专利名称：一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及基因的随机突变和定点突变技术，尤其是一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法。
背景技术：
木聚糖酶(l，4-0-D-xylanase;EC3.2. 1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景。特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界同行的高度关注。通过木聚糖酶对纸浆的预处理，不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性， 减轻环境污染。但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50 60°C左右，最适作用pH在5. O 7. O左右，而纸浆蒸煮完毕时，温度为95 100°C，pH值为10 12，这就要求在加酶之前先将纸浆的pH和温度调到适合木聚糖酶作用的范围，从而使工艺流程复杂化并造成生产成本增加。随着木聚糖酶分子生物学研究的不断深入，应用基因工程以及蛋白质工程手段对现有木聚糖酶进行定向的分子改造有望解决这一问题。酶分子的定向进化是基于模拟体内蛋白分子的自然进化机制，通过体外随机突变和基因重组等方法构建随机突变文库，结合有益基因的定向筛选方案，从而可在相对较短时间内得到工业或市场所需要的性质优良的突变酶，该方法适用于空间结构和催化机制研究得并不清楚的蛋白的分子改造，在蛋白质工程中属于蛋白质的非理性设计。易错PCR是蛋白质分子定向进化的常用技术，通过对PCR体系中dNTP比例及Mg2+浓度的改变，并添加相应浓度的Mn2+，从而提高PCR过程中的错配率，以达到随机突变的效果。然而，就像自然进化是一个长期而复杂的积累过程一样，单纯通过一次易错PCR往往很难得到理想的结果，因此，通过多轮连续的易错PCR和合理的定向筛选方可得到有益突变的积累，有利于优良突变酶的获得。定点突变是改造及优化基因的最常用和最便捷的基因工程手段，它是在对蛋白分子结构和功能进行详尽的分析之后，从而有针对性的设计突变位点，达到迅速、高效的提高目的蛋白的性状及表征的目的，是一种理性的分子改造方案。而酶分子的定向改造是一个复杂而艰巨的任务，应用单一的改造技术很难达到预期目标，通常需要应用多种技术相结合的方法达到预期的改造目的。目前已有上百种来自于细菌和真菌的木聚糖酶基因得到了克隆和表达，研究细菌木聚糖酶基因的外源表达与调控的原核表达系统应用最多的是大肠杆菌表达系统，随着研究的发展，芽孢杆菌表达系统具有非致病性、分泌蛋白能力强和发酵基础良好等特性，逐步成为目前分泌表达外源蛋白较为理想的原核表达系统，但国内外对芽孢杆菌表达系统研究较多的是枯草芽孢杆菌表达系统，其他芽孢杆菌表达系统的报道却很少。巨大芽孢杆菌表达系统作为一种极具潜力的分泌型外源基因表达系统，具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点，近年来在工业以及学术研究领域得到了广泛的应用。国内外对木聚糖酶的研究已进入分子生物学阶段，Hirohito等从碱性菌株Bacillus sp. 4IM-1中克隆得到碱性木聚糖酶基因XynJ，通过在该酶的活性中心引进精氨酸突变，构建二硫桥，成功使其最适作用PH从8. 5上升到9. 5，这也是目前所研究的木聚糖酶的最适PH的最高水平，但其最适作用温度为65°C，仍属中温木聚糖酶，其在造纸高温环境中的应用仍受到一定的局限。而目前研究的最适作用温度最高的是一种来自于硫化叶菌属Sulfolobus solfataricus Oa的木聚糖酶,其最适作用温度为95°C,但其最适作用pH为3. 5,不适合在造纸工业的碱性环境中应用。在国内，木聚糖酶的最适作用温度最高为85°C,而其最适作用PH为6. 5，是2009年新疆大学的Wei Zhang等将嗜热网团菌的木聚糖酶基因xynB在Bacillus subtilis中表达的木聚糖酶；2008年,上海交通大学的Q. Wang等应用DNA shuffling和定点突变等技术对褐色嗜热单孢菌木聚糖酶进行定向改造，其最适作用pH 9. O为国内最高水平，而其最适作用温度为60°C。可见，目前开发的木聚糖酶难以兼顾耐高温、耐高碱性及高活力的特性，不能适应造纸工业高温高碱性的极端应用环境的要求。因此，为促进造纸工业的清洁生产，亟待开发一种在闻温、闻pH值条件下具有闻活力的耐闻温闻喊木聚糖酶。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法，本发明制备获得的该耐高温高碱木聚糖酶，其最适作用温度70°C，最适作用pH为9. O,并且在高温和高碱的条件下较稳定，90°C保温2h，残余酶活为38. 2%，而原始酶XynGl-1的酶活则完全丧失；在pHll. O条件下保存3h，残余酶活为44%，比原始酶XynGl-1提高了 57%。
