专利名称：通过补加低聚木糖调整发酵纤维素复合酶配比的方法
通过补加低聚木糖调整发酵纤维素复合酶配比的方法技术领域
本发明属于生物酶领域，具体地说，涉及一种通过补加低聚木糖来调整发酵纤维素复合酶中β葡萄糖苷酶配比的方法。技术背景
纤维素是由葡萄糖通过β -1, 4-糖苷键连接而成的高聚多糖分子。纤维素酶具备水解木质纤维素成糖的能力，这使得其具有广泛的应用前景。纤维素酶为复合酶，由三类酶组成内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)和β葡萄糖苷酶(BG)。EG作用于不溶性纤维素的表面，破坏其晶体结构，将内部的纤维素链暴露出来使其易于水解；CBH将暴露出来的纤维素链水解为2 4个单位的寡糖；BG最终将其降解为葡萄糖单糖。纤维素酶水解纤维素能力是通过多种酶的协同作用发挥的，因此纤维素酶整体酶的效果不仅取决于各个酶的自身酶活，同时取决于协同作用中酶的种类及酶之间的比例。纤维素乙醇生产过程是通过纤维素酶的作用把纤维素原料水解为葡萄糖后再通过微生物进行乙醇发酵生产。其中， 把纤维素原料水解为葡萄糖过程在一般生产厂家称做糖化过程，此过程为整个乙醇生产过程中的关键步骤。在高效纤维素酶中，β葡萄糖苷酶在整个复合酶中的比例关系着纤维素原料糖化效率的高低。目前市面上的各种纤维素酶中β葡萄糖苷酶的比例并不是很理想， 有些纤维素酶整体酶活(FPA)很高，但是β葡萄糖苷酶比例太低；有些纤维素复合酶的β 葡萄糖苷酶酶活较高，但是FPA却很低。又因为纤维素酶是复合酶，如果用纯的β葡萄糖苷酶来调节其比例的话，成本太高不适宜于纤维素乙醇的生产。发明内容
本发明的目的是提供一种通过补加低聚木糖调整发酵纤维素复合酶配比的方法，该方法直接在纤维素酶发酵过程里改善纤维素复合酶中β葡萄糖苷酶比例，方法简单，成本低廉，在保持纤维素酶整体酶活的高水平下同时提高纤维素复合酶中β葡萄糖苷酶的比例。
本发明的技术解决方案是利用低聚木糖抑制纤维素复合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纤维素酶发酵中其刺激生物菌体分泌更多的内切酶和β葡萄糖苷酶，导致最终生成的纤维素酶整体酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纤维素复合酶中的比例得到较多提升；包括以下具体步骤(O 培养基配制微晶纤维素 30g/L，蛋白胨 10g/L, (NH4)2SO4 5 g/L，KH2PO4 2 g/L， MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培养基，于121°C灭菌20min，培养基在发酵罐中的装液量为发酵罐装液容量的60°/Γ80% ；(2)菌种培养里氏木霉孢子液ClO7CFU)按玉米浆培养基质量的5%的接种量接至 5g/L玉米浆培养基中，30度摇床培养；(3)接种与产酶发酵以培养基体积的1°/Γ10%(ν/ν)的接种量接种培养24小时的里氏木霉种子液于发酵罐中发酵，发酵过程参数控制为温度30°C，溶解氧不低于20%，通气量 O.1 O. 3vvm ；(4)过程补料在发酵培养48 96小时补加f10g/L低聚木糖；(5)收集结束发酵，收集发酵液用来制备纤维素酶。
本发明的特征效果是利用低聚木糖抑制纤维素复合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纤维素酶发酵中其刺激生物菌体分泌更多的内切酶和β葡萄糖苷酶，导致最终生成的纤维素酶整体酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纤维素复合酶中的比例得到较多提升，在发酵纤维素酶的过程中补加少量的低聚木糖，在保持纤维素酶整体酶活 (FPA)的情况下，显著提高了 β葡萄糖苷酶的产酶效果，比例改善的纤维素复合酶在糖化过程中效率得到明显提升，减少了纤维素乙醇生产等需要利用纤维素酶来进行糖化水解相关的生产过程的成本。
图1为里氏木霉Rut-30传统发酵生长与产酶曲线图。
图2为里氏木霉Rut-30在发酵48小时补加低聚木糖的发酵生长与产酶曲线图。
图3为里氏木霉Rut-30在发酵72小时补加低聚木糖的发酵生长与产酶曲线图。
图4为里氏木霉Rut-30在发酵96小时补加低聚木糖的发酵生长与产酶曲线图。
图5为里氏木霉Rut-30不同接种量在发酵72小时补加低聚木糖的发酵生长与产酶曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步详细地描述本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下为纤维素酶整体酶活FPA的定义在50°C、pH 4. 8、每分钟水解滤纸产生I Mmol葡萄糖所需的酶量定义为I个酶活单位(U);使用菌种为里氏木霉Rut-30。
