硫肽前体蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途
【专利摘要】本发明涉及用于硫肽生物合成的前体蛋白质、相应的结构基因及其用途。本发明还涉及用于遗传处理该前体蛋白质的方法，或表达编码该硫肽前体蛋白质的基因以产生硫肽化合物或其衍生物的宿主细胞。本发明进一步涉及参与硫肽生物合成的基因的克隆和表征及其在硫肽化合物产生中的用途。
【专利说明】硫肽前体蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途
[0001]本申请为2008年8月6日提交的、发明名称为“硫肽前体蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途”的PCT申请PCT/EP2008/060339的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年2月9日，申请号为200880102696.1。
[0002]本发明涉及用于硫肽(thiopeptide)生物合成的前体蛋白质、相应的结构基因及其用途。本发明还涉及用于遗传处理硫肽前体蛋白质的方法，或表达编码该硫肽前体蛋白质的基因以产生硫肽化合物或其衍生物的宿主细胞。本发明进一步涉及参与硫肽生物合成的基因的克隆和表征及其在硫肽化合物制备中的用途。
[0003]硫肽是天然的、富含硫的、高度修饰的大环肽，许多所述硫肽具有有效的抗生素活性。这些复杂的天然产物根据抗生素的Berdy化学分类分为噻唑肽(Berdy J.‘Recentdevelopments of antibiotic research and classification of antibiotics accordingtochemical structure.’ Adv Appl Microbiol.1974 ; 18 (0):309-406.)并包括硫链丝菌肽、诺雪七肽、微球菌素、nocathiacin、amythiamicin、GE2270A等。硫肽共有许多共同结构特征:聚集在中心多吡咯结构域中的三元或四元取代的氮杂环，其为由修饰的杂环残基(包括噻唑类、唑类和吲哚类)和脱氢氨基酸组成的大环框架(framework)的一部分。硫肽的该大环标志使得它们与其他噻唑化合物，如博来霉素、杆菌肽、或小菌素B17区分开来。Hensens首先建议根据中心杂环结构域的结构和氧化状态对硫肽抗生素进行分类(0.D.Hensens 和 G.Albers-Schoenberg.‘Total structure of the peptide antibioticcomponentsof thiopeptin by1!! and13C NMR spectroscopy.’ Tetrahedron Lett.1978,3649)。来自Cardiff University的Mark Bagley和同事的近期综述已经扩展了 Hensens的分类系统，以描述5个不同的中心杂环结构域:四元取代脱氢哌啶或饱和哌啶、二氢咪唑哌唳、三元取代批卩定和四元取代羟基吡卩定(Bagley等‘Thiopeptide antibiotics.’ ChemRev.2005 年 2 月；105(2):685-714)。
[0004]尽管具有大量结构同源性，硫肽抗生素的作用(对蛋白质合成的抑制)位点和方式可分为两个功能类:结合称为Lll结合结构域的23S核糖体RNA区域的那些和结合参与延伸循环的Ef-Tu蛋白质复合体 的那些。经常认为在1954年首次分离为远青链霉菌(Streptomyces azureus)次生代谢物的硫链丝菌肽是硫肽家族的原型化合物(Donovick等‘Thiostrepton,a new antibiotic.’Antibiot Annu.1955-1956 ；3:554-9 和 Bagley 等‘硫肽 antibiotics.，Chem Rev.2005 年 2 月；105(2):685-714)。
[0005]假定硫肽通过利用称为非核糖体肽合成酶(NRPS)的大的多酶复合体的非核糖体方法合成(Mocek等 ^Biosynthesis of the modified peptide antibiotic thiostreptonin Streptomyces azureus and Streptomyces laurentii>.J.Am.Chem.Soc.1993,115,7992一8001)。NRPS装配大环的实例是由真菌多抱木霉菌(Tolypocladiuminflatum)产生的免疫抑制肽环胞菌素。NRPS装配肽不限于通常见于蛋白质的常见的20种L氨基酸。相反，这些酶具有掺入数百种不常见氨基酸及衍生残基的更广泛的所有成分的生物合成能力。
[0006]Washington大学的Heinz Floss等人指导的预实验揭示了硫肽的确由非核糖体途径产生。该研究组用抑制核糖体蛋白质合成水平的氯霉素处理培养物。然而，硫肽的从头产生仍然继续。当用于探测来自各生产生物的基因组DNA的Southern印迹时,来自代表硫链丝菌肽或相关诺雪七肽的氨基酸序列的寡核苷酸不能与任何同源序列杂交(T.M.Smith, Y.-F.Jiang, H.G.Floss.’ Thiopeptide Antibiotics’ ’ in”Biotechnologyof Antibiotics’’ W.R.Strohl,编著,第 2 版,Marcel-Dekker, New York, 1997,第 393-413页)。
