Reic表达腺病毒载体的制作方法
【专利摘要】本发明提供高表达REIC/Dkk-3蛋白质的腺病毒载体。本发明涉及一种用于表达REIC/Dkk-3DNA的DNA构建体，其自5'末端侧起连接有：(i)CMV启动子；(ii)REIC/Dkk-3DNA：(iii)polyA附加序列；以及(iv)依序将hTERT(端粒酶逆转录酶)增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子。
【专利说明】RE IC表达腺病毒载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有启动子、增强子等的高表达REIC/Dkk-3蛋白质的腺病毒载体。
【背景技术】
[0002]一直以来，为了提高基因表达效率，开发出了 CMV启动子、CAG启动子等各种基因表达启动子(专利文献I~4)。但是，在生物【技术领域】中，即使使用这些现有技术，根据细胞种类或基因种类的不同，也经常会产生几乎不引起基因表达、或者表达蛋白质量极少之类的问题。并且，该问题在将基因表达用于诊断或治疗中的医疗发展中成为较大障碍。
[0003]另一方面，作为与细胞的永生化有关的基因，已知有REIC/Dkk-3基因，据报告，该基因的表达在癌细胞中受到抑制，还有将REIC/Dkk-3基因用于癌症治疗的报告(专利文献5)。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献I专利公报第2814433号公报
[0007]专利文献2专利公 报第2814434号公报
[0008]专利文献3美国专利第5168062号说明书
[0009]专利文献4美国专利第5385839号说明书
[0010]专利文献5国际公开第W001/038523号小册子
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供高表达REIC/Dkk-3蛋白质的腺病毒载体。
[0012]本发明人对于将REIC/Dkk-3基因用于癌的基因治疗进行了研究。发现通过将REIC/Dkk-3基因插入到表达载体中并给予至生物体内，在癌症治疗中发挥出一定的效果。本发明人考虑到，若使REIC/Dkk-3基因在生物体内更高表达，则可能进一步提高癌的治疗效果，并对使其更高表达的方法进行了深入研究。
[0013]本发明人尝试进行在利用启动子的基因表达系统中能够以更高的效率进行基因表达的新系统的开发，利用各种基因的启动子、增强子的组合进行了启动子活性的比较、研究。
[0014]结果发现，通过在腺病毒载体中插入下述构建体并将该腺病毒载体给予至生物体，可使REIC/Dkk-3基因在生物体中显著地高表达，显著发挥出优异的癌症治疗效果，从而完成了本发明；所述构建体使用CMV启动子作为启动子，在CMV(巨细胞病毒，cytomegarovirus)启动子的下游连接REIC/Dkk_3DNA,在该DNA的下游连接polyA序列，进一步在其下游连接依序将hTERT (端粒酶逆转录酶，Telomerase Reverse Transcriptase)增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子。
[0015]即，本发明如下。
[0016][I] 一种用于表达REIC/Dkk-3DNA的DNA构建体，其自5’末端侧起连接有:[0017](i) CMV 启动子；
[0018](ii)下述的 REIC/Dkk-3DNA:
[0019](a)由序列编号I所示的碱基序列构成的DNA ；
[0020](b)与由序列编号I所示碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的蛋白质的DNA ；
[0021](c)由从序列编号I所示碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列构成的多核苷酸；或
[0022](d)与由从序列编号I所示碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的多肽的多核苷酸；
[0023](iii)polyA附加序列；以及
[0024](iv)依序将 hTERT (端粒酶逆转录酶，Telomerase Reverse Transcriptase)增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子。
