专利名称：斧文蛤est序列来源微卫星特异引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体是属于斧文蛤DNA分子遗传标记领域，特别是斧文蛤EST序列来源微卫星特异引物，以及利用该特异引物的斧文蛤EST序列来源微卫星特异引物的快速检测方法。
背景技术：
微卫星DNA (Microsatellite DNA)几乎存在于所有真核生物基因组中，由I一6个核苷酸组成的简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSR),是近几十年发展起来的一种新型分子标记技术。微卫星具有数量多、随机分布、多态性高、重复性强、共显性遗传及操作简单等优点，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及QTL定位等领域中。关于微卫星在水产养殖动物中的开发应用已有很多的报道。如:牛东红等报道了缢蛏的10个多态性微卫星标记；Liu等发现了泥蚶的39个多态性微卫星标记；马洪雨等报道了条斑星鲽的31个多态性微卫星标记和圆斑星鲽的40个多态性微卫星标记；李红蕾等发现了栉孔扇贝EST中的3个多态性微卫星标记；曲妮妮报道了合浦珠母贝的9个多态性微卫星标记；Liao等发现了铜鱼的9个多态性微卫星标记；ElfStr0m等开发了扇贝的16个多态性微卫星标记。这些多态性微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、系谱认证、遗传连锁图谱构建等研究中。来源于编码序列cDNA的微卫星标记，很可能与一些重要经济性状相关联，对于遗传连锁图谱构建及分子标记辅助选择育种具有重要的意义。斧文給(Meretrixlamarkii Deshayes),属软体动物门(Mollusca),瓣觸纲(Lamellibranchia)、帘給目(Veneroida)、帘給科(Veneridae)、文給属(Meretrix)贝类。斧文蛤为温水性海产双壳类，主要集中在日本和中国南海，在我国的广东、南海、广西等省份沿海均有分布。但随着海水污染加剧、堵海筑坝及海滩围垦等人为活动，导致了斧文蛤自然栖息地的大量丧失，斧文蛤的自然资源量急剧下滑，自然资源量稀缺。因此，分析不同地理野生群体的遗传多样性的变化及种群间的亲缘关系，对斧文蛤合理保护、开发和利用都有重要指导意义。然而，斧文蛤上可有效利用的微卫星标记还没有报道，严重限制了相关遗传学研究的发展。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种斧文蛤EST来源微卫星特异引物。本发明的另一个目的是利用上述斧文蛤EST来源微卫星特异引物的斧文蛤EST序列来源微卫星特异引物的快速检测方法。该方法具有准确、灵敏、高效、安全、扩增条带清晰等优点，能够直观地检测出斧文蛤不同个体的基因型，从而快速获得斧文蛤在基因编码区微卫星遗传变异的多态性图谱。为实现本发明的第一个目的，其技术方案是该特异引物如下表所列:Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ；
退火温度为45°C，核心重复序列为(ATG)S ；
Fff-390:F: GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R: AGAGATTATAGTGAACAAAGC ；
退火温度为48°C，核心重复序列为(CATT) 6 ；
Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ；
退火温度为46°C，核心重复序列为(TG) 17 ；
Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ；
退火温度为46°C，核心重复序列为(AATTG) 5 ；
Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ；
退火温度为45°C，核心重复序列为(AT) 6 ；
Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火温度为 45°C，核心重复序列为(AT) 8。为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案是包括以下步骤:
(1)斧文蛤基因组DNA的提取；
(2)根据cDNA数据库中斧文蛤的EST序列，获得含有微卫星重复的基因序列；
(3)微卫星特异引物的设计,利用生物学软件PrimerPremier5.0在核心重复序列的两侧设计特异性引物，按符合以下参数:引物长度在18_25bp之间；GC含量在40-60%之间；退火温度在45-60°C之间；PCR产物的预期长度在130-300bp之间；
(4)斧文蛤不同地理群体或同一群体不同个体的基因组DNA的PCR扩增；
(5)PCR扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得电泳数据，可根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得斧文蛤遗传变异的多态性图谱。从而获得斧文蛤遗传变异的多态性图谱。进一步设置是所述的微卫星特异引物为:
Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ；
退火温度为45°C，核心重复序列为(ATG)S ；
Fff-390:F: GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R: AGAGATTATAGTGAACAAAGC ；
退火温度为48°C，核心重复序列为(CATT) 6 ；
Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ；
退火温度为46°C，核心重复序列为(TG) 17 ；
Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ；
