用于确定心力衰竭或心力衰竭的风险的方法和组合物的制作方法

用于确定心力衰竭或心力衰竭的风险的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明部分基于miR组的发现，所述miR的水平在慢性心脏收缩HF患者的循环中增加或降低。因此，在稳定的慢性心脏收缩HF患者的血清中，对大范围的miR组进行筛选，并将结果与年龄、性别和种族相匹配的对照组相比较。
【专利说明】用于确定心力衰竭或心力衰竭的风险的方法和组合物
发明领域
[0001]本发明通常涉及与心力衰竭有关的微RNA分子，以及与其相关或其衍生的多种核酸分子。
[0002]发明背景
心力衰竭是一种病理生理状态，其中心脏不能泵送足量的血液以满足代谢中的组织或细胞的营养和氧气需求。其为许多心脏病中主要的并发症。超过40岁的成人具有估计的21% 发展心力衰竭的终身风险(Lloyd-Jones 等，2002，Circulation 106, 3068-72)，其为比组合的所有形式癌症导致更多住院治疗的病况(美国心脏病协会(American HeartAssociation).心脏病和中风统计(Heart Disease and Stroke Statistics) 2003 年更新)。
[0003]在过去几年中进行的研究表明，转录控制和心脏病基因表达似乎在心力衰竭(HF)的发病机理和临床表现中起到重要的作用(Li等，2011，Cardiovasc Res.(6):498-512)。
[0004]特别是，先前研究表明，HF患者中信使RNA (mRNA)的下调提示抑制mRNA稳态水平的分子机制的重要性(Kaab等，2004，J Mol Med.82: 308 - 316)。
[0005]在近年来，微RNA (miRNA、miR)已显现成为一种重要的新类型的调控RNA，其对各种各样的生物学过程具有重大影响。
[0006]这些小的(通常17-24个核苷酸长度)非编码RNA分子可通过促进RNA降解、抑制mRNA翻译以及还影响基因转录来调节蛋白质表达模式。miR在不同的过程中起到关键的作用，所述过程例如发育和分化、细胞增殖的控制、应激反应和新陈代谢。在许多类型的人类癌肿中发现许多miR的表达是变化的，在一些病例中，已提出有力的证据来支持以下推测:所述变化在肿瘤进展中可能起到成因的作用。目前有约1223个已知的人miR。
[0007]新近的数据显示，miR还与心脏病(包括HF)有关，并且甚至比mRNA对末期心力衰竭的急性功能状态更灵敏(Thum 等，2007，Circulation.116: 258 - 267; Matkovich等，2009，Circulation.119 (9): 1263-1271)。
[0008]目前对于心力衰竭的治疗包括药理学方法、装置例如心室辅助装置(VAD)、心脏再同步疗法(CRT)、可植入的电复律器-除颤器(ICD)(其为小型电池供电的和心脏移植)。药理学方法包括但不限于变力剂(即，增加心脏收缩性的化合物)、神经元介质阻滞剂(例如，β-阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂)、醛留酮拮抗剂、利尿剂和血管舒张剂。然而，这些药剂没有一种是完全单独或组合有效的。移植物的可用性受到高度限制，并且因为许多遭受心力衰竭的个体健康很差，他们经常不是良好的手术候选者。因为这些原因，心力衰竭仍是发病率和死亡率的主要原因，尤其在发达地区。此外，确定心力衰竭的准确病因可能是困难的，这是阻止开发更特异疗法的一个因素。总体上缺乏分子水平的诊断技术。因此，本领域存在发现循环的诊断标记物的需要，所述标记物更准确地反映受试者发展HF的遗传倾向。
[0009]发明简述本发明部分基于miR组的发现，所述miR的水平在慢性心脏收缩HF患者的循环中增加或降低。因此，在稳定的慢性心脏收缩HF患者的血清中，对大范围的miR组进行筛选，并将结果与年龄、性别和种族相匹配的对照组相比较。得到基于血清中所检测的miR水平的评分，其为HF患者的提示，并且与HF组中其他已知的预后临床标记物相关。
[0010]在体液中循环的核酸为HF风险的早期诊断提供独特的机会。本发明提供特异的核酸序列，用于HF的鉴定、早期检测和诊断。根据核酸序列在生物样品中的表达模式，其还可用作用于受试者的预后评估的预后标记物。本发明还提供最少入侵的早期检测HF倾向(early detection or predisposition of HF)的方法。
[0011]本发明还提供在受试者中诊断或预测心力衰竭的方法，所述方法包括:从受试者获得生物样品；测定所述样品中核酸序列的表达谱(expression profile),所述核酸序列选自SEQ ID NO:1-48、94-146、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列；和比较所述表达谱与参照表达谱，其中与所述参照表达谱相比较，在所述生物样品中至少一个或多个核酸序列的表达谱水平差异是心力衰竭的诊断或预后。
[0012]根据一些实施方案，选自SEQ ID NO:1-39、94-97、119-122、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对高的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。
[0013]根据其他实施方案，选自以下SEQ ID NO:40-48、98-118、123-146、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对低的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。
