用于扩增流感病毒的非致瘤性mdck细胞系及其筛选方法

用于扩增流感病毒的非致瘤性mdck细胞系及其筛选方法
【专利摘要】本发明公开了用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK细胞系及其筛选方法，所述细胞系为MDCK-2B2，保藏编号为CCTCCC201323。本发明提供了具非致瘤性的细胞系MDCK-2B2及其亚克隆细胞系，其生长成为贴壁细胞和/或具有上皮样形态和/或能支持各种病毒的复制，能扩增出较高滴度病毒；此外本发明发现了筛选非致瘤性细胞系的方法，可以通过细胞的生长速度和细胞的形态变化来辅助致瘤性的判断，即生长相对缓慢的单孔细胞，其致瘤性会显著降低，巨型细胞的出现会使得致瘤性显著增加，在大规模筛选非致瘤性细胞系时，这样的辅助判断方法能缩短时间和节省成本。
【专利说明】用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK细胞系及其筛选方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及MDCK衍生细胞系，更具体来说，涉及一种用于扩增流感病毒的非致瘤 性MDCK细胞系及其筛选方法。

【背景技术】
[0002] 每年的流感流行无论对发达国家还是发展中国家，都会带来比较大的影响。 据统计，在流感盛行的季节，全世界每年约5-15%的人会发生上呼吸道感染，约250， 000-500,000 的人会发生死亡[WHO. Influenza Fact Sheet www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs211/en/]。接种流感疫苗是预防和控制流感的主要措施之一，能显著降低 发病率和死亡率，所以有效、快速地提供疫苗就显得尤为重要。目前，大多数流感疫苗仍然 采用鸡胚来生产WHO公布的毒株，由于在流感盛行的季节，可能存在鸡胚供应的短缺，从而 无法快速应对大规模爆发的流感。考虑到鸡胚供应的不确定性和可能存在潜在的禽流感 病毒，故在1995年，WHO建议采用更好的病毒扩增方式来代替鸡胚生产疫苗，他们首推哺乳 细胞培养体系[WHO. Cell culture as a substrate for the production of influenza vaccines: memorandum from a WHO metting. Bull. World He lath Organ. 73(4)， 431-435 (1995)]。用细胞生产疫苗来应对突然爆发的流感，可以在短时间内规模化生产，免 疫疫苗供应链的短缺，也可以解决一部人对鸡蛋过敏的问题。
[0003] 近年来，一些连续性的细胞系逐渐被用来生产流感疫苗，其中MDCK、Vero 及 PER. C6 [Alexander Doroshenko and Scott A Halperin. Trivalent MDCK Cell culture-derived influenza vaccine Optaflu-- (Novartis Vaccine). Expert Rev. Kacci/76^ 8 ￠), 679-688(2009)]细胞扩增流感病毒的滴度较高，故成为生产流感病毒的 主要细胞株。苏威制药、巴克斯特、DynPort、Crucell、诺华、葛兰素史克及Medlmmune等公 司先后进行了用这其中一种细胞来生产流感疫苗的研究。其中，以MDCK细胞的研发成果 最为丰硕，先是在2001年苏威制药采用MDCK来生产的流感病毒裂解灭活苗获得审批，后 来由于生产商的原因无法规模化上市，到了 2007年，诺华基于MDCK细胞生产的流感疫苗 Optaflu得到欧洲药品评价局的批准，成功上市。Medlmmune公司研发的三价FluMist-- 在2003年得到了 FDA的批准，但由于该药物采用冷冻制剂，不利于运输，故无法上市。后来 他们对配方进行了改变，变成冷藏运输，使得该三价疫苗于2007年1月份得到FDA的批 准[Medlmmune, Inc. http://pressroom.medimmune.eom/press-releases/2007/01/08/f da-approves-medimmune-s-refrigerated-formulation-of-flumist-r/],随后 Medlmmune 公司继续致力该疫苗的研发，于2012年2月得到FDA批准，生产首支四价的流感疫苗 [Medlmmune, Inc. http://pressroom, medimmune. com/press-releases/2012/02/29/ medimmune-announces-fda-approval-of-flumist%C2%AE-quadrivalent-influenza-vaccine-live-intranasal/] 〇