退火温度为46°C，核心重复序列为(AATTG) 5 ；
Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ；
退火温度为45°C，核心重复序列为(AT) 6 ；
Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火温度为 45°C，核心重复序列为(AT) 8。进一步设置是所述步骤(I)中的斧文蛤基因组DNA提取，具体操作如下:剪取斧文蛤肌肉组织100-150mg，至于500W组织提取液中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K，55°C消化3个小时；用酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1配成的混合液抽提3次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE缓冲液中；最后将浓度稀释为100ng/W，并保存在-20°C备用。进一步设置是所述的组织提取液具体成分为10mmol/L Tris-Cl,pH8.0 ；100mmol/L EDTA, pH8.0 ；100 mmol/L NaCl ；0.5% SDS。进一步设置是所述步骤(4)中的扩增反应体系为25沿，包括终浓度均为0.4Mfliol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/L dNTP、lXPCR buffer,
0.75U Tag DNA聚合酶、基因组DNA模板1.5W，最后补充灭菌水至总体积25耵。反应程序为:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒、特异性的退火温度退火30秒、72°C延伸45秒，30个循环；最后72°C延伸10分钟。本发明设计的斧文蛤6个EST来源的多态性微卫星标记(特异引物)可应用于斧文蛤遗传变异分析、种质资源保护与管理及遗传连锁图谱的构建。有益效果:本发明具有准确、灵敏、高效、安全、扩增条带清晰等优点，能够直观地检测出斧文蛤不同个体的基因型，从而快速获得斧文蛤在基因编码区微卫星遗传变异的多态性图谱，且提供的6个EST-SSR标记可应用于不同斧文蛤群体遗传变异分析和聚类、种质资源保护与管理及遗传连锁图谱构建等领域。下面结合具体实施方式
对本发明做进一步介绍。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。1、斧文蛤基因组DN A的提取
剪取斧文蛤肌肉组织100-150mg，至于500W组织提取液中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K,55°C消化3个小时；用酹、氯仿、异戍醇按体积比25:24:1配成的混合液抽提3次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE缓冲液中；最后将浓度稀释为lOOng/沿，并保存在-20°C备用。2、斧文蛤EST序列查找及微卫星引物设计。根据cDNA库中斧文蛤EST序列，利用生物学软件SSRHUNTER1.3查找微卫星核心重复序列，查找标准为:2 — 5个碱基重复单元、重复次数> 3次，从而获得含有微卫星重复的基因序列；利用生物学软件Primer Premier5.0在核心重复序列的两侧设计特异性引物，按一下参数标准:a.引物长度在18 — 25bp之间；b.GC含量在40% — 60%之间；c.退火温度在45-60°C之间；d.PCR产物的预期长度在130-300bp之间；引物详细信息见表I。3、利用上述微卫星引物对斧文蛤群体进行PCR扩增，其反应体系为25沿，包括终浓度均为0.4Mmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/L dNTP、IXPCR buffer, 0.75U Tag DNA聚合酶、基因组DNA模板1.5W，最后补充灭菌水至总体积25耵。反应程序为:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒、特异性的退火温度退火30秒、72°C延伸45秒，30个循环；最后72°C延伸10分钟，4°C保存备用。4、PCR产物的电泳检测
向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂(98.0%甲酰胺，IOmmoI/L EDTA，0.25%溴酚蓝，
0.25% 二甲苯氰)，于95°C变性5分钟，快速冷却，然后上样约3W于6%的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI，电泳液位I XTBE^gS 35_40V/cm，电泳约
1.5小时。电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为:首先用10%冰醋酸固定20分钟，之后用双蒸水冲洗胶板2次，每次3分钟；然后用染色液(1.5%0 AgNO3:1.5%。甲醛=v/v)染色30分钟，之后快速用双蒸水冲洗2次；最后用显色液(1.5%。甲醛:3% Na2CO3= v/v )显色至带型清楚后用10%冰醋酸终止显色，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，即获得斧文蛤遗传变异的多态图谱。最终，检测到6个扩增条带清晰、杂合度高的多态性微卫星位点(表I)。表1:
权利要求