[0014]根据一些实施方案，所述方法还包括根据心脏病状况管控(managing)受试者的治疗。
[0015]根据一些实施方案，所述生物样品选自体液、细胞系和组织样品。根据一个实施方案，体液样品为血清样品。根据另一个实施方案，所述体液为血液样品。
[0016]根据一些实施方案，所述方法包括测定至少两个核酸序列的表达。根据一些实施方案，所述方法还包括组合一个或多个表达比。根据一些实施方案，通过选自核酸杂交、核酸扩增和其组合的方法测定所述表达水平。根据一些实施方案，所述核酸扩增方法为实时PCR (RT-PCR)。根据一个实施方案，所述实时PCR为定量实时PCR (qRT-PCR)。
[0017]根据一些实施方案，RT-PCR方法包括正向和反向引物。根据其他实施方案，正向引物包含选自SEQ ID NO:49-66, 86-89，147-171、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列。根据一些实施方案，实时PCR方法还包括与探针杂交。
[0018]根据一些实施方案，所述探针包含与选自SEQ ID NO:1-48、94-146中的任何一个、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。
[0019]根据其他实施方案，所述探针包含选自SEQ ID NO:67-84、90-93、172-196中的任何一个、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列。
[0020]本发明还提供用于在受试者中评估心脏病的试剂盒；所述试剂盒包含探针，所述探针含有与选自SEQ ID NO:1-48,94-146中的任何一个、其片段和与其具有至少80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。根据一些实施方案，所述探针包含选自SEQ ID NO:67-84、90-93、172-196、其片段和与其具有至少80%同一性的序列的核酸序列。根据其他实施方案，试剂盒还包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO =49-66,86-89,147-171、其片段和与其具有至少80%同一性的序列的序列。根据其他实施方案，试剂盒还包含反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO: 85、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。
[0021]本发明的这些和其他实施方案连同下文的附图、描述和权利要求书一起时将显而易见。
[0022]附图简述
图1A-1D为盒形图(boxplot presentation),其比较在获得自HF组(I)或健康受试者
(II)的血清样品中所例示的统计学显著上调的微RNA的存在分布:hsa-miR-423-5p (SEQID NO: 13) (IA)、hsa-miR-320a (SEQ ID NO:1) (IB)、hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 14)(IC)和hsa-miR-92b (SEQ ID NO: 15) (ID)。结果基于实时PCR，并且较高的标准化信号表示在样品中存在较大数量的微RNA。
[0023]盒形图显示中值(水平线)、25_75百分位数(盒)、最多1.5倍于四分位距的数据范围(“虚线”)和离群值(十字型)。
[0024]图2A-2D为盒形图，其比较获得自HF组⑴或健康受试者(II)的血清样品中例示的统计学显著下调的微RNA的表达分布(Y轴):hsa-miR-26a (SEQ ID NO: 40)(2A)、hsa-miR-199b-5p (SEQ ID NO: 42) (2B)、hsa_miR-33a (SEQ ID NO: 41) (2C)和hsa-miR-27b (SEQ ID NO: 43) (2D)。结果基于实时PCR，并且较高的标准化信号表示在样本中存在较大数量的微RNA。
[0025]盒形图显示 中值(水平线)、25_75百分位数(盒)、最多1.5倍于四分位距的数据范围(“虚线”)和离群值(十字型)。
[0026]图3为显示miR分数(Y轴)在HF组⑴和对照组(II)之间显著分离的点图。对每个样品计算miR分数作为以下序列的平均标准化反向信号:hsa-miR-423-5p (SEQ IDNO: 13)、hsa-miR-320a (SEQ ID NO:1)、hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 14)和 hsa_miR-92b(SEQ ID NO: 15)，并且通过减去常数(最小分数)进行调整使得分数的范围自0开始。
[0027]水平线表示中值，其在HF组中为2.9而在对照组中为1.3。双侧不成对t检验的P-值为 0.0000001。
[0028]图4为HF组和对照组之间的miR分数区分的接受者操作特性(ROC, ReceiverOperating Characteristic)曲线。ROC曲线描绘了对于诊断测量的不同截止值,针对假阳性比率(I减去特异性)(X轴)的灵敏度(Y轴)，并且为分类性能的量度。ROC曲线下面积(AUC)可用于评估测量的诊断性能。随机分类器具有AUC=0.5，并且具有理想灵敏度和100%特异性的最佳分类器具有AUC=I。相应的ROC曲线具有AUC=0.90。
[0029]图5为证明HF组内的miR分数(Y轴)和提高的血清脑钠素(BNP)水平(X轴)之间显著相关的图示。HF组内患者的BNP水平以对数标度显示。BNP水平与miRNA分数的Spearman 相关性为 0.63 (p=0.003)。
