专利名称：一种用于禽肺病毒c亚群特异性检测的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测试剂盒，特别涉及一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用，属于病毒检测领域。
背景技术：
C亚型禽肺病毒(APV/C)是在1997年于美国科罗拉多州的发病火鸡群中分离得至|J。APV属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒亚属。根据其G基因的不同将欧洲病毒株分为A、B、C、D四个亚型。C亚型G基因与A和B亚型的同源性较低，且比A和B的G基因序列要长很多。APV的M蛋白高度保守，A和B亚型M蛋白的同源性为89%，但C亚型与A和B亚型M蛋白的同源性分别为78%和77%，APV/C亚型与APV/A和APV/B亚型F蛋白的同源性为83%，因此，美国流行的APV/C亚型与欧洲流行的APV/A和APV/B亚型有着显著的不同，但APV/C亚型与人偏肺病毒(HMPV)核酸序列相似。虽然在中国没有关于APV/C亚型的报道，且美国与中国地理位置上距离远，但中国和美国养禽业进出口贸易频繁，很有可能对中国的养禽业造成危害。另外，中国的临近国韩国已有对APV/C亚型的报道，因此建立一种针对APV/C亚型的快速、灵敏的诊断方法对APV快速检测、预防具有重要意义。本研究为针对C亚群APV检测的荧光定量RT-PCR的检测试剂盒及其应用，本发明的检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性，方便快捷且同时能够区分亚群，为APV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。为达到以上目的，本发明采用的技术手段为:根据GenBank中，禽肺病毒(APV) C亚群序列设计I对针对G基因的引物和I条特异性TaqMan探针，建立了一种快速检测APV C亚群病毒载量的特异性TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并组装了试剂盒。通过对反应条件和反应体系的优化，使得使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测在I X IO3 I X IO9个拷贝.μ L—1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到IO2个拷贝.μ L—1，是常规RT-PCR方法的100倍，而且与常规RT-PCR方法相比(BAYON-AUB0YER Μ, JESTIN V, TOQUIN D, et al Comparison of F-, G-and N-basedRT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detectionand typing of turkey rhinotracheitis virus.A rch Virol,1999, 144:1091-1109 ；或 DAR A Mj TUNE Kj MUNIR S，et al, PCR-based detection of an emerging avianpneumovirus in US turkey flocks, J Vet Diagn Invest，2001，13(3):201-205 ;或GHARAIBEHIS M，ALGHARAIBEHG Rj Serological and Molecular Detection of AvianPneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan, Poultry science，2007,86 (6): 1677-1681)，使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测可对结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。试验表明，使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测与其他禽病病毒无交叉反应，且C亚群的荧光定量RT-PCR与其他亚群的RNA标准品不反应，说明本发明试剂盒具有良好的敏感性和特异性。将备检样品提取RNA后，不用反转录，直接进行荧光定量RT-PCR反应，利用所建立的荧光定量RT-PCR检测试剂盒可以在2h内快速准确地对APV C亚群进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量，而且能够将阳性样品的亚群进行准确的判断。本发明一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒C亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示: 上游引物:5’GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3’(SEQID N0.1 所示)下游引物:5’CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3’(SEQID N0.2 所示)所述的探针序列如下所示:5’FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。在本发明中，所述的试剂盒中还可包括反应混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的双蒸水。其中，反应混合液中包含有PCR扩增所需要的成分:25mmol/L MgCl2以及IOmmol/L dNTPs。所述的反应混合液可为 2XQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix,购自 Qiagen公司。进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备禽肺病毒C亚群检测试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备以禽肺病毒G基因为靶点区分禽肺病毒亚群试剂中的应用。
图1为荧光定量RT-PCR的动力学曲线；图2为荧光定量RT-PCR的标准曲线；图3为常规RT-PCR的敏感性试验；图4为使用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因以及B亚群病毒进行扩增的动力学曲线。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1本发明试剂盒中探针及引物序列的设计和合成根据GenBank中APV的C亚群的G基因序列(GenBank登录号为GC:AY590688.1)设计I对分别针对目的基因的上下游引物:上游引物GCF:5’GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3’(SEQ ID N0.1 所示)下游引物GCR:5’ CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3’ (SEQ ID N0.2 所示)及I条特异性Taqman探针:探针GC:5’FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。引物由北京六合华大基因公司合成，探针由TaKaRa公司合成。实施例2本发明试剂盒在检测禽肺病毒(APV) C亚群病毒中的应用I材料与方法1.1菌株与质粒E.coli DH5a由本实验室保存，APV的四个亚群的G基因(GenBank登录号分别为Ga:AY640317.1，Gb:AB548428.1，GC:AY590688.1，GD:AJ251085.1)由哈尔滨博仕生物合成并克隆到 pBluescript IIKS ( + )载体上，分别命名为 PBL_Ga，PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 由本实