[0004] MDCK细胞被用于制造流感病毒疫苗，具有以下几个优势：首先是病毒生长的优 势，在MDCK细胞中能扩增出滴度较高的流感病毒[Gaush & Smith，1968; Govorkova ei ，1999];其次，该工艺容易快速放大；第三是可以追溯和全面鉴定该细胞；第四该细胞 可以驯化成无血清培养。当然，除此之外，可能还有一些更多的优点导致厂商喜欢用这个细 胞来生产流感疫苗。
[0005] 对于Madin Darby狗肾（MDCK)细胞的来源，多种相对独立的MDCK细胞曾被描述。 比较一致的是1958年从正常的雄性考克斯班尼犬（cocker spaniel)的肾脏建立了这些细 胞。ATCC列出了为S. Madin和N. B. Darby保藏的MDCK (CCL-34)细胞系，然而MDCK细 胞的其它许多谱系也可用。例如：1963 MDCK-USD 和 1961 MDCK-NIH [Gaush, PSEBM, 1996 122:931]。
[0006] 但在MDCK细胞的基质方面也存在着一些争论，例如：MDCK原先的细胞系都是非 致瘤性的；一些衍生自MDCK细胞的细胞系具有高致瘤性(有可能1-100个细胞就可能形成 肿瘤）；高致瘤性的细胞基质还从未被用来生产病毒疫苗及高致瘤性的细胞基质带来了显 著的监管挑战[FDA. Use of MDCK Cells for Manufacture of Inactivated Influenza Vaccines: Introduction]〇
[0007] 各大疫苗生产产家对MDCK的致瘤性也较为关注，苏威制药采用的MDCK细胞株注 射免疫缺陷的裸鼠后4到5周，会在注射部位会形成结节，注射的结节中具有犬肾细胞的特 质且不诱发第二次肿瘤的形成，故他们认为该细胞不具致瘤性，且对于生产灭活的、高度纯 化的亚单位疫苗是安全的[R. Brands，J. Visser，ei InfluvacTC: A Safe Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Cell Culture-Based Influenza Vaccine]。诺华生产的亚 单位灭活疫苗也考虑到了细胞致瘤性的问题，他们认为非整倍体的连续细胞系有可能具有 致瘤性，故他们在质检的过程中强调了残留的完整细胞的检查，工艺过程中彻底去除完整 的MDCK细胞，且使最后每剂疫苗的DNA残留控制在10ng以下，从而杜绝了疫苗的致瘤性 [Alexander Doroshenko and Scott A Halperin. Trivalent MDCK cell culture-derived influenza vaccine Optaflu-- (Novartis Vaccine). Expert Rev. Vaccines 8(6)， 679 - 688 (2009)]。Medlmmune公司则因为生产的是减毒活疫苗，所以他们对MDCK细胞的 致瘤性更为关注，他们采用有限稀释法筛选出MDCK 9B9-1E4细胞株，他们对其非致瘤性进 行了验证，用1〇7的MDCK 9B9-1E4细胞及107细胞对应的细胞裂解物和100μ g / animal 的量注射免疫缺陷的裸鼠，观察期为六个月，结果发现在观察期末，裸鼠的瘤体都发生了消 亡[Jonathan Liu, Sachin Mani et al. Cloning and assessment of tumorigenicity and oncogenicity of a Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell line for influenza vaccine production. Vaccine 28 (2010) 1285 - 1293.]。


【发明内容】

[0008] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK细 胞系。
[0009] 本发明所要解决的第二个技术问题是，提供用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK 细胞系的筛选方法。
[0010] 本发明所要解决的第三个技术问题是，提供非致瘤性MDCK细胞系在扩增流感病 毒中的应用。