[0030]图6为证明miR分数(Y轴)和血清脑钠素(BNP)水平(X轴)之间显著相关的点图。在来自HF患者的对于该参数其值在上半部的样品和其值在下半部的样品之间，比较miR分数。高BNP水平与高miRNA分数相关，p值=0.002。
[0031]图7为证明miR分数(Y轴)和宽QRS (X轴)之间显著相关的点图。
[0032]图8为证明miR分数(Y轴)和左心室舒张末期容积(EDD) (X轴)之间显著相关的点图。高舒张末期容积(EDD)与高miRNA分数相关(p=0.03)。
[0033]图9 为证明 miR 分数(Y 轴)和左房内径(left atrial dimension, LAD) (X 轴)显著相关的点图。高LAD与高miRNA分数相关(p=0.01)。
[0034]发明详述
本发明部分基于以下发现:特定的生物标记物序列(SEQ ID NO: 1-48,94-146)可用于心力衰竭的鉴定、早期检测、诊断和预后。
[0035]生物标记物具有改革各种医学病况的诊断和治疗的潜能。理想的是，生物标记物以最小入侵的方式取样。因此，各种生物医学研究领域的挑战为鉴定体液(例如血清或血液)中的生物标记物。在近年来已清楚，无细胞的DNA和mRNA存在于血清以及其他体液中，并且为潜在的生物标记物。然而，监测在体液中通常小量的这些核酸需要灵敏的检测方法，所述方法不是通常在临床上可适用的。
[0036]本发明提供灵敏、特异和准确的方法，其可用于进行心力衰竭的最小入侵的早期检测、诊断和预后。本发明的方法具有高灵敏性和特异性。
[0037]令人惊讶地发现，上述方法允许简单的最小入侵测试，以在非常早期的阶段以较高可靠性和有效性容易地检测心脏病，节省时间、材料和操作步骤，以及节省成本和难以获得的精细化学品。
[0038]此外，本发明的方法组合了以下优势:容易进行样品采集和早期阶段诊断心力衰竭的选择。作为最小入侵的方法(其中例如递送血清样品)，所述方法具有在受试者中获得高接受度的良好潜能，所述受试者可例如为人或动物。因此，所述方法不但可用于常规检测，还可用于预防医学检查。
[0039]另外，本发明提供用于确定治疗计划的方法。一旦健康护理提供者知道样品和由此个体所属的疾病种类，健康护理提供者可确定用于所述个体的适当治疗计划。例如，不同的心脏病种类往往需要不同的治疗。如本文所述，与具有不同的类型或种类的心脏病的个体相比，具有特定类型或种类的心脏病的个体可从不同的治疗过程中获益。恰当诊断和理解个体的心脏病种类允许更好、更成功的治疗和诊断。
[0040]定义
在公开和描述本发明的组合物和方法之前，要理解本文所用术语只用于描述具体实施方案的目的，并无意限制。必须注意，本说明书和随附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。
[0041]对于本文数字范围的列举，明确包括每一个介于其间的具有相同精确度的数字。例如对于6-9的范围，除6和9以外还包括数字7和8，对于6.0-7.0的范围，还明确包括数字 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0。
[0042]约
本文所用的术语“约”是指+/-10%。
[0043]反义
本文所用的术语“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”用于指与“有义”链互补的核酸链。反义分子可通过任何方法产生，包括以相反方向连接目的基因到允许互补链合成的病毒启动子上的合成方法。该转录的链一旦引入到细胞中，就与细胞所产生的天然序列组合形成双链体(duplex)。然后这些双链体阻断进一步转录或翻译。以这种方式，可产生突变的表型。
[0044]连接的本文所用的“连接的”或“固定化的”是指探针和固体支持物，并且可指探针和固体支持物之间的结合在结合、洗涤、分析和去除的条件下足够地稳定。结合可以是共价或非共价的。共价键可直接在探针和固体支持物之间形成，或者可通过交联剂或通过在固体支持物或探针或两者上包含特定的反应基团形成。非共价结合可以是静电、亲水和疏水相互作用中的一种或多种。非共价结合中包括分子(例如链霉抗生物素)共价连接到支持物上以及生物素化的探针非共价结合到链霉抗生物素上。固定化还可包括共价和非共价相互作用的组合。
[0045]生物样品
本文所用的“生物样品”是指含有核酸的生物学组织或流体的样品。这样的样品包括但不限于分离自受试者的组织或流体。生物样品还可包括组织切片，例如活检样品和尸检样品、FFPE样品、为组织学目的获得的冷冻切片、血液、血浆、血清、痰(sputum)、粪便、泪液、粘液、毛发和皮肤。生物样品还包括源自动物或患者组织的外植块和原代的和/或转化的细胞培养物。
[0046]生物样品还可以是血液、血液级分、尿液、渗出液、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、胃肠分泌物、支气管分泌物、痰、细胞系、组织样品或乳腺分泌物。生物样品可通过从动物中移除细胞样品来提供，但还可通过使用先前分离的细胞(例如，通过其他人、在其他时间和/或为其他目的分离的)或通过在体内进行本文所述的方法来实现。还可使用归档组织(archival tissues),例如具有治疗或结果记载的那些组织。
[0047]分类
本文所用的“分类” 是指程序和/或算法，其中根据项目(称为性状、变量、性质、特征等)中一个或多个内在特性的定量信息并根据统计模型和/或在先标记项目的训练集，将各个项目分到各组或各类。根据一个实施方案，分类指心脏病类型的确定。
[0048]互补
