专利名称：一种检测小鼠seps1基因的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测试剂盒的制备及使用方法。具体而言，本发明涉及以小鼠SEPSl基因的核苷酸序列为基础，设计特异性的寡聚核苷酸引物和荧光标记探针，采用实时荧光定量PCR技术组装脓毒症的检测试剂盒，本发明也涉及其检测方法。
背景技术：
Selenoprotein SI (SEPSl)是一种新发现的对内质网的应激反应和炎症控制起作用的基因。近来的研究结果显示SEPSl与炎症细胞因子的产生存在直接的联系，可能在炎症介导的胰岛素依赖型糖尿病以及一些其他的免疫异常中起主要作用。许多常见疾病的发生机制都包含了免疫系统的激活，例如糖尿病，肿瘤和心血管疾病。最近的研究显示炎症反应持续作用的结果是导致这些疾病的发生。细胞暴露于应激条件下会激活免疫，由此导致循环中促炎症因子水平升高，这与SEPSl基因下调相关。SEPSl在保护内质网功能完整性以抵御潜在的代谢应激中也起重要作用。SEPSl被分类为一个新的内质网膜蛋白，参与将错误折叠蛋白质由内质网转运到溶酶体，在溶酶体中通过蛋白酶体进行泛蛋白化和降解。SEPSl同时也参与调节细胞氧化还原平衡并保护内质网免受氧化应激的有害作用。内质网功能受损时，损伤导致的不良反应是诱使一些基因表达，将导致转录因子NF-KB的活化。活化的NF-KB进入细胞核，激活包括编码促炎性细胞因子在内的基因转录。[Kryukov GV, et al.Characterization of mammalianselenoproteomes.Science, 2003, (300): 1439-1443]人类SEPSl基因位于染色体15q26.3，包含6个外显子，编码一个有189个氨基酸的蛋白质。15号染色体的这个区域以前被认为包含影响炎性疾病的数量性状遗传位点(quantitative tra it loci QTLs),这些炎性疾病包括胰岛素依赖型糖尿病,Alzheimer’ s病和腹部疾病。这样SEPSl有可能是炎症相关疾病多样性的功能因素和位置因素。[Zamani, M., Pociot, F., Raeymaekers, P., Nerup, J.& Cassiman, J.J.Linkage of type
Idiabetes to 15q26(IDDM3)in the Danish population.Hum.Genet.1996 98,491-496 ；Field, L.L., Tobias, R.& Magnus, T.A locus on chromosome 15q26(IDDM3)producessusceptibility to insulin-dependent diabetes mellitus.Nat.Genet.19948,189-194.]。脓毒症是最古老的疾病之一，近50年来发病率及病死率逐渐升高，有报道1979年-1999年问患病率增加了 300%，目前全世界每天约有1400人死于本症。革兰阴性菌(G_)感染是引起脓毒症的重要原因之一，G_菌外膜的活性成分内毒素(endotoxin)即脂多糖(lipopOlysaccharide，LPS)与巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞膜上相应受体作用后，启动胞内信号传导系统，最终激活核转录因子-KB(nuclear factor κ B, NF-κ B)，引起多种细胞因子和炎症介质(TNF、IL-1 β、IL-6等)的表达和释放，导致血管通透性增加、体液渗出和淋巴细胞移行到炎症部位。机体的这种防御反应有利于清除病原菌，但如反应过度，则会引发“炎症级联反应"或伴有免疫功能的严重抑制，即全身炎症反应综合症或代偿性抗炎反应综合症(compensatory ant1-1nflammatory reaction syndrome, CARS),表现为胺毒症，脓毒性休克甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测小鼠SEPSl基因表达水平的的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。本发明的另一目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒对小鼠脓毒症进行快速的检测。为了实现上述目的，本发明根据GenBank提供的小鼠SEPSI基因保守序列，采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。