实施例1 :取如下组分配制培养基微晶纤维素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培养基于50L的发酵罐121°C灭菌20min,降温至30。。，以5%的接种量接种培养好的里氏木霉的种子液2L，30°C发酵培养7天产酶发酵结束；测定FPA酶活为 2. lu/ml, β葡萄糖苷酶酶活为O. 6u/ml，生长与产酶曲线如图1所示。
实施例2 :取如下组分配制培养基微晶纤维素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培养基于50L的发酵罐121°C灭菌20min,降温至30。。，以5%的接种量接种培养好的里氏木霉的种子液2L，30°C发酵培养7天产酶发酵结束；在发酵48小时时补加lg/L的低聚木糖；测定FPA酶活为2. 2u/ml, β葡萄糖苷酶酶活为1. 9u/ml，生长与产酶曲线如图2所示。
实施例3 :取如下组分配制培养基微晶纤维素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培养基于50L的发酵罐121°C灭菌20min,降温至30。。，以5%的接种量接种培养好的里氏木霉的种子液2L，30°C发酵培养7天产酶发酵结束；在发酵72小时时补加5g/L的低聚木糖；测定FPA酶活为2. 4u/ml, β葡萄糖苷酶酶活为2. 5u/ml，生长与产酶曲线如图3所示。
实施例4 :取如下组分配制培养基微晶纤维素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培养基于50L的发酵罐121°C灭菌20min,降温至30。。，以5%的接种量接种培养好的里氏木霉的种子液2L，30°C发酵培养7天产酶发酵结束；在发酵96小时时补加10g/L的低聚木糖；测定FPA酶活为2. 3u/ml, β葡萄糖苷酶酶活为2. Ou/ml，生长与产酶曲线如图4所示。
实施例5 :取如下组分配制培养基微晶纤维素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培养基于50L的发酵罐121°C灭菌20min,降温至30°C，分别以1%、5% 和10%的接种量接种培养好的里氏木霉的种子液400mL、2L和4L，30°C发酵培养7天产酶发酵结束；在发酵72小时时补加5g/L的低聚木糖；测定FPA酶活分别为2. 1,2. 4u和2. 2/ ml, β葡萄糖苷酶酶活分别为2. Ou/ml、2. 5u/ml和2. 2u/ml，生长与产酶曲线如图5所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而 易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.通过补加低聚木糖调整发酵纤维素复合酶配比的方法，其特征是利用低聚木糖抑制纤维素复合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纤维素酶发酵中其刺激生物菌体分泌更多的内切酶和β葡萄糖苷酶，导致最终生成的纤维素酶整体酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纤维素复合酶中的比例得到较多提升；包括以下具体步骤(1)培养基配制微晶纤维素30g/L，蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L， MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培养基，于121°C灭菌20min，培养基在发酵罐中的装液量为发酵罐装液容量的60°/Γ80% ；(2)菌种培养里氏木霉孢子液ClO7CFU)按玉米浆培养基质量的5%的接种量接至5g/ L玉米浆培养基中，30度摇床培养；(3)接种与产酶发酵以培养基体积的1°/Γ5%(ν/ν)的接种量接种培养24小时的里氏木霉种子液于发酵罐中发酵，发酵过程参数控制为温度30°C，溶解氧不低于20%，通气量O.1^0. 3vvm ；(4)过程补料在发酵培养48 96小时补加f10g/L低聚木糖；(5)收集结束发酵，收集发酵液用来制备纤维素酶。
全文摘要
本发明公开了一种通过补加低聚木糖调整发酵纤维素复合酶配比的方法，利用低聚木糖抑制纤维素复合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纤维素酶发酵中其刺激生物菌体分泌更多的内切酶和β葡萄糖苷酶，导致最终生成的纤维素酶整体酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纤维素复合酶中的比例得到较多提升；采用此方法发酵生产纤维素复合酶具有高比例的β葡萄糖苷酶，由传统发酵方法生产的β/FPA=0.3提高到1，比添加纯β葡萄糖苷酶调节比例的生产成本降低了30%以上，此方法操作简单，无需增加特别设备。
文档编号C12N9/42GK103045568SQ20131001406
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者熊鹏, 宇文伟刚, 贺建龙, 徐继明 申请人:熊鹏