[0011] 为了解决上述第一个问题，本发明提供了一种用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK 细胞系，所述细胞系为MDCK-2B2,保藏编号为CCTCC C201323。
[0012] 为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK 细胞系的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 改进的有限稀释法，对ATCC CCL-34 MDCK进行传代保存后，采用有限稀释法进行单 克隆的筛选，为了保证每个96孔板中，细胞数< 1,铺板时的细胞数设定为< 50,且在铺板 完毕后立即进行单孔的检查，确定细胞数为1的单孔，作上相应标记，对标记好的单孔细胞 适当补液； (2) 筛选非致瘤性细胞株，观察步骤（1)获得的单孔细胞，通过细胞的生长速度和细胞 的形态变化来辅助致瘤性的判断，挑选生长相对缓慢的细胞，且形态正常、无巨大细胞的单 克隆细胞株对SPF级的裸鼠进行注射，筛选出瘤体消亡的细胞株，对于非致瘤性细胞株进 行病理切片的进一步确认； (3) 建立细胞库。
[0013] 为了解决上述第三个技术问题，本发明提供了用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK 细胞系在扩增流感病毒中的应用。
[0014] 作为一个优选方案，所述流感病毒是甲型流感病毒。
[0015] 本发明细胞系分类命名为：MDCK-2B2,保藏编号为：CCTCC C201323,保藏单位为： 中国典型培养物保藏中心(保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国 典型培养物保藏中心邮编430072)，保藏日期为：2013年3月5日。
[0016] 本发明细胞系衍生自ATCC CCL-34 MDCK，可以采用本领域熟知的方法衍生自 ATCC CCL-34 MDCK细胞。例如，CCL-34 MDCK细胞可以首先在含血清的培养基中（Minimum essential medium + 10%胎牛血清（FBS)+ 2mM谷氨酰胺)传代有限次数，然后克隆各细胞 并鉴定各克隆。选出具有优良生物学和生理特征(包括但不限于倍增时间、致瘤性情况和病 毒产量）的克隆来产生原始细胞库（MCB)。
[0017] 通过有限稀释法筛选出MDCK细胞的各克隆，并将各克隆逐渐放大，当细胞扩增到 一定规模时，进行非致瘤性的测定。非致瘤性利用成年裸小鼠模型进行测定，消化好的细胞 必须精确计数、冰上放置且在消化后半小时内注射裸鼠，注射量为l〇 7cells/200y L/mice。
[0018] 定期观察注射MDCK细胞单克隆的裸鼠，在注射的部位会产生结节，用游标卡尺定 期测量结节的大小(参照正常瘤体体积计算公式：一般瘤体体积=长X宽X厚（mm 3)，由于 是长期监测，没有将瘤体剥离，故采用长X宽的值表示)。有的细胞(例：MDCK-2B2)形成的 结节在很短的时间内发生消亡；有的细胞形成的结节消亡的时间则较长；绝大多数的细胞 在观察期（6个月）结束时，结节没有消亡，反而持续增大，即诱导了瘤体的分化与转移。
[0019] 将在观察期内瘤体消亡的细胞传代几次、以相同的量再次注射成年裸鼠，结果发 现结节消亡的时间较年轻代次的细胞相比，明显延长，相当部分的细胞甚至出现在观察期 内瘤体无法消亡的情况。MDCK-2B2细胞经过四次的致瘤性验证，发现该细胞在观察期内结 节消亡，但随着代次的提高，结节消亡的时间明显延长。
[0020] 本发明对MDCK-2B2细胞系的生长密度进行了测定，发现其生长的最高密度跟 MDCK相当。
[0021] 对MDCK-2B2细胞系感染流感H1N1后HA滴度的产生情况进行了测定，发现结果与 MDCK相当。
[0022] 对MDCK-2B2细胞进行了进一步克隆，筛选出的多个克隆(例：MDCK-2B2-2G5及 MDCK-2B2-2G6等)，以下简称MDCK-2B2亚克隆，利用成年裸小鼠模型进行非致瘤性测定，结 果发现注射裸鼠形成的结节能够在较短的时间内发生消亡。
[0023] 对MDCK-2B2亚克隆进行了生长密度的测定，结果发现其生长的最高密度与 MDCK-2B2 相当。
[0024] 对MDCK-2B2亚克隆感染流感H1N1后HA滴度的产生情况进行了测定，发现结果与 MDCK-2B2 相当。
[0025] 故认为MDCK-2B2及MDCK-2B2亚克隆细胞系均满足非致瘤性、生长情况良好及适 宜病毒的复制。
[0026] MDCK-2B2及MDCK-2B2亚克隆细胞能在含血清的培养基中生长为贴壁细胞。