特异引物及探针名称及序列为:上游引物序列为SEQ ID N0.1 TGGAGACCGAGAGCCTGCGA，下游引物序列为SEQ ID N0.2CGGCTTGGTCCAGCTGTCTCT，探针为:FAM_GCGGGAAGCT CTTGCAGATT-TAMRA。其中 FAM 为羧基荧光素，是标记在5’端荧光基因；TAMRA为荧光染料，是标记在3’端的荧光淬灭基团。本发明还制备了小鼠SEPSl基因的阳性对照重组质粒。制备步骤方法如下:使用TRNzol试剂抽提脓毒症小鼠肝组织的总RNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为:上游弓丨物 SEQ ID N0.1 (2 μ mol/L) I μ 1，5 X 第一链缓冲液 4 μ 1，dNTP 混合物(每种 2.5mmol/L) 4 μ 1,0.lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/μ I) 2 μ I。反应条件为:37°C水浴60分钟，950C水浴3分钟。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物检测后切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGM-T克隆载体上，随后转化到DH5 α感受态细胞中。通过序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies, Wilmington, Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备。 本发明还制备了一种检测小鼠SEPSl基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒，组分如下:特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液、阴性质控标准品。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.1TGGAGACCGAGAGCCTGCGA，下游引物序列为 SEQ ID N0.2 CGGCTTGGTCCAGCTGTCTCT，扩增子大小为 153bp。特异性探针为 SEQ ID N0.3:5’ FAM-TGCTGGCCAGCTATGGCTGG-TAMRA3’。荧光定量 PCR 反应液为 Hot-start Taq DNA 聚合酶(2.5U/ μ I)，Hot-start Taq DNA 聚合酶的IOXbuffer 和 dNTP 混合物(每种 10mmol/I,)。本发明还公开了一种检测小鼠SEPSl基因表达水平的的荧光定量PCR试剂盒的使用方法如下:荧光定量PCR体系:Hot-start Taq DNA聚合酶(2.5U/μ I) I μ 1，Hot-start Taq DNA 聚合酶的 IOXbuffer 5μ I, dNTP 混合物(每种 10mmol/L) I μ I,上游引物(10 μ mol/L)，下游引物(10 μ mol/L)，特异性探针(5 μ mol/L)各Ιμ ，样品cDNA5 μ I或标准质粒DNA 2μ I或阴性质控标准品5 μ I加离子水至50 μ I。荧光定量PCR程序:50C IOmin 预变性，接 45 个循环:95°C 40s, 60°C Imin0本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107-102COpieS/μ I，最小检出浓度为IO2Copies/ μ I。通过本发明的样品检测发现本试剂盒阴性检测准确率95%，阳性准确率为100%。连续3次重复实验，实验结果稳定，变异系数小于1.5%。
图1为脓毒症小鼠肝组织SEPSl蛋白的变化。图2为脓毒症小鼠肝组织SEPSl组织化学检测。图3为脓毒症小鼠肺组织SEPSl组织化学检测。图4是利用阳性DNA片段梯度稀释后制备的荧光定量标准曲线:Υ=-3.39Χ+42.7，R = 0.993。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。实施例1 SEPSl蛋白在脓毒症小鼠中过表达1、脓毒症小鼠动物模型的建立实验小鼠为巴比C小鼠(购自协和医科大学实验动物中心)，清洁级，体重17 20g。小鼠购进后在本单位动物实验室饲养3天，室温维持22 25°C。