[0025][2]如[I]的DNA构建体，其中，polyA附加序列为来自牛生长激素基因的polyA附加序列(BGA polyA)。
[0026][3]如[I]或[2]的DNA构建体，其中，该DNA构建体含有序列编号6所示的碱基序列，该碱基序列是将(ii)REIC/Dkk-3DNA、(iii)polyA附加序列以及(iv)依序将hTERT(端粒酶逆转录酶，Telomerase Reverse Transcriptase)增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子连接而成的。
`[0027][4] 一种腺病毒载体，其含有[I]或[2]的DNA构建体。
[0028][5] 一种癌细胞死亡诱导剂,其含有[4]的腺病毒载体。
[0029][6] 一种肿瘤细胞增殖抑制剂，其含有[4]的腺病毒载体。
[0030][7] 一种癌症治疗药,其含有[4]的腺病毒载体。
[0031 ] 本发明的腺病毒载体含有用于表达REIC/Dkk-3DNA的DNA构建体，该DNA构建体自5’末端侧起连接有:(i)CMV启动子；(ii)REIC/Dkk-3DNA ;(iii)polyA附加序列；和(iv)依序将hTERT(端粒酶逆转录酶)增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子，该腺病毒载体在生物体中高表达REIC/Dkk-3DNA，与在CMV启动子或CAG启动子的下游连接REIC/Dkk-3DNA、含有不具有上述增强子的DNA构建体的腺病毒载体相比，其显示出高表达，可选择性诱导癌细胞的死亡、抑制肿瘤增殖。因而，本发明的上述腺病毒载体可适宜地用于使用REIC/Dkk-3DNA的癌基因治疗中。
[0032]本说明书包括作为本申请优先权基础的日本国专利申请2011-117321号的说明书和/或附图中记载的内容。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为示出本发明REIC/Dkk_3DNA表达用构建体的结构的图。
[0034]图2为示出本发明REIC/Dkk_3DNA表达用构建体的碱基序列的图。
[0035]图3为示出所制作的含有本发明构建体的腺病毒载体的插入片段的确认结果的图。
[0036]图4为示出所制作的含有本发明构建体的腺病毒载体的结构确认结果的图。[0037]图5为示出精制后的含有本发明构建体的腺病毒载体的结构确认结果的图。
[0038]图6为示出所制作的含有本发明构建体的腺病毒载体的RCA(增殖型腺病毒，Replication Competent Adenovirus)检测结果的图。
[0039]图7为示出使用各种载体的情况下的REIC-Dkk-3基因表达强度的图。
[0040]图8为示出使用各种载体的情况下的细胞死亡诱导程度的图。
[0041]图9为示出使用各种载体的情况下的肿瘤增殖抑制效果的图(其I)。
[0042]图10为示出在用各种载体的情况下显示出肿瘤增殖抑制效果的治疗后的肿瘤的图。
[0043]图11为示出使用各种载体的情况下的肿瘤增殖抑制效果的图(其2)。
【具体实施方式】
[0044]以下详细说明本发明。
[0045]本发明涉及含有REIC/Dkk-3DNA、可用于REIC蛋白质的表达的DNA构建体(DNAconstruct),进一步涉及含有该DNA构建体的重组腺病毒载体。本发明DNA构建体的结构见图1。
[0046]REIC/Dkk-3DNA的碱基序列示于序列编号I。此外，REIC/Dkk_3DNA编码的REIC/Dkk-3蛋白质的氨基酸序列示于序列编号2。本发明中，也将REIC/Dkk-3称为REIC。
[0047]此外，对于本发明的DNA构建体所含有的REIC/Dkk-3的DNA，在使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for BiologicalInformation(美国国立生物学信息中心的碱基局部对准检索工具))等(例如，使用默认值即初期设定参数)进行计算时，其是与在严格条件下与具有序列编号I所示碱基序列的互补喊基序列的DNA杂交的DNA、序列编号I所不的喊基序列具有至少85%以上、优选90%以上、进一步优选95%以上、特别优选97%以上的序列同一性的DNA，或者其是在对由相对于上述DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列有I个或两个以上或者几个(I~10个、优选为I~5个、进一步优选为I个或者2个)的氨基酸发生取代、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的DNA等中，对具有癌细胞的细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的蛋白质进行编码的DNA。