本文所用的“互补”或“互补的”是指在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick (例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。完全互补或完全互补的可指在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间100%互补的碱基配对。
[0049]Ct
Ct信号表不PCR的第一个循环,其中扩增穿过突光阈值(循环阈值)。因此低Ct值表示微RNA的高丰度或表达水平。在一些实施方案中，将PCR Ct信号标准化，使得标准化的Ct保持为表达水平的倒数。在其他实施方案中，PCR Ct信号可被标准化并成倒数，使得低的标准化倒数的Ct表示低的微RNA丰度或表达水平。
[0050]检测
“检测”指检测样品中组分的存在。检测还指检测组分的不存在。检测还指定量或定性地测定组分的水平。
[0051]差异表达
“差异表达”指细胞和组织之内和之间在时序基因和/或细胞基因表达模式上定性或定量的差异。因此，差异性表达的基因可在性质上改变其表达，包括例如正常组织相对于疾病组织的活化或失活。可使基因在特定状态下相对于另一状态打开或关闭，因此允许比较两个或更多个状态。定性调节的基因可在某一状态或细胞类型中显示可通过标准技术检测的表达模式。一些基因可在一种状态或细胞类型中表达，但不能在两种状态或细胞类型中表达。或者，表达的差异可以是定量的，例如其中表达受到调节，或上调(导致转录物的量增加)，或下调(导致转录物的量降低)。表达的差异程度只需大到足以通过诸如表达阵列、定量逆转录酶PCR、RNA印迹分析(northern analysis)、实时PCR、原位杂交和RNA酶保护等标准表征技术进行量化即可。
[0052]表达谱
术语“表达谱”广泛用于包括基因组表达谱，例如微RNA的表达谱。谱可通过用于测定核酸序列水平的任何合适的方法例如微RNA、标记的微RNA、扩增的微RNA、cDNA等的定量杂交、定量PCR、用于定量的ELISA等来产生，并且可供分析两个样品间的差异基因表达。对受试者或患者肿瘤样品(例如其细胞或收集物(例如组织))进行测定。通过本领域已知的任何合宜的方法收集样品。目的核酸序列是发现具有预测性的核酸序列，包括上文提供的核酸序列，其中表达谱可包括5、10、20、25、50、100个或更多个(包括所有)所列核酸序列的表达数据。根据一些实施方案，术语“表达谱”意指在所测样品中测量核酸序列的丰度。
[0053]表达比
本文所用“表达比”是指通过检测生物样品中相应核酸的相对表达水平而确定的两种或更多种核酸的相对表达水平。
[0054]FDR
当进行多重统计检验时，例如在比较多个数据特征的两组间的信号时，由于可达到在另外情况下可视为统计显著性的水平的组间随机差，获得假阳性结果的概率越来越高。为了限制这类错误发现的比例，统计显著性定义为仅用于其中差异达到阈值以下P值(通过双侧t检验)的数据特征，其依赖于所进行的检验数目和这些检验中所获得的P值的分布。
[0055]片段
“片段”在本文中用来表示核酸或多肽的非全长部分。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。
[0056]基因
本文所用“基因”可以是天然基因(例如基因组)或合成基因，其包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子、5’和3’非翻译序列)。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA例如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA或反义RNA的核苷酸序列。基因还可以是相当于编码区(例如外显子和miRNA)的mRNA或cDNA，任选包含与之连接的5’或3’非翻译序列。基因还可以是包含全部或部分编码区和/或与之连接的5’或3’非翻译序列的体外产生的扩增核酸分子。
[0057]沟结合物/小沟结合物(MGB)
“沟结合物”和/或“小沟结合物”可互换使用，是指通常以序列特异性方式适应双链DNA的小沟的小 分子。小沟结合物可以是长的扁平分子，可呈新月形，因此紧贴地适应双螺旋的小沟中，常常置换水。小沟结合分子通常可包含几个通过具有扭转自由度的键连接的芳族环例如呋喃、苯或吡咯环。小沟结合物可以是抗生素，例如纺锤菌素、偏端霉素、berenil、喷他脒和其它芳族二脒、Hoechst 33258、SN 6999、金霉酸抗肿瘤药物例如色霉素和光神霉素、CC-1065、二氢环吡咯并吲哚(dihydrocyclopyrroloindole)三肽(DPI3)、1，2- 二氢-(3H)-吡咯并[3，2-e]吲哚_7_羧化物(carboxylate) (CDPI3)和相关化合物和类似物，包括 Nucleic Acids in Chemistry and Biology,第 2 版，Blackburn 和 Gait主编，Oxford University Press，1996和PCT公布申请号WO 03/078450中描述的那些，所述文献的内容通过引用结合到本文中。小沟结合物可以是引物、探针、杂交标签互补序列的组分或其组合。小沟结合物可提高它们与之连接的引物或探针的Tm,允许这类引物或探针在较高温度下有效地杂交。
[0058]心脏病
本文所用的心脏病涉及下列非限制性实例--心力衰竭(充血性)；心肌疾病,例如缺血性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、酒精中毒性心肌病、病毒性心肌病、心动过速介导的心肌病、应激诱发的(takotsubo)心肌病、淀粉样心肌病、心律失常性右心室发育不良或无类别的心肌疾病，例如左心室致密化不全(Left ventricularnoncompaction)或心内膜弹力纤维增生症；或者瓣膜性心脏病，例如主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣狭窄、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣反流、三尖瓣狭窄或三尖瓣反流。