本发明实现目的的技术方案如下—种耐闻温闻喊木聚糖酶基因，其基因序列为序列13。一种耐高温高碱木聚糖酶基因的构建方法，应用两轮连续易错PCR方法对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因XynGl-1进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖基因XynGl-1为序列11，耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl_lB43为序列12，应用定点突变的方法对序列12的耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43进行耐高温的定向分子改造，得到耐高温高碱木聚糖酶的突变基因XynGl-lB43CC16，其突变位点为Aspl6Tyr、Thr84Cys 和 Thrl82Cys。一种高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，含耐高温高碱木聚糖酶基因。而且,所述工程菌的宿主细胞为Bacillus megaterium MS941。而且，所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PSTREPHIS1525。—种耐闻温闻喊木聚糖酶，具有基因序列为序列13所述的基因编码的蛋白序列。而且，由上述述的工程菌发酵得到。而且,所述的木聚糖酶的最适作用温度为70°C,最适作用pH为9. O。一种耐高温高碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤如下⑴对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)见序列11 ；
⑵对耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl_lB43)进行定点突变，突变位点为Aspl6Tyr、Thr84Cys和Thrl82Cys,得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynGl_lB43CC16),所述耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)见序列12 ；⑶将上述耐闻温闻喊木聚糖酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐闻温闻喊木聚糖酶基因的重组载体；⑷将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；(5)重组菌株分泌表达，发酵制备耐高温高碱木聚糖酶。本发明的优点和积极效果如下1、本发明利用易错PCR和定点突变技术，对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因进行定向改造，获得耐高温高碱木聚糖酶基因XynGl-lB43CC16(V90R/P172H/T84C-T182C/D16Y)，并通过分泌型表达载体，转化巨大芽孢杆菌，使耐高温高碱木聚糖酶得以分泌表达，制备获得的耐高温高碱木聚糖酶的最适作用温度为70°C，最适作用pH为9. 0，并且在高温和高碱的条件下较稳定，90°C保温2h，残余酶活为38. 2%，而原始酶XynGl-1的酶活则完全丧失；在pHll. O条件下保存3h，残余酶活为44%，比原始酶XynGl-1提高了 57%。2、本发明制备的耐高温高碱木聚糖酶适用于造纸工业的生物制浆与漂白，不仅可以提高纸浆白度和得率，还可以减少后继工序化学漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染，降低漂白成本，即可带来显著的社会效益、经济效益和环境效益。
图1为本发明易错PCR随机突变文库的构建示意图；图2为本发明纯化后原始酶XynGl-1、耐碱性突变酶XynGl_lB43及其耐高温高碱突变酶XynGl-lB43CC16的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，I为XynGl-1纯化后蛋白；2为XynGl-lB43纯化后蛋白；3为XynGl_lB43CC16纯化后蛋白；M为蛋白Marker ；图3为本发明纯化后XynGl-1及XynGl_lB43CC16的最适作用温度(3_1)和在90°C、pH9保温2h条件下热稳定性(3-2)的测定曲线图；纯化后XynGl-1及XynGl_lB43CC16的最适作用PH (3-3)和在70°C、pHll保温3h条件下pH稳定性(3_4)的测定曲线图。