脓毒症小鼠 动物模型的建立:实验前12h小鼠禁食，自由饮水，腹腔内注射内毒素10mg/kg，单笼饲养。60只小鼠随机选取对10只不注射内毒素，作为对照组，其余制作脓毒症模型。正常对照组麻醉后活杀，脓毒症组小鼠腹腔注射内毒素10mg/kg后，分别于6h、12h、24h、48h留取标本,每个时间点不少于10只动物。2、Western Blot免疫印迹检测小鼠肝组织SEPSl蛋白的表达I)组织裂解及蛋白定量:肝组织剪碎后置于预冷的玻璃匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液后研磨。IOOmg组织/ml裂解液,充分裂解,冰浴30min, 12000g, 4°C离心5min,吸取上清(内含胞浆蛋白)，分装，200-300 μ I每管，立即置于_20°C保存(短期保存可4°C )。留少许样品进行蛋白质浓度测定。采用Bradford考马斯亮蓝法，通过测量595nm处的吸光度值，进行蛋白质定量。2)凝胶配制:配方见分子克隆手册，分离胶迅速注入玻璃板间隙，并覆盖一层三蒸水，置于室温。待30min后，倒出覆盖层水，滤纸吸干。灌制积层胶。立即插入梳子。3)电泳:将蛋白样品(20μ g)与等体积2XSDS凝胶上样缓冲液混匀，在100°C水浴煮沸3min以使蛋白质变性。待积层胶聚合完全后，拔掉梳子上样。电泳在Tris-甘氨酸缓冲液中进行，所用电压为:积层胶120V，分离胶140V。待溴酚兰电泳至凝胶底部终止电泳，取下凝胶。4)转膜:备6张Whatman 3M滤纸和一张硝酸纤维素膜，大小与凝胶一致。将硝酸纤维素膜漂浮于转移缓冲液上，借毛细作用使之从下向上浸湿后，把6张滤纸与凝胶一起浸没于缓冲液中室温平衡30min。安装转移装置，平放下部电极(阳极)，石墨面朝上，逐张叠放精确对齐3张浸泡过缓冲液的滤纸，用玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡。然后将硝酸纤维素膜精确放在滤纸上，确保滤纸与膜之间没有气泡。再将凝胶精确放在膜上。凝胶左下角置于膜的标记角上，戴手套排出所有气泡。把另3张浸泡过缓冲液的滤纸放在凝胶上，同样确保各层对齐且不留气泡。放置上部电极(阴极)，石墨面朝下。连接电源，阳极(红色)导线连接底部石墨电极。根据凝胶面积按照0.65mA/cm2接通电流，电转移2h，完毕后用丽春红S染液证实已将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5)纤维素膜的封闭与杂交:封闭硝酸纤维膜的免疫球蛋白结合位点。封闭液为IXTBST配制的10%的脱脂奶粉溶液，把硝酸纤维素膜放入可以加热封接的塑料袋中，根据滤膜面积按0.1ml/cm2加入封闭液，尽可能排出里面的气泡，然后封闭袋口，平放在37°C摇床lh。取出后，加入一抗1: 300，4°C过夜。剪开塑料袋，倾去一抗，PBS漂洗滤膜3次，每次lOmin。加入二抗，工作液浓度1: 1000，尽可能排出里面的气泡，然后封闭袋口，平放在37°C摇床lh。剪开塑料袋，倾去封闭液和二抗，PBS漂洗滤膜3次，每次lOmin。发光试剂显色，X光片于其上曝光Imin,冲洗,扫描成像。3、免疫组织化学法检测肝脏和肺脏中SEPSl蛋白表达免疫组化染色步骤:1)石蜡切片脱蜡至水。2)3% H2O2室温孵育5 10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4)5 10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。5)倾去血清,勿洗,滴加一抗(Ant1-SEPSl, Sigma公司)，4°C过夜。6) PBS 冲洗，5 分钟 X 3 次。7)生物素标记二抗(I % BSA-PBS稀释)，37°C孵育10 30分钟；8) PBS 冲洗，5 分钟 X 3 次。9)滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37°C或室温孵育10 30分钟。10) PBS 冲洗，5 分钟 X 3 次。11)显色剂显色(DAB或AEC)。12)自来水充分冲洗，复染，封片。4、Western Blot检测脓毒症小鼠肝组织SEPSl蛋白表达规律actin为内参照。正常对照动物肝组织中有少量SEPSl蛋白表达。内毒素攻击导致的脓毒症小鼠肝脏SEPSl蛋白表达显著升高，并于伤后第24h达峰值。(图1)。5、肝脏中SEPSl蛋白的表达情况石蜡切片免疫组化研究结果显示棕黄色为SEPSl蛋白表达阳性部位。正常对照动物肝组织中有少量SEPSl蛋白表达(Oh)。