[0027] MDCK-2B2及MDCK-2B2亚克隆细胞的每一代和每次传代记录应足够详细，从而使 得各细胞系都有完整谱系可用。
[0028] 此外，本发明也提供筛选非致瘤性细胞株的详细方法，所述细胞具有多种具体特 征，包括但不限于：非致瘤性细胞(例如，在裸小鼠中形成小结后自动消亡）和/或生长成为 贴壁细胞和/或具有上皮样形态和/或能支持各种病毒(包括但不限于流感病毒）复制。
[0029] 本发明筛选非致瘤性细胞株的方法区别于传统的有限稀释法筛选单克隆，细胞衍 生自ATCC CCL-34 MDCK，对于ATCC CCL-34 MDCK进行传代保存后，采用有限稀释法筛进行 单克隆的筛选。为了保证每个96孔板中，细胞数< 1,铺板时的细胞数设定为< 50,且在铺 板完毕后立即进行单孔的检查，确定细胞数为1的单孔，作上相应标记。
[0030] 选择在铺板完毕后立即进行标记，可以避免单个细胞沉降后不宜观察的现象。
[0031] 对标记好的单孔细胞适当补液，一周后观察发现，细胞的生长情况存在显著差异， 有的单孔细胞发生凋亡，存活的单孔细胞在生长速度上也有较大区别。
[0032] 在对扩增出的单孔细胞注射后发现，生长相对缓慢的单孔细胞，其致瘤性会显著 降低。
[0033] 对第一次注射后在观察期内结节消亡的细胞进行统计，发现随着代次的升高，细 胞的规则形态会有部分发生改变，会出现巨型细胞，伴随着这些不规则体的出现，细胞的致 瘤性会显著增加。
[0034] 本发明的优点在于，本发明提供了具非致瘤性的细胞系MDCK-2B2及其亚克隆细 胞系，其生长成为贴壁细胞和/或具有上皮样形态和/或能支持各种病毒(包括但不限于流 感病毒）复制，能扩增出较高滴度病毒；此外本发明发现了筛选非致瘤性细胞系的方法，可 以通过细胞的生长速度和细胞的形态变化来辅助致瘤性的判断，即生长相对缓慢的单孔细 胞，其致瘤性会显著降低，巨型细胞的出现会使得致瘤性显著增加，在大规模筛选非致瘤性 细胞系时，这样的辅助判断方法能缩短时间和节省成本。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 图1概述了用于衍生MDCK-2B2的技术路线。实施例1详述了该方法。
[0036] 图2是显示MDCK-2B2细胞具有上皮样形态的照片。该照片拍摄自接种后3天。
[0037] 图3是MDCK-2B2及ATCC购买的MDCK (以下简称MDCK)在10%FBS MEM培养基中 的生长曲线。MDCK-2B2细胞具有约2天的潜伏期，然后是指数生长期，接种后第四天进入 稳定期，第四天达到约22X 105个细胞的最高密度，经历过平台期后，于第七天进入衰退期； MDCK细胞具有约1天的潜伏期，然后是指数生长期，接种后第三天进入稳定期，第六天达到 约24. 7Χ105个细胞的最高密度，经历过平台期后，于第七天进入衰退期。
[0038] 图4是MDCK及MDCK-2B2细胞在10%FBS MEM培养基中的葡萄糖消耗和乳酸产生 的图片。葡萄糖在第三天检测时消耗完全，而乳酸在第二天开始产生。
[0039] 图5是MDCK及MDCK-2B2细胞在10%FBS MEM培养基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及 氨气产生的图片。
[0040] 图6是显示MDCK-2B2细胞接种不同滴度（m. 〇. i分别为0. 01和0. 001)的H1N1病 毒后，HA滴度的检测情况。实施例2详述了该方法。
[0041] 图7是不同代次的MDCK-2B2细胞注射裸鼠后形成的结节在体内消亡的时间。实 施例3详述了该方法。
[0042] 图8是较高代次的MDCK-2B2 ( P102)细胞注射裸鼠一周后剥离的结节（12个标 本）所做的石蜡包块和切片图。
[0043] 图9是MDCK-2B2细胞建立主库和工作库后外源因子的检测情况。实施例4详述 了该方法。
[0044] 图10是显示MDCK-2B2细胞的亚克隆接种不同滴度（m. 〇. i分别为0. 01和0. 001) 的H1N1病毒后，HA滴度的检测情况。
[0045] 图11是显示MDCK-2B2细胞的亚克隆的生长情况。

【具体实施方式】
[0046] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。
[0047] 实施例1、具有非致瘤性MDCK-2B2细胞系的获得 一、MDCK单克隆细胞的获得 1、细胞的消化与记数 将ATCC CCL-34 MDCK P55在含血清的培养基中（Minimum essential medium + 10%胎 牛血清（FBS)+ 2mM谷氨酰胺)传代有限次数，MDCK P63代细胞，选取一瓶T-25细胞进行消 化与记数。