[0059]心力衰竭
本文所用的术语“心力衰竭”广泛指降低心脏泵送血液或以提高的充盈压泵送血液的能力的任何病况。结果，在组织中出现充血和浮肿。最经常地是，心力衰竭由心肌的收缩性降低引起，其由冠状动脉血流量减少而产生；然而，许多其他的因素可导致心力衰竭，包括对心脏瓣膜的损伤、维生素缺乏和原发性心肌疾病。
[0060]根据一些实施方 案，所述心力衰竭指具有保持心脏收缩功能的心力衰竭(HFPSF)。
[0061]同一性
本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下所用“同一性的”或“同一性”意指在特定区域内具有特定百分比的相同残基的序列。百分比可如下计算:对两个序列进行最佳比对，比较特定区域内的两个序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以该特定区域中的位置总数，将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及比较的特定区域只包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母中，但不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可视为等同物。同一性可手工进行或通过应用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0进行。
[0062]原位检测
本文所用“原位检测”意指在原始位置处因此意指在组织样品(例如活组织检查)中检测表达或表达水平。
[0063]标记
本文所用“标记”意指通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如常用于ELISA的酶)、生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)或半抗原和可使其可检测的其它实体。可将标记在任何位置处掺入核酸和蛋白质中。
[0064]核酸
本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指至少两个核苷酸共价连接在一起。单链的描述亦限定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
[0065]核酸可为单链或双链，或可含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA (基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合及包括以下碱基的组合:尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。
[0066]核酸一般含有磷酸二酯键，但可包括可具有至少一个不同键(例如氨基磷酸酯、磷硫酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯(methylphosphoroamidite)键)和肽核酸骨架和键的核酸类似物。其它类似的核酸包括具有正性骨架、非离子骨架和非核糖骨架的核酸，包括美国专利号5，235，033和5，034，506中描述的核酸，所述专利通过引用予以结合。含有一个或多个非天然存在的或修饰的核苷酸的核酸也包括在核酸的一种定义中。修饰核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5’端和/或3’端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖或骨架修饰的核糖核苷酸。然而，应当注意，核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸也是适宜的，所述非天然存在的核碱基例如在5位修饰的尿苷或胞苷,例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；0_和N-烷基化核苷酸,例 如N6-甲基腺苷。2’-OH基团可被选自以下的基团置换:H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2, NHR、NR2或CN，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基，卤素为F、Cl、Br或I。修饰核苷酸还包括通过例如以下文献中描述的轻脯氨醇键(hydroxyprolinol linkage)与胆固醇缀合的核苷酸:Krutzfeldt 等，Nature 438:685-689 (2005)和 Soutschek 等，Nature 432:173-178(2004)，其通过引用结合到本文中。可出于多种原因对核糖-磷酸骨架进行修饰，例如提高这类分子在生理环境的稳定性和半衰期、促进跨细胞膜的扩散或作为生物芯片上的探针。骨架修饰还可提高对降解的抗性，例如在细胞的严酷胞吞环境中。骨架修饰还可降低经由例如肝中的肝细胞的核酸清除。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可制备不同核酸类似物的混合物和天然存在的核酸和类似物的混合物。
[0067]探针