验室保存。1.2仪器与试剂LightCycler480荧光定量PCR仪购自Roche公司，紫外分光光度计购自GE公司；质粒提取试剂盒AxyGen公司；OneStep RT-PCR试剂盒和QuantiTect^ Probe RT-PCR试剂盒购自 Qiagen 公司，T7RNA polymerase 购自 Pragma 公司。1.3探针的设计与合成按照实施例1方法制备。1.4阳性RNA标准品的制备以合成的PBL-Ga, PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 质粒为模板，利用 T7RNA polymerase 试剂盒分别生成RNA，测其浓度后，换算成拷贝数，并稀释至IOltl个拷贝.μ Λ-80 保存，用前稀释作为阳性RNA标准品。1.5荧光定量RT-PCR反应条件的优化以阳性RNA标准品为模板，在不同退火温度下进行常规RT-PCR反应，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定最佳的引物退火温度。应用矩阵法对荧光定量RT-PCR的引物和探针浓度进行优化，以得到最佳的反应体系和反应条件。1.6荧光定量RT-PCR标准曲线的建立将阳性标准品10倍梯度稀释至浓度范围为IX IO3 IX IO9个拷贝.μ L'以稀释的RNA标准品为模板，每个稀释度设3个重复，进行荧光定量-RT-PCR检测，绘制标准曲线。1.7敏感性试验将阳性RNAlO倍梯度稀释至最低浓度为每微升10个拷贝，每个梯度做3个重复，进行荧光定量RT-PCR反应，确定检测的敏感性。同时以等量的RNA为模板，进行常规RT-PCR反应，具体引物(2F/2R)和退火温度参照文献(DARA M, TUNE K, MUNIR S，et al, PCR-baseddetection of an emerging avian pneumovirus in US turkey flocks, J Vet DiagnInvest, 2001, 13(3): 201-205.)。取扩增产物5 μ L，用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，比较二者敏感性的差异。 1.8特异性试验鸡传染性支气管炎病毒(IBV)，禽流感病毒(AIV H5，AIV H7，AIV H9)，鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城疫病毒(NDV)，鸡病毒性关节炎病毒(ARV)和网状内皮增生症病毒(REV)等病毒的RNA，利用建立的荧光定量RT-PCR方法对其进行检测，同时利用建立的针对C亚群的荧光定量RT-PCR检测APV其他3个亚群的RNA标准品，同时设阴性和阳性对照。
2 结果2.1荧光定量RT-PCR反应条件的优化C亚群荧光定量RT-PCR反应体系共为20 μ L，含10 μ L2XQuantiTect ProbeRT-PCR Master Mix，6.75 μ L 水，0.25 μ L Enzyme，0.125 μ L 探针 GC (20ηΜ)，0.1875 μ L上游引物GCF (40ηΜ)，0.1875 μ L下游引物GCR (40ηΜ),阳性RNA标准品2.5 μ L。反应条件为:48°C 30min,95°C IOmin ；95°C 15sec,60°C lmin，40 个循环。2.2标准曲线的建立
通过荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，获得了检测APV C亚群的动力学曲线(见图1)和标准曲线(见图2)。标准品浓度从IX IO3 IX IO9个拷贝.μΓ1具有良好的线性关系(Error均小于0.2, Light Cycler480分析软件计算得到的Error值为用于拟合线性回归时的单个数据点的平均方差，它代表定量结果的准确性，可以接受的误差值应小于0.2)。图1x轴为循环阈值，y轴为荧光强度。图2x轴为RNA标准品拷贝数的对数值，y轴为循环阈值。2.3敏感性试验荧光定量RT-PCR能检出的模板最低浓度为IO2个拷贝.μ L_\而常规RT-PCR能检出的模板最低浓度为IO4个拷贝.μ Γ1 (见图3)，表明所建立的荧光定量RT-PCR的敏感性是常规RT-PCR的100倍。2.4特异性试验用荧光定量RT-PCR 对 IBV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，IBDV，NDV，ARV 和 REV 进行检测，检测结果均为阴性，这些病毒的扩增曲线均为水平线，未达到检出阈值，而RNA标准品(GC:AY590688.1)，有良好的扩增。用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因(GenBank登录号分别为Ga:AY640317.1、Gb:AB548428.1 和 GC:AY590688.1)和 B 亚群病毒 RNA 进行检测，结果只有 C亚群的为阳性，其他两个亚群均为阴性(见图4)。图4x轴为循环阈值，y轴为荧光强度。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110〉中国农业科学院哈尔滨待医研究所
〈120〉一种爪丁‘禽肺病毒C亚群特异性检厕的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应/I]
<130> KLPI120964
<170> PatentIn 3, 5
<210> I
<211〉 21bp <212> DNA
〈213〉人X合成序列(引物)
<400> I
gggctagtcagctttgaactc
<210> 2<211> 26bp<212> DNA
〈213〉人工合成序列(引物)
<400> 2
ctgtgtttgtcttattatcccttgg
<210〉 3<211> Slbp<212〉DM
<213>人工合成序列(探针)
<-400> 3
gc cctaagtttatgtaggatc c aagggactc
权利要求
1.一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒C亚群G基因的特异性引物对和I条特异性Taqman探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示: 上游引物:5’ GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3’ 下游引物:5’ CTGTGTTTGTCTTATTATCCCTTGG3’ 所述的探针序列如下所示:5’ FAM-GCCCTAAGTTTATGTAGGATCCAAGGGACTC-TAMRA3’。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中还包括反应混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的双蒸水。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在制备禽肺病毒C亚群检测试剂中的应用。
4.权利要求1或2所述的试剂盒在制备以禽肺病毒G基因为靶点区分禽肺病毒亚群试剂中的应 用。
全文摘要
本发明公开了一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒C亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO.3所示。使用本发明的试剂盒能够实现对禽肺病毒C亚群病毒的检测，本发明的试剂盒在1×103～1×109个拷贝·μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到102个拷贝·μL-1，是普通RT-PCR方法的100倍，且与其他禽病病毒无交叉反应。结果表明，本发明的试剂盒具有良好的敏感性和特异性，可用于禽肺病毒C亚群的定量检测。
文档编号C12Q1/68GK103103289SQ20131001442
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者高玉龙, 王笑梅, 高宏雷, 王永强, 祁小乐, 秦立廷 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所