[0048] 取MDCK Ρ63 -瓶Τ-25细胞，弃培养上清，采用lmL胰酶(购自Gibco公司）洗涤 两遍，然后加入lmL胰酶，放入C02培养箱孵育，15min后镜下观察细胞变圆，加入9mL培养 基终止消化，混匀细胞悬液，取10 μ L滴于细胞计数板，进行计数。
[0049] 2、细胞密度的调整与铺板 为了保证96孔细胞板中无单孔多克隆的存在，铺板时减少细胞总数，每块96孔板的细 胞总数为50,每孔的加液量为200μ?或lOOyL，经过比较，加入lOOyL的液体量，更易观 察96孔板中的细胞，即细胞密度调整为50〇6118/10(^1^\96~5〇6118/1^。将铺好的细 胞板及时在镜下观察(这点极为重要，细胞沉降后无法观察到细胞板孔内的情况，从而无法 确定后期扩增的细胞是源自于单克隆还是多克隆)，对于单个细胞的孔做好标记，放入co2 培养箱孵育，为了减少液体的挥发，同时放入湿盒或对96孔细胞板定期补液。
[0050] 3、单克隆细胞的筛选 定期观察铺好的细胞板，一周后，细胞的生长状态存在显著差异，有的发生凋亡，存活 单克隆多数汇合率达80%以上，消化后转入24孔细胞培养板培养。剩下极少数的生长相对 缓慢的细胞在96孔细胞板上继续生长。
[0051] 二、MDCK单克隆细胞的起始生长速率、细胞形态与细胞致瘤性相关 1、起始生长速率与致瘤性呈负相关 采用"实施例1 MDCK单克隆细胞的获得"的方法，将筛选得到的多株细胞株扩增后注 射裸鼠，从裸鼠致瘤性的实验结果来看，只有极少数在96孔细胞板中生长较为缓慢的细胞 能在较短时间内消褪注射细胞所形成的结节，图3也验证了这一点，MDCK-2B2的起始生长 速率较MDCK慢。
[0052] 2、细胞的形态与致瘤性相关 对于多株细胞展开实验，从裸鼠致瘤性的实验结果来看，相同的细胞株在代次较低时 能在较短时间内消褪注射细胞所形成的结节，而传代几次后，在观察期内无法消除形成的 结节，有的结节甚至持续变大、发生转移即二次诱发肿瘤的形成。仔细观察相同的细胞株代 次较低时，形态规则，无巨型细胞形态的存在，而传代几次后则有巨型细胞的存在，这些不 规则的细胞体演变为肿瘤细胞。
[0053] 传统筛选方法中，通过有限稀释法获得单克隆细胞株后，将细胞扩大培养后，注射 裸鼠，部分裸鼠结节消褪前进行切片分析，剩余部分裸鼠继续观察，6个月内瘤体消亡的为 非致瘤性细胞株。
[0054] 本发明细胞的生长速度和细胞的形态变化来辅助致瘤性的判断，定期观察铺好的 细胞板，一周后，细胞的生长状态存在显著差异，有的发生凋亡，存活单克隆多数汇合率达 80%以上，消化后转入24孔细胞培养板培养。剩下极少数的生长相对缓慢的细胞在96孔细 胞板上继续生长。经过多次注射裸鼠的实验结果汇总发现，剩下的生长相对缓慢的细胞致 瘤性显著降低，在注射裸鼠时可以挑选生长缓慢的细胞，这无疑缩减了筛选非致瘤性细胞 株的时间与成本。筛选出的非致瘤性细胞株在传代后，随着代次的增加，致瘤性的概率会增 力口，我们筛选出的非致瘤性细胞株有的传代25代后还是保持非致瘤性，有的传代2代后就 具有非致瘤性，在传代稳定性测试过程中我们发现，传代后，巨型细胞较多的细胞株致瘤性 会显著增加，这为我们判断是否筛选到了稳定的非致瘤性细胞株节省了时间。
[0055] 实施例2、MDCK-2B2细胞的生长形态和生化指标 一、MDCK-2B2细胞具有上皮样形态 取P85 MDCK-2B2进行镜下（40X )观察，发现呈边缘规则的梭形，贴壁细胞，具上皮样 形态。
[0056] 二、MDCK-2B2具有较高的生长密度 接种相同其始密度（2. 5 X 105cel ls/5mL)的MDCK-2B2及MDCK于T-25的细胞培养 瓶中，各7瓶，间隔24小时各抽取其中一瓶进行细胞计数，连续计数7天，MDCK-2B2在7 天中的细胞总数分别为：1. 8X105cells，2. 9X105cells，ll. 6X105cells，22X 105cells， 20X 105cells，20. 8X 105cells 和 10. 5X105cells ;MDCK 在 7 天中的细胞总数分别 为：2. 3X 105cells，4. 8X 105cells，19. IX 105cells，21X 105cells，23. 5X 105cells， 24.87X 105cells和14.5X105cells。如图3所示，MDCK-2B2细胞具有约2天的潜伏期，然 后是指数生长期，接种后第四天进入稳定期，第四天达到约22X 105个细胞的最高密度，经 历过平台期后，于第七天进入衰退期；MDCK细胞具有约1天的潜伏期，然后是指数生长期， 接种后第三天进入稳定期，第六天达到约24. 7X 105个细胞的最高密度，经历过平台期后， 于第七天进入衰退期。
