敲除cit2基因的改造酿酒酵母c5d-p及其功能的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种木糖利用率高的基因工程菌株。本发明发现酿酒酵母C5D-P中CIT2基因与木糖运输的负调控相关，通过敲除C5D-P中CIT2基因，得到的改造菌可提高木糖利用。经实验证实，该改造菌还具有生长速率高，不影响出发菌原有的葡萄糖利用率，乙醇产量比出发菌株有显著提高等优点。
【专利说明】敲除CIT2基因的改造酿酒酵母C5D-P及其功能
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种木糖利用率高的基因工程菌株，具体涉及敲除酿酒酵母C5D-P中 CIT2基因得到的基因工程菌株。
【背景技术】：
[0002] cro-p是转入了 Piromyces sp. njaul菌株XI基因的工程酿酒酵母菌株，将自然 界中木糖转化的代谢途径引入酿酒酵母并得到活性表达（中国专利申请201110376729. 5)。 cro-ρ能够同时发酵葡萄糖和木糖。而大多数工业酿酒酵母菌株不能代谢木糖，原因是其自 身缺乏木糖到木酮糖的代谢途径。
[0003] 但酿酒酵母重组菌株C5D-P的木糖利用率尚不能达到工业化生产要求。研究表明 木糖的跨膜运输是工程菌利用木糖的主要障碍之一（Wang Y.，2004)，这是由于酿酒酵母缺 少专一的木糖转运蛋白，而葡萄糖转运蛋白对于木糖的结合能力很低。
[0004] 因此，开展针对木糖的跨膜运输相关蛋白其调控木糖利用机制的研究，改造酿酒 酵母C5D-P，提高其木糖运输能力具有十分重要的理论及应用意义。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于通过改造酿酒酵母C5D-P，提高其木糖运输能力，得到一种新的 能够高效共发酵葡萄糖和木糖的基因工程菌株。
[0006] 本发明概括地说进行了如下工作：
[0007] 1、经研究发现C5D-P中CIT2基因很有可能和木糖运输的负调控相关
[0008] 发明人对转入了 Piromyces sp.njaul菌株XI基因的工程酵母菌株C5D-P，以葡萄 糖和木糖（2:1，w/w)为混合碳源进行培养，在色谱监测葡萄糖消耗完毕木糖开始利用的情 况下，以受体菌为对照进行基因表达谱分析，结果检索得到29个有明显差异表达的蛋白， 其中跨膜运输相关蛋白CIT2表达明显下调。这说明CIT2基因很有可能和木糖运输的负调 控相关。
[0009] 关天CIT2基因属于DUP240家族，但研究较少。在C5D-P利用木糖基础上，通过敲 除CIT2基因的方法可鉴定其对酿酒酵母利用木糖机理的功能。
[0010] 2、通过敲除酿酒酵母C5D-P中CIT2基因，证实了上述发现，得到提高木糖利用的 基因工程菌株C5D-P-CIT2 Λ
[0011] 具体如下：
[0012] 1)以质粒pUG6为模板，用所设计的60bp引物克隆两端包含loxp位点的Karf基 因，其大小为1808bp，胶回收PCR敲除组件片段，连接T载体，测序；
[0013] 2)用CIT2基因的敲除组件化转酿酒酵母C5D-P，筛选转进G418抗性片段的菌株；
[0014] 3)化转pSH65到以上所得的G418抗性菌株中，用YPG液体培养基诱导表达pSH65 质粒上Cre基因表达将酿酒酵母基因组上Karf基因切除，最终得到敲除CIT2基因的工程 菌 C5D-P-CIT2 Λ。
[0015] CIT2 序列如 SEQ ID NO: 1 所示；
[0016] 敲除CIT2基因的CIT2A序列如SEQ ID N0:2所示。
[0017] 通过比较改造菌株（CM)-P-CIT2A )与出发菌株（(Μ)-Ρ)以下四方面，证明了本发 明的有益作用：
[0018] 1、COT-P-CIT2 Λ 与 C5D-P 木糖利用比较
[0019] 结果：48h重组菌株C5D-P-CIT2A木糖利用率达到37. 76%% ;而出发菌株C5D-P木 糖利用率仅达到19. 19%。
[0020] 结论：酿酒酵母中CIT2基因是影响其利用木糖的因素之一，CIT2基因的敲除有利 于其木糖利用率的提商。
[0021] 2、COT-P-CIT2 Λ 与 C5D-P 生长速率比较
[0022] 结果：培养48h后改造菌⑶D-P-CIT2 Λ 〇D6QQ值比⑶D-P提高了 9. 33%
[0023] 结论：进一步证明改造菌C5D-P-CIT2A在葡萄糖利用完毕后可以更好的利用木 糖作为碳源？
[0024] 3、COT-P-CIT2 Λ与C5D-P葡萄糖利用比较
