专利名称：编码猪β干扰素的基因片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码猪β干扰素的基因片段及其应用。
背景技术：
近年来猪病毒性传染病日益泛滥，已严重地威胁着我国畜牧业的持续发展。免疫抑制病及病毒抗原快迅变异，常导致疫苗免疫失败；加之不断出现新的病毒病，目前还尚无 成功的疫苗接种预防。另ー方面，疫苗对疾病只有预防作用，治疗还有赖于抗生素的使用。而ー些抗药性菌株的出现，给人类食品和健康带来极大的威胁，ー些国家已明令禁止在养殖生产中应用某些抗生素和抗菌剂。因此，生产中迫切需要ー种既有效又有利于环保的新方法来防控畜禽疾病。实践证明，干扰素作为ー种广谱的抗病毒剂，在病毒性传染病的防控方面具有广阔的应用前景。传统的生产方法由中草药等诱生剂诱导产生干扰素，因纯化工艺复杂，产量少、作用缓和等诸多因素影响而极大限制了在临床和科研的应用。随着猪干扰素基因的克隆成功，对其重组产物的临床应用及作用机理的研究也随之展开。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大肠杆菌中表达了 PoIFN-α I基因，得到了ー个含189个氨基酸的前体蛋白，去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后，得到了具有完全天然PoIFN-α I生物学活性的产物，并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍。Pol JM等(1991)研究发现rPoIFN-a I能够抑制伪狂犬病毒(PRV)强毒和中等毒力病毒在猪鼻腔黏膜组织stroma细胞层的増殖，PRV接种干扰素处理的猪成纤维细胞和猪肾细胞，病毒滴度明显下降。Horisberger MA (1992)比较了重组PoIFN-α (rPoIFN-a )和重组PoIFN-Y (rPoIFN-Y )在猪的细胞中抗病毒活性的区别，发现rPoIFN- a可大大降低猪水泡性ロ炎病毒(VSV)在猪PK-15上引起的病变，井能削弱猪水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在猪肾细胞中的复制，但rPoIFN-a和rPoIFN-γ对门戈病毒(一种脑心肌炎病毒)都有抗病毒作用。Jordan LT等(1994)发现rPoIFN-α对传染性胃肠炎病毒(TGEV)有很好的预防作用。Tonomura N等(1996)研究发现HuIFN-α处理Vero后PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在干扰素处理的Vero中降低，瞬时表达试验表明PRV IE启动子的转录被选择性抑制。BuddaertW (1998)对rPoIFN-α在体内、外对猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的抗病毒活性进行了研究，发现PRRSV在体内、外对rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明显抑制PRRSV的产量和感染细胞的数量。chinsangaram J.等(2001)人用大肠杆菌表达rPoIFN-α或rPolFN-β并分别进行了抗ロ蹄疫病毒(FMDV)实验，发现rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV复制是在蛋白质翻译水平上的，主要是激活双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)作用的结果在细胞中加入PKR抑制剂2_氨基嘌呤后,病毒的产量就会上升；而RNase L和PKR基因缺失的细胞在干扰素的作用下仍能感染FMDV，这充分说明了 PKR在抑制病毒复制中起作用。我国学者也对猪α干扰素进行了多项研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一种新的猪IFN-α基因并在大肠杆菌中进行了其成熟蛋白的单纯表达，表达产物具有较高的抗病毒活性。杜以军等利用猪IFN-α的成熟蛋白基因构建了重组腺病毒质粒pAd-PoIFN-a转染HEK-293A细胞，滴度为107TCID5(l/mL。RT-PCR证明目的基因在mRNA水平上可有效表达；在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性，从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。谢海燕等(2004)克隆了猪IFN-a基因，构建了原核表达载体，初步对其进行了原核表达研究；我国学者夏春等(2005)报道了用pQE30表达载体在大肠杆菌原核表达的rPoIFN-α在猪源细胞和非猪源细胞系上可显著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，证 明了原核表达PoIFN-a的可行性及将基因工程原核表达的PoIFN-α真正用于生产实践中作为抗病毒制剂可行性。