图4为本发明重组质粒构建流程图；图5为本发明重组木聚糖酶的SDS-PAGE及酶谱分析图，其中，M :蛋白Marker ；I B. megaterium MS941 (pSTREPHIS1525)的胞内蛋白；2 :B. megateriumMSMl (pSH-XynGl-lB43CC16)的胞内蛋白；3 B. megaterium MS941 (pSTREPHIS1525)的胞外蛋白；4 :B. megaterium MS941 (pSH-XynGl_lB43CC16)的胞外蛋白;5 :纯化后 XynGl_lB43CC16BM ;6:XynGl-lB43CC16BM 的酶谱分析。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明； 下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明利用易错PCR和定点突变技术对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因进行定向改造获得耐高温高碱木聚糖酶突变基因，具体为利用易错PCR技术对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;再对耐碱性木聚糖酶 突变基因(XynGl-lB43)进行定点突变，突变位点为Aspl6Tyr、Thr84Cys和Thrl82Cys, 得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynGl-lB43CC16);然后将得到的耐高温高碱木聚糖酶基 因克隆到大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭表达载体PSTREPHIS1525上，转化到宿主菌Bacillus megateriumMS941中，实现耐高温高碱木聚糖酶的分泌表达，成功制备获得一种耐高温高碱 木聚糖酶。一、易错PCR随机突变文库的构建1、设计引物利用Primer 5. 0设计出一对扩增类芽孢杆菌木聚糖酶基因成熟肽序列的引物， 分别为XynGl-1上游引物(序列1)5，-CCCAAGCTTGCAACCACGATCACTTCTAACGAGA-3，(下划线部分为加入的 Hindlll 酶 切位点，CCC为保护碱基)XynGl-1下游引物(序列4)5’ -CCGCTCGAGTCACCGGATCTCCAAATAGTCAATG-3’ (下划线部分为加入的 Xhol 酶切 位点，CCG为保护碱基)2、易错PCR扩增条件以提取的质粒pET-XynGl-1为模板，应用扩增XynGl-1成熟肽的引物进行易错PCR 反应，反应体系(100 UL)如下
10 X PCR 缓冲液(Mg2' Free)I O.OpL
10XdNTP(dATP 和 dGTP: dCTP |B dTTP=l； 5) lO.OuL XynGl-l h游引物《Wmmol/L)L5^iL
XynGl-1 下游引物(iOmmol/L)L5pL
质粒模板 pET-Xj G7-/{0.01 pg/juL)1 pL
Taq DNA W *_(500U/mL)1 pL
Mg2 飞 25mmoi/L)20}iL
Mn2(5mmol/L)3pL
ddH20补足丨00p LPCR 反应条件为95°C 5min ；94°C 45S，55°C 45S，72°C 90S，30 个循环；72°C延长 10mino使用PCR产物纯化试剂盒纯化目的DNA产物，将其溶解于30 ii L ddH20中，应用 0. 8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。3、随机突变文库的构建易错PCR获得的突变基因，用限制性内切酶Hindlll和Xhol分别对突变基因和 质粒pET22b(+)进行双酶切，并将酶切后的基因产物和载体在16°C下连接4h，连接产物转 化E. coli DH5 a感受态细胞，将得到的所有克隆共培养并提取质粒，并将混合质粒转化至 E. coli BL21感受态细胞，将重组细胞涂布于木聚糖筛选平板上，即得到随机突变的单克隆子，实验流程见图1。二、耐碱性突变酶的筛选应用碱性木聚糖平板初筛和96孔板酶活测定复筛，对突变基因进行高通量筛选，最终获得5个耐碱性明显提高的突变酶，分别为XynGl-lB05 (V90R)、XynGl-lB22 (V90R/I124T)、XynG卜 1B43 (V90R/P172H)、XynGl-lB56 (V90R/P172H/1124T)和XynGl-lB72(P172H)，其中，突变体XynGl_lB43在ρΗ9· 0、60°C条件下的酶活力为12. 15IU/mL是XynGl-1的2. 5倍，为突变酶中最高，其最适作用pH提高了两个单位(ρΗ7· O — ρΗ9· 0)，在pHll. O条件下保存3h后，残余酶活为42%，比原始酶提高了 50%。三、定点突变提高耐碱性木聚糖酶XynGl_lB43的耐高温性1、设计定点突变所用弓丨物