[0007]此外，在生成菌株中已经鉴定了假定编码微球菌素合成酶复合体组件的NRPS基因片段(Carnio 等 iPyridinyl polythiazole class peptide antibiotic micrococcinPl, secreted by foodborne Staphylococcus equorum WS2733, is biosynthesizednonribosomally.’ Eur J Biochem.2001 年 12 月；268 (24):6390-401.)。
[0008]然而，至今仍未有硫肽生物合成途径的出版说明书。
[0009]因此，需要鉴定参与硫肽生物合成的基因，其将为有效的硫肽制备提供工具并为产生可选的硫肽结构提供可能性。本发明满足了该需要并第一次公开了用于硫肽生物合成的染色体编码骨架(backbone)以及参与硫肽生物合成的核心生物合成酶。
[0010]1.作为硫肽生物合成起始材料的染色体编码骨架
[0011]本发明人确实已经发现了这样的确凿证据，例如在放线菌物种中染色体编码骨架是用于硫肽生物合成的起始材料。
[0012]第一方面，本发明涉及包含选自以下的氨基酸序列的硫肽前体蛋白质
[0013](i)SEQ ID NO:1 ；
[0014](ii) SEQ ID NO:5 ; [0015](iii) SEQ ID NO:11 ;和
[0016](iv)任何所述氨基酸序列的变体。
[0017]如本文所用，术语“硫肽”指根据抗生素的Berdy’ s化学分类的噻唑肽，与其他噻唑化合物，如博来霉素、杆菌肽、或小菌素B17相反，其特征在于聚集在中心多吡咯结构域中的三元或四元取代氮杂环，其为由修饰的杂环残基(包括噻唑类、唑类和吲哚类)和脱氢氨基酸组成的大环框架的一部分。
[0018]术语“硫肽前体蛋白质”指可用作体外或体内硫肽合成起始材料的基因编码多肽骨架。优选地，所述硫肽前体是细菌延伸因子Ef-tu的抑制剂的前体。Ef-tu抑制剂描述于例如 Hogg T, Mesters JR 和 Hilgenfeld R.( ‘Inhibitory mechanisms ofantibiotics targeting elongation factor Tu.’ Curr Protein Pept Sc1.2002 年2月；3(1):121-31)的综述中。众所周知的Ef-tu抑制剂的实例是GE2270A(如Selva等 ‘Antibiotic GE2270A:a novel inhibitorof bacterial protein synthesis.1.1solation and characterization.’ J Antibiot(Tokyo).1991 年 7 月；44(7):693-701中定义)、GE37648A(如 Stella 等‘Antibiotic GE37468A:a new inhibitorof bacterialprotein synthesis.1.1solation and characterization.’ J Antibiot(Tokyo).1995 年8 月；48 (8):780-6, Erratum:J Antibiot (Tokyo) 1995 年 12 月；48 (12):C_3 中定义)和Amythiamicin (如(‘Novel antibiotics, amythiamicins.’ J Antibiot (Tokyo).1994 年6月；47(6):668-74,1145-52和1153-9中定义)。新的Ef-tu抑制剂也描述于2007年12月19日提交的国际专利申请号PCT / US07 / 025955中。此类新Ef-tu抑制剂更特异地包括如下表示的通式I到XI的化合物(包括其可药用盐，以及其对映异构体、立体异构体、
旋转异构体、互变异构体、非对映体或外消旋物):
[0019]
【权利要求】
1.包含选自以下的氨基酸序列的硫肽前体蛋白质:
(i)SEQ ID NO:1;
(ii)SEQ ID NO:5;
(iii)SEQ ID N0:11;(iv)或当与SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO: 11 相比时，具有不超过 1、2、3、4、5、6或10个缺失、插入和/或取代氨基酸的所述氨基酸序列的变体。
2.权利要求1的硫肽前体蛋白质，其中所述前体是Ef-tu硫肽抑制剂的生物合成前体。
3.权利要求2的硫肽前体蛋白质，其中所述Ef-tu抑制剂选自GE2270A、GE37648A、Amythiamicin或如以下任意通式1-XI中的任意通式所示的化合物:
4.核酸,其包含编码权利要求1-3中任一项的硫肽前体蛋白质的核苷酸序列。
5.权利要求4的核酸，其包含SEQID NO: 5的核苷酸序列。
6.权利要求5的核酸，其包含SEQID NO:6的核苷酸序列或包含至少SEQ ID N0:5的其任何片段。
7.权利要求4-6中任一项的核酸，其中所述核酸序列有效连接异源转录和翻译控制序列。
8.权利要求7的核酸，其中所述核酸是表达载体。
9.用于硫肽生物合成的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列: (i)SEQID NO:23-34 中的任一个， (ii)(i)中列出的氨基酸序列的变体，当与(i)中列出的相应野生型氨基酸序列相比时，其具有不超过1、2、3、4、5、6、或10个缺失、插入或取代氨基酸，并保留基本上相同的酶功能。
10.核酸,其包含编码权利要求9的多肽的核苷酸序列。
11.权利要求10的核酸，其中所述核酸序列有效连接异源转录和翻译序列。
12.包含权利要求4-6中任一项的核酸的宿主细胞，其中在所述宿主细胞的基因组中未天然发现所述核酸。
13.权利要求12的宿主细胞，其还包含硫肽生物合成所需的其他基因。