曹瑞兵等对猪IFN-a I基因进行了改造，在保留编码蛋白序列的同时，使用了大肠埃希菌的偏爱密码子，将合成的猪IFN-a I成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体PRLC中，实现了猪IFN-a I在大肠埃希菌中的高效表达，且重组猪IFN-a I具有较高的抗病毒活性，约为6.4X106U/mg。此外，葛丽等(2005)克隆了猪IFN-α基因，构建了真核表达载体，初步对其做了毕赤酵母分泌表达研究。刘占通等对丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-a基因进行克隆，得到了上述4个品系的猪IFN-a基因，证明核苷酸同源性均在97. 2%以上，氨基酸同源性均在92. 8%以上。在猪β干扰素基因研究方面，2000年夏春等首次对猪干扰素β基因进行分子克隆与测序，克隆片段长668个核苷酸，编码186个氨基酸。其中，76 636位含有I个0RF，蛋白分子量为21.8KU。除此之外，温纳相(2005)和彭贵青(2005)也对猪干扰素β的基因进行了分子克隆与测序，并检测其生物活性。在表达方面，曹瑞兵(2004)和吴阳(2006)分别对猪β干扰素的基因进行了原核表达，表达量分别为17. 3%和18%，表达产物均为融合蛋白。其中曹瑞兵用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞ΡΚ-15后，细胞病变抑制法(CPE5tl)測定结果表明，重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹 写病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的感染。而后，为了研制高活性的重组猪β干扰素，曹瑞兵(2006)对猪干扰素β进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达质粒PPICZ α A-PIB, pPICZ a A-PIB电转化导入毕赤酵母菌株Χ_33后经甲醇诱导发酵高产量分泌表达猪IFN-β，其中BI株酵母的IFN-β产量最高，约为2. 5X IO5U/mL,其表达量约为60 μ g/mL,比活为4. 17 X 106U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDS-PAGE和Western-blot检测，结果表明表达产物是分子量约为28Ku和25Ku蛋白的混合物，两者均可与猪IFN-β阳性抗血清发生特异反应。表达产物比猪IFN-β理论推导分子量(约20.8KU)大，推測可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组猪IFN-β对伪狂犬病毒在细胞中増殖可呈现抑制作用，并且猪IFN-β对伪狂犬病毒在牛肾细胞(MadenDarbyBovine Kidney cells, MDBK)上早期增埴的抑制效果最为明显。在猪Y干扰素基因研究方面，IFN-Y虽然只有ー种基因，但其结构更为复杂，如编码人和鼠IFN-Y的基因长约6Kb，各包含有4个外显子和3个内含子。IFN-Y与I型干扰素(IFN-α与IFN-β)田在基因和蛋白质水平上没有明显的相关性(DeGrado，etal，1991)。虽然IFN-Y具有其它干扰素大多数的生物学活性，但在特异性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫调节活性方面要高100-10000倍(Pace, etal, 1985)。猪IFN- Y全基因编码166个氨基酸残基，其中包括20aa的信号肽(Di jkmans，etal，1990)。信号肽切除后，产生146个氨基酸的IFN-γ単体，分子量为17. 3ku，天然活性状态的IFN-Y是由两个IFN-Y单体经非共价交联形成的同源ニ聚体糖蛋白((Boehm, etal, 1997)。猪 IFN- Y 与人、小鼠、猫和犬的 IFN- Y 分别具有 60%，41%, 72%和 72%的同源性，而与IFN-β及IFN-α家族没有明显的同源性(Farrar and Schreiber, 1993)。国外最早于1990年由Roger等从基因水平开展了对猪Y干扰素的研究，他们以人Y干扰素的cDNA为探针，克隆了猪Y干扰素基因，发现与人Y干扰素在DNA和氨基酸的水平上分别有75%和59%的同源性(Di jkmans et al.，1990)。随后,Vandenbroeck等利用原核表达系统表达了猪Y干扰素(Vandenbroeck et al.，1991)。在我国，郭铼军等于2001年首次克隆报道了猪Y干扰素基因序列(郭稼军等，2001)。迄今为止，夏春，曹瑞兵(吴文学等，2002;曹瑞兵等，2003;曹瑞兵等，2004)等人以原核系统表达的干扰素具有较好的生物学活性。