此处，所谓“严格条件”例如为“1XSSC、0.1%SDS、37°C”程度的条件，作为更严格的条件为“0.5 X SSC、0.P/oSDS,42°C ”程度的条件，作为进一步严格的条件为“0.2XSSC、0.1%SDS、65°C”程度的条件。如此，杂交条件越严格，越可期待与探针序列具有高同源性的DNA的分离。其中，上述的SSC、SDS和温度条件的组合为示例，可通过适宜组合探针浓度、探针长度、杂交反应时间等来实现所需要的严格度。对于“严格条件”，只要为本领域技术人员，即可作为序列同一性高的DNA的杂交条件来适宜确定。进一步地，本发明的DNA构建体所含有的REIC/Dkk-3的DNA为编码序列编号2所示蛋白质的DNA。
[0048]进一步地，本发明的DNA构建体所含有的REIC/Dkk_3DNA为由该DNA碱基序列的部分碱基序列构成的核苷酸片段，其也包含编码具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的肽的核苷酸。这样的核苷酸片段可通过将全长REIC/Dkk-3DNA在适当的部位切断并测定是否具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性来容易地得到。作为这样的核苷酸片段，例如包括:由从序列编号I所示REIC/Dkk-3DNA的碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列构成的多核苷酸；以及与由从序列编号I所示REIC/Dkk-3DNA的碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸中，编码具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的多肽的多核苷酸。作为由从序列编号I所示REIC/Dkk-3DNA的碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列的多核苷酸，可以举出由第I位碱基至第117位碱基构成的多核苷酸(序列编号3)或由第I位至第234位碱基构成的多核苷酸(序列编号4)。这些多核苷酸所编码的多肽具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性，这一点在例如日本特开2009-114103号公报中示出。
[0049] REIC/Dkk_3DNA可基于序列编号I的序列信息由人细胞、人组织等得到。此外还可按照W001/038523号公报的记载来得到。
[0050]上述DNA构建体在REIC/Dkk-3DNA的上游连接CMV (巨细胞病毒)启动子，在REIC/Dkk-3DNA的下游连接polyA附加序列(多聚腺苷化序列、polyA)。polyA附加序列(多聚腺苷化序列、polyA)的来源没有限定，可以举出来自生长激素基因的polyA附加序列，例如来自牛生长激素基因的PolyA附加序列(BGA polyA)(包含在序列编号5所示的碱基序列中(13位碱基以后的序列))或来自人生长激素基因的polyA附加序列、来自SV40病毒的polyA附加序列、来自人或兔β球蛋白基因的polyA附加序列等。通过使DNA构建体含有polyA附加序列,可增大转录效率。进一步地,在该polyA附加序列的下游连接3Xenh(其是依序将hTERT(端粒酶逆转录酶)增强子、SV40增强子和CMV(巨细胞病毒)增强子连接而成的增强子)(在图2的“3Xenh”部分示出序列，图2的序列示于序列编号6)。即，上述DNA构建体为自5’末端侧起连接有⑴CMV启动子、(ii)REIC/Dkk-3DNA、(iii)polyA附加序列、以及(iv)依序将hTERT (端粒酶逆转录酶)增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子的构建体。
[0051]上述的各元件需要功能性连接。此处的功能性连接是指各元件按照可发挥出其功能、可增强所要表达的基因的表达的方式进行连接。
