双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、异丙醇、生物催化剂，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至转化率达到80％～100％，分批加入另一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯，继续进行反应，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。本发明两步反应可用一锅法完成，如此进行生产，反应步骤简单，可以节省生产原料和和动力能源的消耗，有效地节省了成本，在工业化应用具有十分重要的意义。
【专利说明】双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药和生物化工领域，具体涉及一种瑞舒伐他汀侧链中间体的酶法制备方法。
【背景技术】
[0002]他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A (HMG-CoA)还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物，特别是阿托伐他汀和瑞舒伐他汀近些年都进入了全球最畅销药前十名。(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯是合成瑞舒伐他汀的关键手性中间体，可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学还原方法的反应条件往往需要低温(如-70 °C)，及易燃的硼烷类化合物参与，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相对于传统化学法，生物法具有反应温和，效率高，三废产生少等优点，因此具有广泛的应用前景。
[0003]目前生物法主要是利用生物催化(5S)_6氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯制备(3民55)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯。例如美国专利US2008/0248539公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R, 5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法利用外源添加的葡萄糖脱氢酶和辅酶因子来维持反应的进行，而且在反应中会产生葡萄糖酸，需用碱维持反应的pH，增加了操作程序，影响反应的原子经济性。由于(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯有两个手性位点，目前生物法分两步还原反应制得，如附图1。反应过程由2步生物法和I步化学法组成。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术存在的问题，系统性研究两个生物催化反应的特性，提供一种一锅法催化制备(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的方法，先利用化学法合成底物，优化传统反应路线，筛选到合适的生物催化剂，同时进行两步还原反应，即两步反应可用一锅法完成，如此进行生产，反应步骤简单，可以节省生产原料和和动力能源的消耗，有效地节省了成本，在工业化应用具有十分重要的意义。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下:双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入一部分底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯、异丙醇、生物催化剂，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法(GC)检测反应进程，至转化率达到80%?100%，分批加入另一部分底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，继续进行反应，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯。
[0006]进一步地，所述的生物催化剂的形式为含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌或重组酮还原酶的粗酶液。
[0007]进一步地，所述的生物催化剂的制备方法为:将含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD6tltl值达到0.8?1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞；用2?8倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4°C下15000g离心30min，上清液即得重组酮还原酶的粗酶液。
[0008]进一步地，所述的水相缓冲液为pH 6.0?8.0的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，浓度为50?300mM。其中更优选磷酸盐缓冲液，pH6.5?7.5。
[0009]进一步地，所述的催化体系在使用重组酮还原酶的粗酶液为生物催化剂时，添加NADP作为反应辅因子，添加量为底物量的0.03%-0.3% (w/w);在使用重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞为生物催化剂时，无需添加辅因子NADP。
[0010]进一步地，在反应体系中加入的Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.l_20mM，不仅可以增加大肠杆菌细胞的通透性，而且这些离子还是酮还原酶的增强剂。其中更优选Ca2+，根据一个具体方面，所述的反应体系中所用的为CaCl2。
[0011]进一步地，所述的催化体系的底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯根据反应情况分I?3批加入，每次加入的浓度200?800mM。
[0012]进一步地，第一步反应起始时的反应体系中，底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯的总共添加浓度为10%?30% (w/v),异丙醇的浓度为5%?25% (w/v),所述还原反应体系的温度为30°C ;当选用大肠杆菌全细胞做生物催化剂时:重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KREDl的用量为底物质量的2.0%?20.0% (w/w)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KRED2的用量为底物质量的2.0%?20.0% (w/w);当选用粗酶液做生物催化剂时，重组酮还原酶的粗酶液KREDl的用量为底物质量的8.0%?80.0% (w/w)，重组酮还原酶的粗酶液KRED2的用量为底物质量的8.0%?80.0% (w/w)。
[0013]根据本发明，所用的底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯及其它使用到的原料均可商购获得。此外，本发明中所述的重组酮还原酶KREDl和KRED2的信息，为本公司通过基因定点突变获得的重组酮还原酶突变体，其碱基序列和制备方法分别参见申请号分别为201310345823.3和201310319519.1的中国专利申请。它人在实施本发明方法时可以按照本发明所述方法制备或购买。
[0014]由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势:本发明方法通过采用特定的重组酮还原酶，采用一锅法催化制备(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯，解决了传统生物法中步骤多以及成本高的问题。该方法反应无需添加有机溶剂、条件温和、反应效率高、操作简便，特别是，两步反应共用同一个反应体系，无需提出中间体即可进行下一步反应，节省物料提取溶剂和动力能源的消耗，大大提高了效率和降低了生产成本，具有十分广阔的工业化生产前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为传统反应路线；
图2本专利所述的反应路线；
图3本发明所述的双酶法催化过程示意图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0017]实施例1含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌的制备方法
分别从转化平板将含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养，培养至0D_值达到1.0时，加入诱导剂，于28°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞KREDl和KRED2。
[0018]实施例2
将实施例1所制备的含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞KREDl和KRED2用3倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎30分钟。4°C下15000g离心30min，上清液即得重组酮还原酶KREDl和KRED2的粗酶液。
[0019]实施例3