[0025] 结果：Cro-P_CIT2 Λ和C5D-P同样完全利用完葡萄糖；
[0026] 结论：改造菌株不干扰对葡萄糖的利用
[0027] 4、COT-P-CIT2 Λ与⑶D-P乙醇产量比较
[0028] 结果：改造菌C5D-P-CIT2A比出发菌C5D-P有显著提高，48h乙醇产量提高了 8. 91% ；
[0029] 结论：进一步证明改造菌C5D-P-CIT2A在葡萄糖利用完毕后可以更好的利用木 糖作为碳源。
【专利附图】
【附图说明】：
[0030] 图1是C5D-P-CIT2 Λ与C5D-P生长速率比较；横坐标为培养时间，纵坐标为菌体 密度〇d6(?值；
[0031] 图2是C5D-P-CIT2 Λ与C5D-P葡萄糖利用比较；横坐标为培养时间，纵坐标为葡 萄糖浓度；
[0032] 图3是C5D-P-CIT2 Λ与C5D-P木糖利用比较；横坐标为培养时间，纵坐标为木糖 浓度；
[0033] 图4是C5D-P-CIT2 Λ与C5D-P乙醇产量比较。横坐标为培养时间，纵坐标为乙醇 浓度。
【具体实施方式】：
[0034] 以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本 发明的实质内容加以限制。
[0035] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0036] 试验材料和试剂
[0037] 1、菌株及载体：质粒pUG6、pSH65均购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株C5D-P (表型为：MatA ura3-52)由所在实验室保存。
[0038] 2、酶类及其它生化试剂：连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国 产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0039] 3、培养基：
[0040] (1)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0· 5%酵母提取物、l%NaCl，ρΗ7· 0)。
[0041] (2)酵母培养基YPD (1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂）
[0042] (3)选择培养基SC (0· 67%YNB、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂）
[0043] 实施例1酿酒酵母COT-P中CIT2基因的敲除
[0044] 根据已知的CIT2基因和质粒pUG6的核甘酸序列，设计引物：设计方向为需要扩增 的方向，引物长度为60bp，退火温度在60-65°C。并将它们命名为敲P25354-Pug6F、CIT2上 游F、CIT2上F (上游特异性引物)，敲P25354-Pug6R、CIT2上R、CIT2下游R (下游特异性 引物）见表1。
[0045] 表1 CIT2基因敲除及验证引物
[0046]
【权利要求】
1. 一种基因工程菌株，特征是含有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的基因。
2. 权利要求1所述菌株的构建方法，特征是构建CIT2基因敲除组件、CIT2基因敲除组 件转入酵母、敲除CIT2基因，去除抗性标记，最终得到SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；所 述CIT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 权利要求1所述菌株在发酵葡萄糖和木糖中的应用。
4. 权利要求1所述菌株在乙醇生产中的应用。
5. -种提高木糖利用的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
6. 包含权利要求5所述基因的载体。
7. 用权利要求6所述的载体转化的宿主细胞。
8. 权利要求5所述基因在发酵葡萄糖和木糖中的用途。
【文档编号】C12N1/19GK104232495SQ201310224677
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月6日 优先权日:2013年6月6日
【发明者】顿宝庆, 李维维, 王智, 李桂英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所