[0052]上述的表达用盒例如可如下得到:将REIC/Dkk_3DNA插入至市售pShuttle载体(Clonetech社,该pShuttle载体在CMV启动子的下游含有外来基因插入部位、进而在其下游含有BGA polyA序列),进一步在BGA polyA序列的下游依序连接hTERT (端粒酶逆转录酶)增强子、SV40增强子和CMV增强子，从而得到该表达用盒。
[0053]本发明的含有REIC/Dkk_3DNA的DNA构建体中除CMV启动子外的部分的结构示于图2，其序列示于序列编号6。图2中，在REIC/Dkk-3DNA与3Xenh之间含有BGA polyA序列。本发明的含有REIC/Dkk-3DNA的DNA构建体在序列编号4所示序列的上游(5’侧)具有CMV启动子。
[0054]本发明的上述DNA构建体导入至腺病毒载体中来使用。本发明也包括含有用于表达上述REIC/Dkk-3DNA的表达DNA构建体的腺病毒载体。将含有本发明的DNA构建体的载体系统称为SGE (基因超表达，Super Gene Expression)系统，例如将包含含有REIC/Dkk-3DNA和CMV启动子的DNA构建体的腺病毒载体称为Ad-SGE-CMV-REIC。上述含有DNA构建体的腺病毒载体是通过将上述DNA构建体导入至腺病毒载体制作重组腺病毒来得到的。DNA构建体向腺病毒的导入例如可通过将上述含有本发明DNA构建体的pShuttle载体中的DNA构建体导入至腺病毒来进行。[0055]作为腺病毒载体的特征，可以举出如下方面:(1)可基因导入至多种细胞中；(2)即使对于增殖停止期的细胞也能够有效地进行基因导入；(3)可通过离心进行浓缩，得到高滴度(10~llPFU/ml以上)的病毒；(4)适于向活体(in vivo)的组织细胞中直接进行基因导入。
[0056]作为基因治疗用的腺病毒，开发出了 E1/E3区域缺失的第I代腺病毒载体(Miyake, S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，93，1320，1996)，之后开发出了除缺失E1/E3区域外还缺失E2或者E4区域的第2代腺病毒载体(Lieber，A., et al.，J.Virol., 70, 8944, 1996 ；Mizuguchi, H.&Kay, M.A., Hum.Gene Ther., 10, 2013, 1999)、腺病毒基因组大致完全缺失(GUTLESS)的第3代腺病毒载体(Steinwaerder, D.S.，et al.，J.Virol.，73，9303，1999);在本发明的基因导入中没有特别限定，可以使用任一种腺病毒载体。 [0057]通过将包含本发明的含有REIC/Dkk_3DNA的DNA构建体的重组腺病毒载体给予至作为被测体的人或其它哺乳动物，可将癌症治疗用基因输送至被测体的癌细胞，在癌细胞中进行基因表达，对癌细胞选择性地诱导细胞死亡和/或抑制肿瘤细胞增殖，发挥出癌症治疗效果。本发明包括这样的含有腺病毒载体的癌症治疗用病毒制剂。对于作为治疗对象的癌没有限定，可以举出例如脑/神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门/直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤/骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤等。本发明的腺病毒载体可用于原发性癌的治疗、也可用于转移性癌的治疗。进而还包括将上述腺病毒载体给予至被测体来治疗癌的方法。
[0058]本发明的腺病毒载体可通过基因治疗领域中能够使用的方法、例如通过静脉内给药或动脉内给药等血管内给药、口服给药、腹腔内给药、气管内给药、支气管内给药、皮下给药、经皮给药等进行给药。特别是本发明的腺病毒载体对特定组织、细胞的靶向性大，可将目的基因有效地输送至特定的组织、细胞，因而即使通过血管内给药也能够有效地进行诊断、治疗。
[0059]腺病毒载体进行治疗有效量的给药即可。对于基因治疗领域的本领域技术人员来说，可容易地确定治疗有效量。进一步地，给药量可根据被测者病情的严重程度、性別、年龄、体重、习惯等来适宜变更。例如，将腺病毒载体以0.5 X IO11~2.0 X IO12病毒基因组/kg体重、优选1.0XlO11~1.0X IO12病毒基因组/kg体重、进一步优选1.0XlO11~5.0XlO11病毒基因组/kg体重的量进行给药即可。病毒基因组表示腺病毒的基因组的分子数(病毒颗粒数)，也可称为颗粒(particle)。包括制剂领域中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液，使用生理盐水、含有葡萄糖或其它辅助药的等渗液等，也可以与适当的助溶剂(例如醇、丙二醇等多元醇；非离子表面活性剂等)合用。作为油性液，使用芝麻油、大豆油等，也可合用作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苯甲醇等。