[0057] 从潜伏期来讲，MDCK-2B2经历2天的潜伏期后进入指数生长期，而MDCK则在经历 1天潜伏期后就进入指数生长期，这也验证了实施例1中起始生长速率与致瘤性呈负相关。
[0058] MDCK-2B2第四天达到的最高密度为22X 105,接着维持三天的平台期；MDCK第三 天进入平台期，密度为19. 1 X 105cells，维持四天的平台期，第六天达到约24. 7X 105个细 胞的最高密度。对比平台期的细胞密度，MDCK-2B2略低于MDCK。
[0059] 三、MDCK-2B2细胞生化指标 接种相同起始密度（2. OX 106cells/40mL)的MDCK-2B2及MDCK于T-225的细胞培养 瓶中，各1瓶，间隔24小时吸取lmL细胞上清于EP管中，放入Nova BioProfile 400生化 分析仪进行分析，记录葡萄糖（Glue)消耗、乳酸（Lac)产生；谷氨酰胺（Gin)消耗和谷氨酸 (Glu)及氨（NH4+)产生的情况。
[0060] 实施例3、MDCK-2B2细胞染色体的鉴定 1、 收获细胞，〇. 85% NaCl溶液冲洗细胞壁两遍； 2、 0.25% Trypsin-EDTA消化10-15分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用 吸管吹打下细胞453g (1500rpm/min，eppendorf 5810R)室温离心10分钟，去上清，约留 0.5ml; 3、 低渗：加入37°C 0.075MKC1 4-6ml，吸管吹打，37°C水浴3-5分钟 4、 预固定：加入1.5ml± (甲醇：冰醋酸=3:1)固定剂，轻混匀37°C水浴5分钟453g (1500rpm/min, eppendorf 5810R)室温离心 10 分钟。去上清约留 0· 5ml ; 5、 固定：加入固定剂8ml ±，轻混勻，37°C水浴10分钟，453g( 1500rpm/min, eppendorf 5810R)室温离心10分钟。去上清，约留0. 5ml ; 6、 重复固定：同上。453g(1500rpm/min，eppendorf 5810R)室温离心10分钟，去上清， 视管底细胞量加入适当几滴固定剂； 7、 滴片：每片1-2滴； 8、 烤片：75°C烤箱烘烤3小时； 9、 第二天行染色处理，并对染色体进行计数。
[0061] 实施例4、MDCK-2B2细胞产毒能力的检定 1、细胞计数 传代MDCK、MDCK-2B2 T-25各三瓶，三瓶的细胞密度与体积完全一致，2天后，观察细胞 基本已长满，拿出MDCK、MDCK-2B2 T-25各一瓶消化、计算细胞总数。
[0062] 2、病毒接种 将剩下的四瓶细胞分别用PBS洗涤两遍，加入无血清的MEM基础培养基（*牛血清中含 有流感病毒的非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制）+ TPCK-胰酶（*加适量的胰酶目 的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力，胰酶的工作浓度为2.5 μ g/mL)+病毒（按照 m. o. i值分别为1/100和1/1000,来计算病毒的接种量）。
[0063] 3、病毒的收毒和红细胞凝集试验 从病毒感染细胞24h小时开始收集细胞上清液进行红细胞凝集实验，向96孔血凝板孔 中加入50 μ L生理盐水，然后加入50 μ L细胞上清液，每个样品做两个复孔，混匀，倍比稀释 后，每孔加入1%红细胞悬液50 μ L，30min后观察血凝结果。每隔24h小时取样一次，即分 别在24h、48h、72h和96h取样。如图6所示，当24h取样时，HA的滴度均为0,在48h、72h 和96h，m. 〇· i值为1/100时，MDCK产生的HA滴度比MDCK-2B2产生的HA滴度略高；m. 〇· i 值为1/1000时，48h时MDCK产生的HA滴度显著高于与MDCK-2B2产生的HA滴度，72h时 两者产生的HA滴度相当，96h时MDCK产生的HA滴度略高。
[0064] 4、1%红细胞悬液的制备 将鸡血用生理盐水洗漆3次，头两次1 500r/min离心5 min,最后1次同速离心lOmin， 弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4°C待用。一般置4°C能保存7天左右，一旦溶血 应弃掉。