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通过www. swissmodel. expasy. org网站的蛋白质数据，对XynGl_lB43进行同源建模，将其空间结构和氨基酸序列与已报道的耐高温木聚糖酶进行对比分析，并结合已报道的影响木聚糖酶耐热性的因素，选择三个突变位点，其中，T84C和T182C两个突变点共同构成一个新的二硫键(C84-C182);而突变点D16Y是为了在XynGl-lB43的表面增加芳香族氨基酸残基，通过与两边的Y15和Y17形成疏水相互作用，从而提高木聚糖酶的热稳定性。所用引物见表I。表I定点突变引物(序列f 8)
权利要求
1.一种耐闻温闻喊木聚糖酶基因，其特征在于其基因序列为序列13。
2.一种耐高温高碱木聚糖酶基因的构建方法，其特征在于应用两轮连续易错PCR方法对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因XynGl-1进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖基因XynGl-1为序列11，耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43为序列12，应用定点突变的方法对序列12的耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43进行耐高温的定向分子改造，得到耐高温高碱木聚糖酶的突变基因XynGl-lB43CC16，其突变位点为Asp16Tyr、Thr84Cys 和 Thrl82Cys。
3.一种高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于含有如权利要求1所述的耐高温高碱木聚糖酶基因。
4.根据权利要求4所述的高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于所述工程菌的宿主细胞为 Bacillus megaterium MS941。
5.根据权利要求3或4所述的高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PSTREPHIS1525。
6.一种耐高温高碱木聚糖酶，其特征在于具有如权利要求1所述的基因编码的蛋白序列。
7.根据权利要求6所述的耐高温高碱木聚糖酶，其特征在于由权利要求3所述的工程菌发酵得到。
8.根据权利要求6所述的耐高温高碱木聚糖酶，其特征在于所述的木聚糖酶的最适作用温度为70°C，最适作用pH为9.0。
9.一种如权利要求6所述的耐高温高碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤如下 ⑴对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ；所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)见序列11 ； ⑵对耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)进行定点突变，突变位点为Aspl6Tyr、Thr84Cys和Thrl82Cys，得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynGl_lB43CC16)，所述耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)见序列12 ； ⑶将上述耐闻温闻喊木聚糖酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐闻温闻喊木聚糖酶基因的重组载体； ⑷将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株； (5)重组菌株分泌表达，发酵制备耐高温高碱木聚糖酶。
全文摘要
本发明涉及一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用易错PCR和定点突变技术对来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌的木聚糖酶基因XynG1-1进行耐高温和高碱的定向分子改造，得到耐高温高碱的木聚糖酶突变基因XynG1-1B43CC16，并利用巨大芽孢杆菌表达系统，分泌表达耐高温高碱木聚糖酶的方法。本发明解决了现有木聚糖酶耐高温与耐碱性无法同时兼顾，造成其在造纸工业中应用受限的问题，满足了木聚糖酶在高温和高碱性环境下进行生物制浆和生物漂白的要求，可提高纸浆白度和得率，减少造纸工业中化学试剂的用量，降低环境污染，促进造纸工业的清洁生产。
文档编号C12N15/75GK103045624SQ20121047006
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者路福平, 刘逸寒, 郑宏臣, 樊帅, 王春霞, 王建玲 申请人:天津科技大学