外源质粒pMG36e导入植物乳杆菌，通过红霉素筛选获得稳定转化的工程菌，得到较高的转化效率。具体方法如下:
[0068]1.植物乳杆菌感受态细胞的制备:
[0069]I)在MRS培养基平板上进行植物乳杆菌菌种活化，培养温度为37°C。MRS固体培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾
2.0g,乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g，2%的琼脂粉，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121 °C下灭菌，20分钟。[0070]2)挑取平板上的单菌落接入MRS液体培养基活化，培养温度为37°C。MRS液体培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾
2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g,加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0071]3)将菌种接种于MRS液体培养基中，厌氧培养至OD6tltlnm为0.5 ;
[0072]4)将菌液放入离心管中，4°C，4000rmp离心15_20分钟，弃上清，得菌体；
[0073]5)用1/10体积冰冷的洗涤液洗涤细胞，4°C，4000rmp离心15_20分钟，弃上清；
[0074]6)将上述离心管在冰上放置5min ；
[0075]7)用1/10体积冰冷的洗涤液洗涤细胞，4°C，4000rmp离心15_20分钟，弃上清；
[0076]8)用1/100体积冰冷的洗涤液重悬菌液；
[0077]9)将上述得到的感受态细胞以50 μ L/支的体积分装，用封口胶封口，冰上放置IOmin, _80°C保存(每次使用前于冰上溶化)。
[0078]2.电穿孔法对原生质体进行外源DNA转化:
[0079]1)DNA制备。用于转化的外源质粒pMG36e扩增提取后溶于无菌去离子水，浓度为
0.5ng/ μ L,用于转化。
[0080]2)每50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀，将混合液加入冰上预冷的2cm电击杯中，准备电穿孔仪，设定电压2.49KV，进行电击；
[0081]3)电击后电击杯中加入ImL含蔗糖浓度为0.1M的MRS液体培养基，冰浴10分钟，37 V复苏2.5h，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现；所述的MRS培养基终浓度为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。
[0082]4)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基中长出，其红霉素的浓度为5 μ g/ μ L。
[0083]结果:
[0084]转化效率在105cfu/ug质粒DNA以上，相对于之前转化效率有较大的提高。
【权利要求】
1.一种植物乳杆菌的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行: 1)将植物乳杆菌用MRS培养基，以显微镜检查计数，调整植物乳杆菌菌浓在IO8Cfu/mL ； 2)用于转化的外源DNA即质粒DNA溶于无菌去离子水至浓度为0.5ng/ μ L，每50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀； 3)在预冷的电击杯中加入步骤2)所得混合液，用电穿孔仪进行电击； 4)电击后电击杯中加入含蔗糖浓度为O~0.4M的MRS液体培养基，冰浴10分钟，37°C复苏2.5h，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现。所述的MRS培养基终浓度为:蛋白胨l0.0g，牛肉膏10.(^，酵母膏5.(^，无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温.l.0g，加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟。 5)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基中长出，其红霉素的浓度为5μ g/ μ L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的菌体浓度及菌体生长状态在OD6tltlnm在.0.3~0.8之间。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的恢复培养基的蔗糖浓度在O~0.4Μ之间。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的电击后的菌体复苏时间在I~3h之间。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的菌体生长状态确定方法:利用紫外分光光度计OD6tltol时的测定值，对菌株进行感受态细胞制备，然后进行电转化，平板压力筛选观察试验结果，以获得转化子。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的恢复培养基为添加蔗糖浓度为O~.0.4M之间的MRS培养基，其中MRS培养基的配制方法为:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g,无水葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g,柠檬酸铵2.0g,吐温1.0g,加入1000mL蒸馏水，调pH为6.2~6.4，121°C下灭菌，20分钟加入终浓度O~0.4M蔗糖。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的菌体复苏时间应在37°C培养箱中进行复苏培养。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外源DNA为带有红霉素抗性基因的质粒pMG36e,所述的抗生素为红霉素。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行: .1)将植物乳杆菌用MRS培养基，以显微镜检查计数，调整植物乳杆菌菌浓在IO8Cfu/mL ； .2)用于转化的外源质粒pMG36e扩增提取后溶于无菌去离子水0.5ng~5ng/ μ L,每.50 μ L感受态细胞加入0.5ng质粒DNA混匀； .3)冰上预冷的2cm电击杯中加入步骤2)所得混合液51yL，准备电穿孔仪，设定电压.2.49KV，进行电击； 4)电击后电击杯中加入ImL含蔗糖浓度为O~0.4M的MRS液体培养基，冰浴10分钟，.37 V复苏2.5h，8000rpm离心Imin涂布于含红霉素抗性的MRS培养基平板，37°C培养4d，转化子出现。5)转化子在含红霉素抗性的MRS培养基`中长出，其红霉素的浓度为5 μ g/μ L。
【文档编号】C12R1/25GK103820484SQ201210461844
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2012年11月16日
【发明者】白小佳, 张新利, 王艳萍, 王金菊 申请人:天津科技大学