分别从转化平板将含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养，培养至0D_值达到0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于22°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞KREDl和KRED2。用3倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM, pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎30分钟。4°C下15000g离心30min,上清液即得重组酮还原酶KREDl和KRED2的粗酶液。
[0020]实施例4
分别从转化平板将含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养4小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养，培养至0D_值达到1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于32°C下继续培养16小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞KREDl和KRED2。用3倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM, pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎30分钟。4°C下15000g离心30min,上清液即得重组酮还原酶KREDl和KRED2的粗酶液。
[0021]实施例5双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法
在10mL三口烧瓶中依次加入0.32g KH2PO470.37g K2HPO4.3H20，38mL去离子水，形成pH为7.0的磷酸盐缓冲液,然后依次加入6.5g异丙醇,5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯，3.4g实施例1所制备的重组酮还原酶粗酶液KREDl，4.7g重组酮还原酶粗酶液KRED2，0.0lg无水CaCl2，0.02g NADP粉末。30 °C下磁力搅拌开始计时反应，反应路线与示意图如图2-3所示，6h取样，GC分析监测转化率98.2%，再加入5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯继续反应，14h取样，GC分析监测转化率98.7%，产物的立体构型纯度为99.6%，其中底物及产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208 °C，气化和检测温度均为230 °C，载气流量20-30ml/min，进样量
0.3-0.5 μ L，载气为N2。产物立体构型纯度的分析条件为:色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，其余条件同上。反应结束后，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯10.3g。反应示意图如图2和图3所示。
[0022]实施例6双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法
在10mL三口烧瓶中依次加入0.32g KH2PO470.37g K2HPO4.3H20，38mL去离子水，形成pH为7.0的磷酸盐缓冲液,然后依次加入6.2g异丙醇,5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯，1.2g实施例2所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KRED1，1.7g重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KRED2，0.03g无水CaCl2, 30 °C下磁力搅拌开始计时反应，反应路线与示意图如图2-3所示，6h取样，GC分析监测转化率97.5%，再加入5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯继续反应，14h取样，GC分析监测转化率98.3%，产物的立体构型纯度为99.7%。反应结束后，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(3R, 5S) -6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯 9.8g。
【权利要求】
1.双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入一部分底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯、异丙醇、生物催化齐IJ，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法(GC)检测反应进程，至转化率达到80%?100%，分批加入另一部分底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，继续进行反应，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶齐U，即得(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯。
2.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的生物催化剂的形式为含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌或重组酮还原酶的粗酶液。
3.根据权利要求2所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的生物催化剂的制备方法为:将含有酮还原酶基因KREDl和KRED2的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD6tltl值达到0.8?1.2时，加入诱导剂，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞；用2?8倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4°C下15000g离心30min,上清液即得重组酮还原酶的粗酶液。
4.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的水相缓冲液为pH 6.0?8.0的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，浓度为50?300mM。
5.根据权利要求4所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的水相缓冲液为PH6.5?7.5的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的催化体系在使用重组酮还原酶的粗酶液为生物催化剂时，添加NADP作为反应辅因子，添加量为底物量的0.03%-0.3% (w/w);在使用重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞为生物催化剂时，无需添加辅因子NADP。
7.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:在反应体系中加入的Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.l-20mM。
8.根据权利要求7所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的二价金属离子为Ca2+。
9.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的催化体系的底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯分I?3批加入，每次加入的浓度200 ?800mM。
10.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于--第一步反应起始时的反应体系中，底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯的浓度为10%?30%(w/v),异丙醇的浓度为5%?25% (w/v),所述还原反应体系的温度为30°C ;当选用大肠杆菌全细胞做生物催化剂时:重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KREDl的用量为底物质量的.2.0%?20.0% (w/w)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KRED2的用量为底物质量的2.0%?.20.0% (w/w);当选用粗酶液做生物催化剂时，重组酮还原酶的粗酶液KREDl的用量为底物质量的8.0%?80.0% (w/w)，重组酮还原酶的粗酶液KRED2的用量为底物质量的8.0%?.80.0% (w/w) ο
【文档编号】C12R1/19GK104372039SQ201310347204
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】陈令伟 申请人:南京朗恩生物科技有限公司