本文所用“探针”意指能够通过一种或多种化学键类型、通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成而与互补序列的靶核酸结合的寡核苷酸。根据杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。可能存在任何数目的碱基对错配，所述错配将干扰本文所述靶序列和单链核酸间的杂交。然而，如果突变数如此大以致于甚至在最小严格杂交条件下都不能发生杂交，则该序列不是互补靶序列。探针可为单链的或部分单链的和部分双链的。探针的链性(strandedness)受靶序列的结构、组成和性质支配。探针可被直接标记或间接标记，例如用生物素标记，链霉抗生物素复合物可随后与之结合。
[0068]参考表达谱
本文所用短语“参考表达谱”指标准表达值，所测定的值与其比较以确定具有心脏病的受试者的检测。所述参考可基于组合测量分数。
[0069]灵敏度本文所用“灵敏度”可意指二元分类检验正确鉴定病况的良好程度的统计学度量，例如将心脏病正确归类为正确类型的频繁程度。A类的灵敏度是通过检验确定属于“A”类的病例占为“A”类的病例(如通过某一绝对标准或金标准确定的)的比例。
[0070]特异性
本文所用“特异性”可意指二元分类检验正确鉴定病况的良好程度的统计学度量，例如将心脏病正确归类为正确类型的频繁程度。A类的特异性是通过检验确定属于“非A”类的病例占为“非A”类的病例(如通过某一绝对标准或金标准确定的)的比例。
[0071]标准样品
“标准样品”是指代表无疾病状态的样品，特别是其中没有心力衰竭或任何其他相关病况的状态(即，健康状态)。举例而言，标准样品可以是生物样品，所述生物样品得自与为其提供诊断或预后的受试者年龄类似的健康受试者。标准样品可以是混合样品，其中将获自几个健康受试者(即，没有心力衰竭症状的对照受试者)的生物样品的数据平均化，由此建立混合样品。
[0072]严格杂交条件
本文所用“严格杂交条件”意指例如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如探针)与第二核酸序列(例如靶)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将不同。在确定的离子强度、PH下，可选择严格条件为低于特定序列的热解链温度(Tm)约5-10°C。Tm可为在平衡时50%与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(因为 靶序列过量存在，所以在Tm处，在平衡时50%的探针被占用)。
[0073]严格条件可为这样的条件，其中盐浓度小于约1.0 M钠离子，例如在pH 7.0-8.3下约0.01-1.0 M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如约10-50个核苷酸)，温度为至少约30°C，对于长探针(例如大于约50个核苷酸)，温度为至少约60°C。还可加入去稳定剂(例如甲酰胺)来达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2-10倍。示例性的严格杂交条件包括下列条件:50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS，在42°C下温育，或者，5x SSC、1% SDS，在65°C下温育，同时在0.2x SSC和0.1% SDS中于65°C洗漆。
[0074]基本互补的
本文所用“基本互补的”意指在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多个核苷酸的区域内，第一序列与第二序列的互补序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或所述两个序列在严格杂交条件下杂交。
[0075]基本相同的
本文所用“基本相同的”意指在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多个核苷酸或氨基酸内，第一和第二序列有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的同一性，或对于核酸，如果第一序列与第二序列的互补序列基本互补。
[0076]受试者
本文所用的术语“受试者”指哺乳动物，包括人和其他哺乳动物两者。本发明的方法优选应用于人受试者。[0077]靶核酸
本文所用“靶核酸”意指可被另一核酸结合的核酸或其变体。靶核酸可以是DNA序列。靶核酸可以是RNA。靶核酸可包含mRNA、tRNA、shRNA、siRNA或Piw1-相互作用RNA、或pr1-miRNA、pre-miRNA> miRNA 或反-miRNA (ant1-miRNA)。
[0078]靶核酸可包含靶miRNA结合部位或其变体。一个或多个探针可结合靶核酸。靶结合部位可包含5-100或10-60个核苷酸。靶结合部位可包含总共5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30-40、40-50、50-60、61、62 或 63个核苷酸。革巴位点序列可包含美国专利申请号11/384，049、11/418，870或11/429,720中公开的靶miRNA结合部位序列的至少5个核苷酸，所述专利的内容结合到本文中。
[0079]组织样品
本文所用的组织样品是采用相关医学领域普通技术人员熟知的方法获自组织活检的组织。用于从活组织检查获得样品的方法包括团块(mass)的大致分配(grossapportioning)、显微切割、基于激光的显微切割或其它本领域已知的细胞分离方法。
[0080]变体
本文所用的涉及核酸的“变体”意指(i)所参考的核苷酸序列的一部分；(ii)所参考的核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与所参考的核酸或其互补序列基本相同的核酸；或Qv)与所参考的核酸、其互补序列或与之基本相同的序列在严格条件下杂交的核酸。