曹瑞兵等从经刀豆蛋白A (ConcanavalinA，ConA)诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪IFN-Y基因，经改造后插入原核表达载体pRLC，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在，经变性、复性、脱盐、凝胶层析纯化处理，重组猪IFN-Y具有较高的干扰素活性。赵英杰等成功构建了表达重组猪IFN-Y的大肠埃希氏菌基因工程菌株，亚细胞定位分析表明，目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。其对长白猪Y-干扰素基因的原核表达与分析，说明几种我国地方猪IFN-Y在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变，同时也证实了长白猪干扰素-Y基因的正确、完整克隆。为了研究和应用猪重组干扰素-Y预防和治疗病毒性疫病，夏春将大白猪IFN-Y基因插入到酵母整合载体PHIL-S1，构建了重组GSl 15工程菌。经过SDS-PAGE、Western_blot分析和抗水泡性口炎病毒(VSV)活性測定，证实猪IFN-Y分子量为18Ku，在GS115中的表达量为18%，具有抗VSV的活性。用猪IFN- Y处理猪肺巨噬细胞系Marc-145后，经细胞病变抑制法测定，猪IFN-γ可以抵抗猪蓝耳病病毒(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome Virus, PRRSV)感染。但以上技术均具有原基因密码子的表达量低、抗病毒活性低的缺陷。
发明内容
本发明的目的是依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子对猪α、β和Y干扰素成熟肽核苷酸序列进行基因修饰和改造，并构建出重组酵母表达质粒pPICZ a C-IFN-a、pPICZa C-IFN-β 和 pPICZ a C-IFN-γ，其可以在毕赤酵母中对猪 α、β和Y干扰素正确且高效表达。密码子改造后所分泌的蛋白干扰素具有更好的抗病毒活性。干扰素具有很高的生物活性，Img即具有I亿个活性単位。基因重组猪a、β干扰素都属于I型干扰素，具有广谱抗病毒活性；基因重组猪Y干扰素属于II型干扰素，具有很好的免疫调节作用。通过基因工程方法，根据密码子的偏嗜性，重新合成猪α、β、Y三种干扰素基因核苷酸序列，在优化诱导表达条件的基础上，提高干扰素蛋白在毕赤酵母菌中的表达量，为大规模发酵生产奠定了基础。因此，在本发明基础上，猪a、β、Υ三种干扰素推广应用前景广阔。本发明提供了一种编码猪α干扰素的基因片段，其具有如SEQ IDN0. I所示的核苷酸序列。用于扩增其序列的上游引物Pa1具有如SEQID NO. 2所示的核苷酸序列；下游引物Pa2具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于构建可表达猪α干扰素的重组毕赤酵母。本发明还提供了一种编码猪β干扰素的基因片段，其具有如SEQID NO. 4所示的核苷酸序列。用于扩增其序列的上游引物PP1具有如SEQ ID Ν0.5所示的核苷酸序列；下游引物Ρβ2具有如SEQ ID Ν0.6所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于构建可表达猪β干扰素的重组毕赤酵母。本发明还提供一种编码猪Y干扰素的基因片段，其具有如SEQ IDN0.7所示的核苷酸序列。用于扩增其序列的上游引物P Y1具有如SEQID NO. 8所示的核苷酸序列；下游引物PY2具有如SEQ ID Ν0.9所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于构建可表达猪Y干扰素的重组毕赤酵母。构建重组酵母时，采用的表达载体优选是pPICZ α C，重组质粒优选是 pMD-IFN- α、pMD-IFN- β 和 pMD-IFN- y。与传统方法的表达的干扰素相比，本发明通过研究，达到了表达量高，成本较低，效价较高，质量稳定，因此为产品转化创造了先决条件，具有很好的市场潜カ和较强的市场竞争力，更易在规模化猪场中广泛推广应用。基因重组的猪α干扰素具有很好的抗病毒作用，可以单独使用治疗多种猪病毒性疾病；将表达的猪Y干扰素作为疫苗佐剂，与不同的疫苗联合，可以研制出免疫效果更好的新型疫苗，将对猪病毒性疾病防治产生积极的影响。因此，本发明在市场上具有良好的应用前景。在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。本发明通过精心设计，对猪三种干扰素进行了基因修饰和改造，经显示系统表明，密码子改造后所分泌蛋白猪三种干扰素具有更好的抗病毒活性。