[0060]通过以下的实施例具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
[0061]实施例lpShuttle-REIC-TSC质粒的制作
[0062]制作含有人REIC/Dkk-3基因作为外来基因(插入基因)的本发明的DNA构建体。所使用的DNA构建体为在市售pShuttle质粒载体(Clontech)的Xbal-Kpnl的插入部插入编码REIC/Dkk-3蛋白质的DNA、进一步在编码该REIC/Dkk-3蛋白质的DNA下游的Kpnl-EcoRl插入部位以BGH poly A+3个增强子的形式插入3个增强子(hTERT增强子、SV40增强子和CMV增强子)(将它们称为TSC)而构建出的构建体(图1)。图2中示出了插入有编码REIC的DNA的构建体的碱基序列(不包括CMV启动子的序列)(序列编号6)。此外，序列编号7中示出了含有上述构建体所含有的BGH poly A与3个增强子的区域的碱基序列。图2的碱基序列中被(I)和(2)的框围起的部分分别表示编码REIC/Dkk-3蛋白质的DNA和3个增强子(3xenh)。将包括上述构建体的pShuttle质粒载体称为pShuttle_REIC_TSC质粒。
[0063]实施例2Ad-SGE-CMV_REIC 的制作
[0064]进一步制作含有上述构建体的重组腺病毒载体。
[0065]制作中使用Adeno-X(商标)表达系统I (TaKaRa Code.Z1513N)和质粒中量提取试剂盒(QIAGEN Code.12143)。
[0066]将包含图1所示构建体的重组腺病毒载体称为Ad-SGE-CMV-REIC。
[0067]1.Adeno-X质粒的制作
[0068]将pShuttle-REIC-TSC质粒利用限制酶ΡΙ-Sce1、1-CeuI消化，得到目的基因特异性表达盒。与Adeno-X病毒D NA连接，利用SwaI消化连接产物。利用连接产物转化电转感受态细胞DH10B，铺在添加了氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。拾取所得到的菌落，利用Adeno-X System PCR Screening Priner Set进行扩增,通过电泳确认扩增条带。具有目的基因表达盒的Adeno-X质粒DNA得到287bp的扩增条带，确认到所选择的菌落#1、2、4、5、7为目的质粒(图3)。对于所选择的菌落#4’使用在克隆位点SwaI的上游和下游构建的引物进行测序。由解析结果确认到，该重组质粒在正方向插入有目的基因，在连接操作中没有多余碱基的插入或缺失。
[0069]对于所选择的克隆#4，将其转化至大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的LB培养基中进行振荡培养。翌日利用DNA精制试剂盒由培养菌体中进行质粒DNA的精制。将一部分利用限制酶Xho1、PacI消化，利用琼脂糖凝胶电泳检测出所期待的片段尺寸的泳动条带(图4)
[0070](XhoI 消化:0.6kbp、l.4kbp、2.6kbp、8kbp、9kbp、14.5kbp
[0071]PacI 消化:2.9kbp、33.3kbp)
[0072]确认到由此扩大制备的克隆为目的重组质粒。
[0073]2.重组腺病毒的制作
[0074](i) I次病毒的制作
[0075]利用含有1/10体积FBS、最终浓度2mML_谷氨酰胺和1/100体积青霉素.链霉素溶液的DMEM培养基，在I个6cm的胶原包被培养皿中将293细胞培养至100%汇合，使用TransIT-293转染以限制酶PacI消化后的AdenoX-REIC-TSC质粒5 μ g。24小时后进行培养基交换，在第13天确认到细胞的变性后回收细胞。使细胞颗粒均匀悬浮在培养基中，反复进行3次冷冻融解，将其离心上清作为各I次病毒液。
[0076](ii) 2次病毒的制作
[0077]将293细胞在6cm的胶原包被培养皿中培养至70%~100%汇合，使该培养后的293细胞感染I次病毒液。病毒感染时使用含有1/20体积FBS、最终浓度2mML_谷氨酰胺和1/100体积青霉素.链霉素溶液的DMEM培养基。确认到293细胞的变性后，回收细胞，反复进行3次冷冻融解，将其离心上清作为2次病毒。