[0081]野生型
本文所用术语“野生型”序列是指编码序列、非编码序列或界面序列(interfacesequence)，所述界面序列是执行该序列的天然或正常功能的序列的等位基因形式。野生型序列包括同族序列(cognate sequence)的复等位基因形式,例如野生型序列的复等位基因可编码编码序列编码的蛋白质序列的沉默变化或保守变化。
[0082]本发明采用miRNA来鉴定、分类和诊断心脏病。
[0083]微RNA加工
编码微RNA (miRNA)的基因可转录，导致miRNA前体(称为pr1-miRNA)的产生。pr1-miRNA可以是包含多个pr1-miRNA的多顺反子RNA的部分。pr1-miRNA可形成带有莖和环的发夹结构。茎可包含错配的碱基。
[0084]PriniRNA的发夹结构可被Drosha (其是一种RNase III内切核酸酶)识别。Drosha可识别pr1-miRNA中的末端环，并切割约2个螺旋转角到茎中以产生60-70个核苷酸前体，称为pre-miRNA。Drosha可切割pr1-miRNA,带有RNase III内切核酸酶特有的交错切口，产生具有5’磷酸和约2个核苷酸3’突出端的pre-miRNA茎环。延伸至Drosha切割位点以外的茎的约I个螺旋转角(约10个核苷酸)对有效加工可能是必需的。然后可通过Ran-GTP和输出受体Ex-portin-5主动地将pre_miRNA从核转运至胞质。
[0085]pre-miRNA可被Dicer (其也是一种RNase III内切核酸酶)识别。Dicer可识别pre-miRNA的双链茎。Dicer还可识别茎环基部的5’磷酸和3’突出端。Dicer可从茎环基部切下末端环2个螺旋转角，留下另外的5’磷酸和约2个核苷酸3’突出端。所得的可包含错配的siRNA样双链体包含成熟的miRNA和相似大小的称为miRNA*的片段。miRNA和miRNA*可来源于pr1-miRNA和pre-miRNA的相对臂。MiRNA*序列可存在于克隆miRNA文库，但通常频率比miRNA低。[0086]虽然最初作为具有miRNA*的双链种类存在，但miRNA最终可作为单链RNA掺入到称为RNA诱导沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白复合体中。各种蛋白质都可形成RISC，这可导致以下方面的变化性:对miRNA/miRNA*双链体的特异性、靶基因的结合部位、miRNA的活性(阻抑或活化)、miRNA/miRNA*双链体的哪条链加载入RISC中。
[0087]当miRNA:miRNA*双链体的miRNA链加载入RISC时，miRNA*可被除去并降解。加载至RISC的miRNA:miRNA*双链体的链可以是其5’端较不紧密配对的链。在miRNA:miRNA*的两端具有大致相当的5’配对的情况下，miRNA和miRNA*两者可具有基因沉默活性。
[0088]RISC可根据miRNA和mRNA之间高水平的互补性，尤其通过miRNA的核苷酸2_7来鉴定靶核酸。在动物中只报告了一例，其中miRNA及其靶之间的相互作用沿着miRNA的全长。对于mir-196和Hox B8表明如此,并且进一步表明mir_196介导Hox B8 mRNA的切割(Yekta等， 2004，Science 304-594)。另外，仅在植物中已知这种相互作用(Bartel和Bartel 2003，Plant Physiol 132-709)。
[0089]已对miRNA及其mRNA靶之间的碱基配对要求进行了许多研究以实现翻译的有效抑制(Bartel 2004, Cell 116-281的综述)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷酸可能是重要的(Doench和Sharp 2004 GenesDev 2004-504)。然而，微RNA的其它部分也可参与mRNA结合。此外,在3’处的充分碱基配对可补偿在5’处的不充分配对(Brennecke等，2005 PLoS 3-e85)。
[0090]在整个基因组上分析miRNA结合的计算研究表明了 miRNA 5’处的碱基2_7在靶结合中的特定作用，但也认识到第一个核苷酸(发现通常为“A”)的作用(Lewis等，2005Cell 120-15)。同样地，Krek 等人(2005,Nat Genet 37-495)使用核苷酸 1-7 或 2-8 来鉴定和证实靶。
[0091]mRNA中的靶位点可在5’ UTR,3' UTR或在编码区中。引人关注的是，多个miRNA可通过识别相同位点或多个位点来调节相同的mRNA靶。大多数经遗传鉴定的靶中多个miRNA结合部位的存在可表明，多个RISC的协同作用提供最有效的翻译抑制。
[0092]miRNA可通过以下两种机制中的任一种指导RISC下调基因表达:mRNA切割或翻译阻抑。如果mRNA与miRNA具有某种程度的互补性，则miRNA可指定mRNA的切割。当miRNA引导切割时，切割可介于与miRNA的残基10和11配对的核苷酸之间。或者，如果miRNA与miRNA不具有必要程度的互补性，则miRNA可阻抑翻译。翻译阻抑在动物中可能更普遍，因为动物在miRNA和结合部位之间可具有较低程度的互补性。
[0093]应当注意，任何一对miRNA和miRNA*的5’端和3’端中可存在变化性。该变化性可能由于有关切割部位的Drosha和Dicer的酶促加工的变化性所致。miRNA和miRNA*的5’端和3’端处的变化性还可能由于pr1-miRNA和pre-miRNA的莖结构的错配所致。莖链的错配可导致一群不同的发夹结构。茎结构的变化性还可导致由Drosha和Dicer切割的产物的变化性。