图I是本发明实施例的PoIFN-α改造前后的氨基酸序列关联性； 图2是本发明实施例的PoIFN- α改造前后的碱基序列关联性；图3是本发明实施例的PoIFN-β改造前后的氨基酸序列关联性；图4是本发明实施例的PoIFN- β改造前后的碱基序列关联性；图5是本发明实施例的PoIFN- Y改造前后的氨基酸序列关联性；图6是本发明实施例的PoIFN- Y改造前后的碱基序列关联性。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进ー步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。(一)基因改造应用DNASTAR (Version 5. O)基因分析软件，參照NCBI GenBank上登载的猪干扰素α基因成熟肽核苷酸序列(ΑΥ331298)、猪干扰素β基因成熟肽核苷酸序列(S41178)和猪干扰素Y基因成熟肽序列(EU249804)，參照赵翔等毕赤酵母菌的密码子用法分析以及TaKaRa公司的Pichia酵母密码子表等，按照该序列氨基酸顺序不变，因此表达的蛋白质不发生变化，同时根据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计新序列，送由大连宝生物工程有限公司重新合成序列。I、猪α干扰素新序列，如SEQ ID NO. I所示，共501bp ;编码166个氨基酸，如SEQID NO. 10 所示。引物Pa1 (SEQ ID N02) CG GAATTCCTGTGACTTGCCACAAACCCACT(标有下划线处为EcoRI限制性内切酶)Pa2 (SEQ ID NO. 3) GG GGTACC TTACTCCTTCTTTCTCAATCTG(标有下划线处为KpnI限制性内切酶)上、下游引物的理论跨幅为518bp，退火温度58°C2、猪β干扰素新序列，如SEQ ID NO. 4所示，共498bp ;编码165个氨基酸，如SEQID NO. 11 所示。P^1 (SEQ ID NO. 5) CG GAATTC CATGTCCTACGACGTCT(标有下划线处为EcoRI限制性内切酶)Ρβ2 (SEQ ID NO. 6) GG GGTACC TTAGTTTCTCAAGTAGTCG(标有下划线处为KpnI限制性内切酶)上、下游引物的理论跨幅为513bp，退火温度52°C3、猪Y干扰素新序列，如SEQ ID NO. 7所示，共432bp ;编码143个氨基酸，如SEQID NO. 12 所示。Py1 (SEQ ID NO. 8) CG GAATTC CCAG GCT CCA TTT TTC AA(标有下划线处为EcoRI限制性内切酶)Py2 (SEQ ID NO. 9) GGGGTACC TTA CTT GGA GGC TCT CTG AC(标有下划线处为KpnI限制性内切酶)上、下游引物的理论跨幅为449bp，退火温度50. 7V(ニ)重组表达质粒的构建(以 pPICZ a C-IFN- α 为例，pPICZ a C-IFN- β、pPICZ a C-IFN- y 与此相同)I、重组质粒与表达载体的双酶切对重组质粒pMD-IFN-α进行EcoR I和Kpn I双酶切，双酶切反应体系如下
权利要求
1.一种编码猪β干扰素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的基因片段，其特征在于，用于扩增其序列的上游引物Ρβi具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；下游引物P β2具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的基因片段，其特征在于，用于扩增其序列的PCR方法的退火温度为 52。。。
4.权利要求f3所述的基因片段在构建可表达猪β干扰素的重组毕赤酵母中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，采用的表达载体是pPICZα C，重组质粒是pMD-IFN-β 。
6.一种猪β干扰素，其特征在于，其具有如SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。
7.权利要求6所述的猪β干扰素在制备抗病毒药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物为抗猪病毒性疾病的药物。
9.一种抗病毒药物，其特征在于，含有权利要求6所述的猪β干扰素。
全文摘要
本发明依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计合成新的猪β干扰素成熟肽核苷酸序列。成功地构建了重组酵母表达质粒pPICZαC-IFN-β，不仅在毕赤酵母中对猪β干扰素实现了正确表达，而且使猪β干扰素在毕赤酵母菌中表达更容易，表达量更高，为基因工程大规模生产发酵奠定了基础。
文档编号C12N15/22GK102978213SQ20121052975
公开日2013年3月20日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者罗满林, 陈瑞爱, 刘健, 张欣, 唐明森 申请人:华南农业大学, 广东大华农动物保健品股份有限公司