1.一种斧文蛤EST序列来源微卫星特异引物，其特征在于包括有: Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ;退火温度为 45°C，核心重复序列为(ATG)S ；Fff-390:F: GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R: AGAGATTATAGTGAACAAAGC ;退火温度为 48°C，核心重复序列为(CATT) 6 ； Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ;退火温度为 46°C，核心重复序列为(TG) 17 ； Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ;退火温度为 46°C，核心重复序列为(AATTG) 5 Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ;退火温度为 45°C，核心重复序列为(AT) 6 Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火温度为 45°C，核心重复序列为(AT)S。
2.一种斧文蛤EST序列来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)斧文蛤基因组DNA的提取； (2)根据cDNA数据库中斧文蛤的EST序列，获得含有微卫星重复的基因序列； (3)微卫星特异引物的设计，符合以下参数:引物长度在18-25bp之间；GC含量在40-60%之间；退火温度在45-60°C之间；PCR产物的预期长度在130_300bp之间； (4)斧文蛤不同地理群体或同一群体不同个体的基因组DNA的PCR扩增； (5)PCR扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，获得电泳数据。
3.根据权利要求2所述的一种斧文蛤EST序列来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于:所述的微卫星特异引物为:Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ； 退火温度为45°C，核心重复序列为(ATG)S ；Fff-390:F:GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R:AGAGATTATAGTGAACAAAGC ； 退火温度为48°C，核心重复序列为(CATT) 6 ；Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ； 退火温度为46°C，核心重复序列为(TG) 17 ；Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ； 退火温度为46°C，核心重复序列为(AATTG) 5 ；Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ； 退火温度为45°C，核心重复序列为(AT) 6 ； Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火温度为 45°C，核心重复序列为(AT) 8。
4.根据权利要求2所述的一种斧文蛤EST序列来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于:所述步骤(1)中的斧文蛤基因组DNA提取，具体操作如下:剪取斧文蛤肌肉组织100-150mg，至于500W组织提取液中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K，55°C消化3个小时；用酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1配成的混合液抽提3次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE缓冲液中；最后将浓度稀释为100ng/m，并保存在-20 °C备用。
5.根据权利要求4所述的一种斧文蛤EST序列来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于:所述的组织提取液具体成分为10mmol/L Tris-Cl，pH8.0 ；IOOmmoI/L EDTA，pH8.0 ；100 mmol/L NaCl ；0.5% SDS。
6.根据权利要求2所述的一种斧文蛤EST序列来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于:所述步骤(4)中的扩增反应体系为25W，包括终浓度均为0.4Mfliol/L的上下游引物、终浓度为 1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/L dNTP、lXPCR buffer,0.75U Tag DNA聚合酶、基因组DNA模板1.5W，最后补充灭菌水至总体积25耵，反应程序为:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒、特异性的退火温度退火30秒、72°C延伸45秒，30个循环；最后72°C延伸10分钟。 ·
全文摘要
本发明涉及一种斧文蛤EST序列来源微卫星特异引物及其应用，包括(1)斧文蛤基因组DNA的提取(２)根据cDNA数据库中斧文蛤的EST序列，获得含有SSR重复的基因序列；(３)SSR标记引物设计；(４)斧文蛤不同地理居群DNA的PCR扩增及扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(5)获得斧文蛤EST序列区呈现高度遗传变异的多态图谱，对图谱分析可得到斧文蛤每个个体EST-SSR的基因型。本发明的检测方法具有快速、方便、准确等优点，能够直观的检测出斧文蛤不同个体的基因型。本发明可应用于斧文蛤群体遗传变异分析、种质资源保护与管理、系谱认证及遗传连锁图谱构建等领域。
文档编号C12N15/11GK103146813SQ201310035598
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者刘博 , 柴雪良, 张炯明, 滕爽爽, 邵艳卿, 方军, 肖国强, 闫茂仓, 庞少华 申请人:浙江省海洋水产养殖研究所