[0094]核酸
本文提供核酸。所述核酸包含SEQ ID NO: 1-196或其变体的序列。变体可以是所参考的核苷酸序列的互补序列。变体还可以是与所参考的核苷酸序列或其互补序列基本相同的核苷酸序列。变体还可以是在严格条件下与所参考的核苷酸序列、其互补序列或与之基本相同的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。[0095]核酸的长度可为10-250个核苷酸。核酸的长度可为至少10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个核苷酸。可使用本文所述的合成基因在细胞(体外或体内)中合成或表达核酸。核酸可作为单链分子合成，并与基本互补的核酸杂交形成双链体。可采用本领域技术人员熟知的方法，包括美国专利号6，506，559 (其通过引用予以结合)中描述的方法，核酸可以单链或双链形式导入细胞、组织或器官或者能够通过合成基因来表达。
[0096]表1:本发明的核酸序列
【权利要求】
1.一种在受试者中诊断或预测心力衰竭的方法，所述方法包括:从受试者获得生物样品；在所述样品中测定核酸序列的表达谱，所述核酸序列选自SEQ ID N0:l-48、94-146、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列；和将所述表达谱与参考表达谱进行比较，其中与所述参考表达谱相比较，所述生物样品中的至少一个或多个核酸序列的表达谱水平上的差异是心力衰竭的诊断或预后。
2.权利要求1的方法，其中选自SEQID NO:1-39、94-97、119-122、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对高的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。
3.权利要求1的方法，其中选自SEQID NO:40-48、98-118、123-146、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对低的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。
4.权利要求1的方法，其中所述生物样品选自体液、细胞系和组织样品。
5.权利要求4的方法，其中所述体液样品是血清样品。
6.权利要求4的方法，其中所述体液样品是血液样品。
7.权利要求1的方法，其中所述方法包括测定至少两个核酸序列的表达水平。
8.权利要求7的方法，其中所述方法还包括组合所述核酸序列的一个或多个表达比。
9.权利要求1的方法，其中通过选自以下的方法测定所述表达水平:核酸杂交、核酸扩增及其组合。
10.权利要求9的方法，其中所述核酸扩增方法是实时PCR。
11.权利要求10的方法，其中所述实时PCR方法包括正向和反向引物。
12.权利要求11的方法，其`中所述正向引物包含选自以下的序列:SEQID NO =49-66,86-89、147-171、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。
13.权利要求12的方法，其中所述实时PCR方法还包括探针。
14.权利要求13的方法，其中所述探针包含与选自SEQID NO: 1_48、94_146、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。
15.权利要求14的方法，其中所述探针包含选自SEQID NO:67-84、90_93、172-196、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列。
16.权利要求11的方法，其中所述反向引物包含SEQID NO: 85、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。
17.一种用于在受试者中评价心脏病的试剂盒，所述试剂盒包括探针，所述探针包含与选自SEQ ID N0:l-48、94-146、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述探针包含选自SEQID NO:67-84、90_93、172-196、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列。
19.权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒还包括正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO:49-66,86-89,147-171中的任何一个、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列。
20.权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒还包括反向引物，所述反向引物包含SEQID NO: 85、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。
21.权利要求1的方法，还包括根据心脏病状况管控受试者的治疗。
22.权利要求21的方法，其中管控受试者的治疗选自安排进一步的诊断测试、给予至少一种 治疗剂、手术和不采取进一步的行动。
【文档编号】C12Q1/68GK103764843SQ201280025062
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年5月24日
【发明者】Y.戈伦, O.阿米尔 申请人:罗塞塔金诺米克斯有限公司, 莫尔研究应用有限公司