内毒素攻击致脓毒症小鼠肝脏SEPSl蛋白表达逐渐增高，并于伤后第24h 48h达峰值(24h)，表现为棕黄色阳性部位增多(图2)。6、肺脏中SEPSl蛋白的表达情况石蜡切片免疫组化研究结果显示棕黄色为SEPSl蛋白表达阳性部位。正常对照动物肺组织中仅有极少量SEPSl蛋白表达(Oh)。内毒素攻击致脓毒症小鼠肺脏SEPSl蛋白表达逐渐增高，并于伤后第24h 48h达峰值，表现为棕黄色阳性部位增多(图3)。通过上述研究结果显示，当小鼠患有脓毒症时，小鼠肝组织和肺组织的SEPSl蛋白表达量较正常小鼠肝组织和肺组织的SEPSl蛋白表达量显著升高。由于SEPSl蛋白的表达量是由SEPSl基因的表达水平控制的，因此我们可以通过检测SEPSl基因的表达量作为诊断脓毒症的一个指标。实施例2 —种检测小鼠SEPSl基因的荧光定量PCR试剂盒的制备1、小鼠SEPSl基因的荧光定量PCR试剂盒组成
权利要求
1.一种SEPSl基因的特异性引物对及特异性探针，其特征在于，所述的特异性引物对其核苷酸序列为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3。
2.一种检测小鼠SEPSl基因的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求I所述的特异性引物对和特异性探针，还包括标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。
3.根据权利要求1所述的一种检测小鼠SEPSl基因的荧光定量PCR试剂盒，还包括:标准DNA模板、阴性质控标准品、Hot-start Taq DNA聚合酶，其浓度为2.5U/ μ 1，Hot-startTaq DNA聚合酶的lOXbuffer，dNTP混合物，每种NTP浓度为10mmol/L。
4.一种小鼠SEPSl基因的检测方法，包括样品RNA的提取、样品cDNA的制备、SEPSl基因的扩增。
5.根据权利要求4中所述的检测方法，其中样品RNA的提取、样品cDNA的制备、SEPSl基因的扩增的具体步骤包括: 1)样品RNA的提取:按Trizol试剂盒说明书提取小鼠肝脏和肺脏的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
2)样品cDNA的制备:a)利用PCR管在冰上配制如下体 系:模板 RNA 1-5 μ gOligo(dT)18primerlμ I(0.5 μ g/μ I) 加DEPC水至12 μ I 轻轻混合，并短离心5s ； b)70°C温育5min,冰上冷却30s,之后短离心； c)PCR管置于冰上，再向其中加入:5Xreaction buffer4 μ IRNase inhibitorI μ I (20U/μ I)dNTPMix2 μ I(10mmol/l)M-MuLV Reverse Transcriptasel μ I (20U/μ I) 加DEPC水至20 μ 1，轻轻混合，之后短离心；d)37°C温育 60min ； e)70°C温育10min，4°C以结束反应。反转录得到的cDNA置于-20°C保存。。
3)SEPSl基因的扩增: 以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增SEPSl基因。其中模板2 μ I,Hot-startTaq DNA 聚合酶(2.5U/μ I) I μ I, Hot-start Taq DNA 聚合酶的 10Xbuffer5 μ 1，dNTP 混合物I μ 1，特异性引物SEQ ID N0.1，特异性引物SEQ ID N0.2，特异性探针SEQ ID N0.3各1μ 1，去离子水补齐至50 μ I。荧光定量PCR程序为:95°C IOmin预变性，接45个循环:950C 40s, 600C Imin。
6.权利要求1的引物和探针在制备检测小鼠SEPSl基因试剂盒中的应用。
7.小鼠SEPSl基因或SEPSl蛋白在制备检测小鼠脓毒症的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液、阴性质控标准品。本发明还公开了一种检测小鼠SEPS1基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测SEPS1基因的表达量，从而检测脓毒症的发生情况。
文档编号C12N15/11GK103146833SQ20131009359
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者何蕾, 贾宁 申请人:何蕾