[0065] 实施例5、MDCK-2B2细胞非致瘤性的检定 消化MDCK-2B2细胞，计数，将细胞用不含FBS的MEM培养基悬浮，将细胞密度调整为 5X 107cells/mL，注射：T4weeks SPF级成年裸鼠，每只裸鼠从皮下肩胛骨处注射200 μ L细 胞悬浮液，即每只裸鼠的细胞注射量为l〇7cells。
[0066] 一、MDCK-2B2连续传代的非致瘤性的检定 对于扩增的MDCK克隆，按照107cells /200 μ L /mice的注射量注射裸鼠，定期测量结 节的形成与消褪情况。观察期设定为6个月，各细胞株结节的形成与消褪情况存在显著差 异。大部分细胞株在观察期内结节变大，即诱发二次肿瘤，有的甚至存在肿瘤灶的转移；少 部分细胞在2-eks时，形成的结节最大，随后结节在观察期内逐渐消褪。经过注射多株细 胞发现，在相同代次的情况下，注射MDCK-2B2后，消褪结节所需的时间最短。连续传代后， 多数细胞有较低代次的非致瘤性转变为较高代次的致瘤性，而MDCK-2B2在较高代次时仍 然在为期六个月的观察期内消褪结节，即能保持非致瘤性。如图7所示，MDCK-2B2 P77注 射裸鼠后在注射部位形成的结节，在第23天发生消褪，MDCK-2B2 P79在注射第31天结节 消褪，P89在注射第109天结节消褪致瘤性，P100在注射第153天结节消褪。
[0067] 二、MDCK-2B2较高代次的非致瘤性的检定 对MDCK-2B2连续传代至P102,按照107cells /200 μ L /mice的注射量注射3?4weeks 成年裸鼠，注射一周后将结节剥离，保存在4%的福尔马林溶液(市售37%的甲醛溶液10倍 稀释）中，送复旦大学上海医学院病理学系进行切片鉴定。
[0068] 病理切片结果显示(如图8所示)，结节内无肿瘤细胞的存在，故我们认为MDCK-2B2 P102代无致瘤性。
[0069] 实施例6、MDCK-2B2细胞主库与工作库的建立 对于MDCK-2B2建立主库和工作库。对主库进行细胞鉴别定、致瘤性检测及如图9所示 进行外源因子检测；工作库则进行细胞鉴别和外源因子的检测。
[0070] 细胞的鉴别实验包括细胞形态和染色体分析，对细胞连续传代后观察细胞形态， 细胞形态正常，无显著变化。对于MDCK-2B2不同代次的细胞进行染色体分析，发现染色体 数目与ATCC购买的MDCK细胞一致。
[0071] 外源因子的检测，包括无菌试验、细胞法检测病毒外源因子及用动物和鸡胚检测 病毒因子。
[0072] -、无菌试验(无菌试验包括细菌、真菌和支原体） 1、细菌、真菌检测 a、将MDCK-2B2细胞悬液接种硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及营养琼脂斜 面各两支（同时接种MEM培养基作为对照）;b.将接种后的培养基分成两份，一份置30°C? 35°C培养14天；另一份置20°C?25°C培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生 长，结果显示无细菌与真菌污染。
[0073] 2、支原体检查 支原体半流体培养基在使用前应煮沸10?15分钟，冷却至56°C左右，然后加入灭能新 生牛血清(培养基与血清体积比为8:2)，充分摇匀。支原体肉汤培养基无需煮沸，但使用前 亦应同样补加新生牛血清。接种供试品（MDCK-2B2细胞悬液），各接种4支，置36±1°C培 养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半 流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36± 1°C培养21天，每隔3天观察1次，结果显 示无支原体污染。
[0074] 二、细胞法检测病毒外源因子 1、细胞培养法直接观察及红细胞吸附试验 取MDCK主库细胞混合瓶细胞样品接种小方瓶6个，成片后观察两周。观察末期取细胞 上清，加入0.5%鸡红细胞悬液，置2?8°C 30分钟，镜检细胞，再置20?25°C 30分钟，血 吸附试验结果为阴性。
[0075] 2、不同细胞传代培养检查 取MDCK主库细胞细胞培养上清混合样品接种MRC-5、VER0及不同代次的MDCK细胞(每 瓶细胞接种l〇7cells MDCK-2B2)，观察末期取细胞上清，加入0. 5%鸡红细胞悬液，置2? 8°C 30分钟，镜检细胞，再置20?25°C 30分钟，镜检细胞；在培养第7天时，分别取每种接 种的单层细胞上清液各一瓶，分别接种于新鲜制备的相应的单层细胞上，继续培养7天，观 察细胞病变并进行细胞形态观察及血吸附试验。每种接种的单层细胞不得出现细胞病变， 血吸附试验应均为阴性。