[0078](iii)3次病毒的制作
[0079]将293细胞在T-75胶原包被培养瓶中培养至70%~100%汇合，使该培养后的293细胞感染2次病毒。确认到293细胞的完全变性后，将细胞连同培养液回收，超声波处理后，将离心上清作为3次病毒。分注到ImL/小瓶中，利用干冰急冻后保存于_80°C。
[0080]3.精制重组腺病毒的制备方法
[0081]⑴扩大制备
[0082]将293细胞在多层细胞培养瓶中培养至汇合。使用Adeno-X (商标)_滴度快速测定试剂盒(Rapid Titer Kit)确认3次病毒的效价,在最佳条件下感染至293细胞。确认到293细胞的完全变性后，回收细胞，将冷冻融解液的离心上清作为病毒液。
[0083](ii)利用氯化铯密度梯度离心法进行的精制
[0084]在超离心管中使氯化铯溶液和上述(i)中得到的病毒液重叠(重層)，在4°C、25，OOOrpm条件下离心2小时。回收所形成的病毒带(virus band),进一步加入氯化铯溶液，在4°C、35，OOOrpm条件下进行3小时超离心分离，回收所形成的病毒带。将2次超离心回收的病毒液利用透析盒在含有10%甘油的PBS (-)中透析。将透析回收液以每0.5mL进行分注，在_80°C冷冻保存。
[0085]4.精制重组腺病毒的品质检查
[0086]⑴效价测定(TCID5tl法)
[0087]将精制病毒液利用培养基进行I X IO6倍稀释。将其利用胶原包被96孔培养板以每次3倍进行11级稀释，添加等量的293细胞悬浮液50 μ L进行培养。对照仅加入298细胞悬浮液与培养基进行培养。在第14天通过显微镜下肉眼观察判断细胞变性的终点，使用以下示出的Kaber式计算出50%细胞变性终点(TCID5tl)(表1)。由于本法中计算出的TCID5tl的值与Pfu—致性良好，因而设I TCID5tl=I pfu。
[0088]Kaber 式
[0089]TCID50=(第I列的稀释率)X (系列稀释倍数)Σ _°5
[0090]其中Σ =各稀释阶段中的(变性孔数)/(样品数)的总和
[0091]表1
【权利要求】
1.一种用于表达REIC/Dkk-3DNA的DNA构建体，其自5’末端侧起连接有: (i)CMV启动子；
(ii)下述的REIC/Dkk-3DNA: (a)由序列编号I所示的碱基序列构成的DNA； (b)与由序列编号I所示碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的蛋白质的DNA ； (c)由从序列编号I所示碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列构成的多核苷酸；或 (d)与由从序列编号I所示碱基序列中的第I位碱基开始到第117位碱基~第234位的任意碱基终止的碱基序列的互补碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有癌细胞死亡诱导活性和/或肿瘤细胞增殖抑制活性的多肽的多核苷酸； (iii)polyA附加序列；以及 (iv)依序将hTERT也即端粒酶逆转录酶增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子。
2.如权利要求1所述的DNA构建体，其中，polyA附加序列为来自牛生长激素基因的PoIyA 附加序列(BGA polyA)。
3.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中，该DNA构建体含有序列编号6所示的碱基序列，该碱基序列是将`
(ii)REIC/Dkk-3DNA、 (iii)polyA附加序列、以及 (iv)依序将hTERT也即端粒酶逆转录酶增强子、SV40增强子和CMV增强子连接而成的增强子 连接而成的。
4.一种腺病毒载体，其含有权利要求1或2所述的DNA构建体。
5.一种癌细胞死亡诱导剂，其含有权利要求4所述的腺病毒载体。
6.一种肿瘤细胞增殖抑制剂,其含有权利要求4所述的腺病毒载体。
7.—种癌症治疗药,其含有权利要求4所述的腺病毒载体。
【文档编号】C12N15/09GK103562386SQ201280025035
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月25日 优先权日:2011年5月25日
【发明者】公文裕巳, 许南浩, 阪口政清, 渡部昌实 申请人:国立大学法人冈山大学, 桃太郎源株式会社