14.权利要求13的宿主细胞，其中硫肽生物合成所需的所述其他基因包含权利要求10或11定义的核酸。
15.权利要求13或14的宿主细胞，其选自野野村氏菌属物种、游动双孢菌属物种、拟无枝酸菌属物种、大肠杆菌(Escherichia coli)、棒杆菌属物种(Corynebacteriumsp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)和链霉菌属物种，如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、白色链霉菌(Streptomyces albus)、Streptomyces ramocissimus、丘链霉菌(Streptomyces collinus)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、远青链霉菌或灰色链霉菌(Streptomyces griseus),并且其中所述宿主细胞针对所述硫肽提供抗性。
16.突变体微生物，其中与相应野生型微生物相比时，所述突变体微生物不再表达编码如权利要求1-8中任一项定义的硫肽前体蛋白质的基因。
17.权利要求16的突变体微生物，其中所述突变在相应野生型微生物中是编码如权利要求1-8中任一项定义的硫肽前体蛋白质的基因的破坏。
18.权利要求17的突变体微生物，其中所述微生物是野野村氏菌属物种并且所述突变是包含SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16的基因的破坏。
19.权利要求16-18中任一项的突变体微生物，其中用权利要求1-8中任一项的核酸进一步转化所述突变体。
20.突变体微生物，其中所述突变体微生物不再表达编码如权利要求9定义的一个或多个多肽的一个或多个基因。
21.用于硫肽生物合成的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列: (i)SEQID N0:47-60 的中任一个， (ii)(i)中列出的氨基酸序列的变体，与(i)中列出的相应野生型氨基酸序列相比时，其具有不超过1、2、3、4、5、6或10个缺失、插入或取代氨基酸，并保留基本上相同的酶促功能或调节功能， (iii)(i)中列出的氨基酸序列的变体，其与Q)中列出的一个多肽具有至少80%或至少90%的同一性，并保留基本上相同的酶促功能或调节功能。
22.包含编码权利要求21的多肽的核苷酸序列的核酸。
23.权利要求22的核酸，其中所述核酸序列有效连接异源转录和翻译序列。
24.包含权利要求22或23的核酸的宿主细胞，其中在所述宿主细胞的基因组中未天然发现所述核酸。
25.权利要求24的宿主细胞，其还包含硫肽生物合成需要的其他基因。
26.权利要求25的宿主细胞，其中硫肽生物合成需要的所述其他基因选自编码权利要求4-8中任一项的硫肽前体蛋白质的核酸和权利要求10-11的核酸。
27.突变体微生物，其能够产生一个或多个特定基因的表达有缺陷的硫肽，所述特定基因编码如权利要求21中所定义的一个或多个多肽。
28.用于产生硫肽前体蛋白质的方法，所述方法包括在适合于产生所述硫肽前体蛋白质的条件下培养权利要求12、13、15或24-26的宿主细胞的步骤。
29.产生硫肽化合物的方法，所述方法包括在适合于产生所述硫肽前体化合物的条件下培养权利要求12、13、15或24-26的宿主细胞的步骤。
30.权利要求28或29的方法，其还包括分离基本纯形式的所述硫肽前体或硫肽化合物。
31.权利要求29或30的方法，其中所述硫肽化合物选自:GE2270A、GE37648A、如权利要求5中任意通式1-X中任意通式所示的化合物、amythiamicin、微球菌素、硫链丝菌肽、诺雪七妝、高硫青霉素、thiocins、nocathiacins、伯尔尼霉素、A10255B和radamycin。
32.产生硫肽衍生物的方法，其包括: (i)通过在所述宿主细胞中基因表达编码所述改变的硫肽前体的序列，在宿主细胞中合成改变的硫肽前体， (ii)从所述改变的硫肽前体合成所述硫肽衍生物。
33.权利要求32的方法，其中所述改变的硫肽衍生物前体是如权利要求1-11中任一项定义的 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO: 11 的变体。
34.权利要求32或33的方法，其中步骤ii)在体外进行。
35.权利要求32或33的方法，其中步骤ii)在与步骤i)相同的宿主细胞中体内进行。
36.产生硫肽或硫肽衍生物的方法，其包括: (i)提供包含如1-3中任一项中定义的硫肽前体蛋白质的培养基， (ii)在所述培养基中培养微生物，其中所述微生物还包含硫肽生物合成所需的其他基因。
37.权利要求36的方法，其中硫肽生物合成所需的所述其他基因选自编码下述多肽的那些基因，所述多肽选自SEQ ID N0:23-34和SEQ IDNO:47-60?
38.权利要求36或37的方法，其中所述微生物选自自野野村氏菌属物种、游动双孢菌属物种、拟无枝酸菌属物种和链霉素物种，如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、白色链霉菌、Streptomyces ramocissimus、丘链霉菌、弗氏链霉菌、远青链霉菌或灰色链霉菌,其中所述微生物是选择为对所述硫肽或硫肽衍生物有抗性的菌株。
【文档编号】C12N1/20GK103483424SQ201310347021
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2008年8月6日 优先权日:2007年8月9日
【发明者】R·莫里斯 申请人:诺瓦提斯公司