[0076] 三、用动物和鸡胚检测病毒因子 1、注射乳鼠(工作库不需检测） 消化MDCK-2B2细胞，将细胞密度调整为107cells/mL，注射24h内的乳鼠，脑内注射一 窝，接种量为〇. 01 mL /只，定期观察，累计观察21天，发现全部存活；腹腔注射一窝，接种 量为0. 1 mL/只，定期观察，累计观察21天，发现全部存活。
[0077] 2、注射成鼠(工作库不需检测） 消化MDCK-2B2细胞，将细胞密度调整为2X106 cells/mL，注射:Γ4 weeks的成鼠，脑 内注射一窝，接种量为〇. 03 mL /只，定期观察，累计观察21天，发现全部存活；腹腔注射 一窝，接种量为〇. 5 mL/只，定期观察，累计观察21天，发现全部存活。
[0078] 3、注射鸡胚(尿囊腔） 孵育鸡胚至11日龄，在暗室内用照蛋器照射，观察气室，标记血管稀疏的部位，用打孔 器打孔，沿气室垂直线向尿囊腔注射密度为5X106的MDCK-2B2 0.2 mL /只，共注射10只 鸡胚，放孵蛋箱孵育，4天后，将鸡胚取出，放4°C过夜(防止取尿囊液是戳破血管)，于第二天 从各个鸡胚的注射处吸取澄清的尿囊液1〇〇 μ L。
[0079] 在96孔血凝板上每孔加入50 μ L生理盐水，对应孔加入50 μ L吸取的尿囊液，倍 比稀释后，每孔加入50 μ L红细胞悬液，结果显示：尿液血凝试验为阴性。
[0080] 4、注射鸡胚(卵黄囊） 孵育鸡胚至6日龄，在暗室内用照蛋器照射，观察气室，标记血管稀疏的部位，用打孔 器打孔，沿气室垂直线向尿囊腔相反的部位注射密度为2Χ106的MDCK-2B2 0. 5 mL/只(注 射后反抽发现有卵黄液，表明注射成功)，共注射10只鸡胚，5天后，用照蛋器照射观察，发 现鸡胚全部存活。
[0081] 实施例7、MDCK-2B2亚克隆细胞的鉴定 MDCK-2B2连续传代至P102,无致瘤性，我们参照实施例一的方法，对其铺板，以其选出 更优的细胞株。
[0082] 一、MDCK-2B2亚克隆细胞的非致瘤性的检定 对于铺板MDCK-2B2后形成的单克隆（以下简称为MDCK-2B2亚克隆）进行致瘤性检定。 致瘤性检定参照实施例5。
[0083] MDCK-2B2-2G5 P91 在注射后 43 天，结节消褪；MDCK-2B2-2G6 P92 在注射后 34 天，结节消褪；MDCK-2B2 P89在注射第109天结节消褪。相比而言，在代次相近的情况下， MDCK-2B2亚克隆消褪结节的时间明显缩短。
[0084] 二、MDCK-2B2亚克隆细胞的产毒能力的检定 参照实施例4进行MDCK-2B2亚克隆细胞的产毒能力的检定，如图10所示， MDCK-2B2-2G6的产毒能力与MDCK-2B2相近。
[0085] 三、MDCK-2B2亚克隆细胞的生长密度的监测 参照实施例2的第二部分，对细胞进行计数，如图11所示，MDCK-2B2-2G5及 MDCK-2B2-2G6的最高密度与MDCK-2B2相近。
[〇〇86] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK细胞系，其特征在于，所述细胞系为 MDCK-2B2,保藏编号为 CCTCC C201323。
2. 权利要求1所述用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK细胞系的筛选方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 改进的有限稀释法，对ATCC CCL-34 MDCK进行传代保存后，采用有限稀释法进行单 克隆的筛选，为了保证每个96孔板中，细胞数< 1,铺板时的细胞数设定为< 50,且在铺板 完毕后立即进行单孔的检查，确定细胞数为1的单孔，作上相应标记，对标记好的单孔细胞 适当补液； (2) 筛选非致瘤性细胞株，观察步骤（1)获得的单孔细胞，通过细胞的生长速度和细胞 的形态变化来辅助致瘤性的判断，挑选生长相对缓慢的细胞，且形态正常、无巨大细胞的单 克隆细胞株对SPF级的裸鼠进行注射，筛选出瘤体消亡的细胞株，对于非致瘤性细胞株进 行病理切片的进一步确认； (3) 建立细胞库。
3. 权利要求1所述用于扩增流感病毒的非致瘤性MDCK细胞系在扩增流感病毒中的应 用。
4. 根据权利要求3所述的在扩增流感病毒中的应用，其特征在于，所述流感病毒是甲 型流感病毒。
【文档编号】C12R1/91GK104059873SQ201310089164
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月20日 优先权日:2013年3月20日
【发明者】陈则, 杨梅 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司