两步催化制备(r)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：其以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物，在同一个反应体系，利用生物催化剂，通过两步催化反应，在水相缓冲液中反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，过程中不需对中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化。本发明反应步骤简单、成本较低、减少了有机溶剂和剧毒品的使用量，是一种绿色生产方法。
【专利说明】两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种两步生物催化耦联制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法。
【背景技术】
[0002]他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A (HMG-CoA)还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物。其中最有代表性的是阿托伐他汀(Atorvastatin)和罗素伐他汀(Rosuvastatin)，前者是世界上首款销售额突破百亿美金的药物，而后者则是迄今为止降脂效果最好的他汀类药物，又被成为“超级他汀”。最近又有大量的临床研究结果表明:他汀类药物除了是最有效的降低胆固醇的药物，而且对骨质疏松症、老年痴呆症、心脏病和糖尿病等各种疾病都有显著疗效，如果进一步开发新适应症，他汀类药物无疑将会有更大的的临床应用范围。作为他汀类药物的关键手性中间体的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，市场的需求量会越来越大。
[0003](R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学法的反应条件苛刻，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相比较而言，生物法的反应条件温和，更加实用和环保。目前研究主要是利用(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，在卤醇脱卤酶的作用下脱卤加氰基得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。国内专利CN 101760468公开了利用突变到的卤醇脱卤酶催化生产(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，但酶活较低，催化效率低，成本高，不利于大规模工业化生产。在国内专利CN 103014082公开制备(R) _4_氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法中，添加冻干酶粉，在水相体系中通过补加20%稀硫酸和30%的NaCN溶液控制反应体系的pH，催化剂的成本较高，无法进行大规模产业化应用，而且补入的NaCN溶液严重过量，NaCN是剧毒品，给后提取和操作环境安全隐患，不利于绿色环保的要求。
[0004]同时，由于所用底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯也是由生物法获得，一般是先提取得到纯品的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，再进行下一步反应，目前也尚无不经纯化中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，直接进行下一步反应的报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种两步法催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，该方法反应步骤简单、成本较低、减少了有机溶剂和剧毒品的使用量，是一种绿色生产方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下:两步催化制备(R)_4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:其以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物，在同一个反应体系，利用生物催化剂，通过两步催化反应，在水相缓冲液中反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，过程中不需对中间产物(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化。
[0007]所述的两步催化反应为，第一步，4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)在含有重组酮还原酶KREDl基因的大肠杆菌细胞的催化下生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，第二步
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在含有卤醇脱卤酶HHDH的大肠杆菌的催化下生成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。整个过程在同一个水相体系中进行，第一步反应结束后不需对中间产物(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化直接进行第二步反应。
[0008]所述的含有重组酮还原酶KREDl基因的大肠杆菌细胞的制备方法为:将含有酮还原酶KREDl基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至0D_值达到0.8?1.2时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌全细胞。
[0009]所述的含有卤醇脱卤酶HHDH的大肠杆菌的制备方法为:将含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至0D600值达到0.8?1.2时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2?8倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4°C下15000g离心30min，上清液即得卤醇脱卤酶HHDH液。
[0010]进一步地，所述第一步反应起始时的反应体系中，底物COBE的浓度总体为10%?30% (w/v)，包括后续分批加入的；重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的0.5%?8.0% (w/w),异丙醇的浓度为3%?15% (w/v),所述不对称还原反应在pH为
6.0?8.0的50mM的水相磷酸盐缓冲液中进行，反应体系的温度为30°C。根据一个优选方面，反应起始时的反应体系中，底物COBE的浓度为20%?25% (w/v)，反应中无需添加辅酶因子。
[0011]进一步地，在第一步反应体系中加入的Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.5-20mM，不仅可以增加大肠杆菌细胞的通透性，而且这些离子还是酮还原酶KREDl的增强剂。其中更优选Ca2+，根据一个具体方面，所述的反应体系中所用的为CaCl2。
[0012]进一步地，第一步反应结束后，加入pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，然后在真空度
0.05 MPa的条件下把温度升至50°C后保持lOmin，加入卤醇脱卤酶HHDH液开始第二步反应。其中pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液是通过往30%氰化钠加磷酸调节pH至7.0。
[0013]进一步地，第二步反应起始时的反应体系中，加入NaCN的终浓度为2%?6% (w/V)，卤醇脱卤酶HHDH液的用量为反应总体积的0.5 %?4.0 % (w/v)，反应体系的温度为45 ?50°C。
[0014]进一步地，第二步反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至6.8?7.3。
[0015]根据本发明的一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下:在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)、异丙醇、CaCl2、重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法(GC)检测反应进程，至转化率达到80%?100%，分批加入底物COBE。继续进行反应，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，然后在真空度0.05MPa的条件下把温度升至50°C后保持lOmin，加入卤醇脱卤酶HHDH液开始第二步反应，反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至6.8?7.3。利用气相色谱方法(GC)检测反应进程，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
[0016]进一步地，底物COBE根据反应情况分I?3批加入，每次加入的浓度200?800mM。可有效避免高浓度的底物COBE影响其转化率和产物的立体选择性。
[0017]根据本发明，所用的底物COBE及其它使用到的原料均可商购获得。此外，本发明中所述的卤醇脱卤酶HHDH基因已公知，可通过市售途径获得，，所述的酮还原酶KREDl基因序列及其制备方法参见本公司申请号为201310345823.3的发明专利。它人在实施本发明方法时可以按照本发明所述方法制备或购买。
[0018]由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势:本发明方法通过两步催化反应，采用特定的重组酮还原酶KREDl和卤醇脱卤酶，解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题；由于第二步反应开始前通过磷酸调节pH,使整个反应体系具备一定的PH缓冲能力，减少了 NaCN的加入量。该方法反应，无需提出中间体即可进行下一步反应，无需添加有机溶剂和还原性辅因子、条件温和、反应效率高、成本低、操作简便，特别是，两步反应共用同一个反应体系，节省物料提取溶剂和动力能源的消耗，有效地节省了成本，具有十分广阔的工业化生产前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1两步法催化制备(R)_4-氰基-3-羟基丁酸乙酯路线图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0021]实施例1含有酮还原酶KREDl基因的重组大肠杆菌的制备方法
从转化平板将含有酮还原酶KREDl基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养，培养至0D_值达到
1.0时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷至终浓度ImM，于28°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌全细胞。
[0022]实施例2
从转化平板将含有酮还原酶KREDl基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养，培养至0D_值达到
0.8时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷至终浓度ImM，于22°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌全细胞。
[0023]实施例3
从转化平板将含有酮还原酶KREDl基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养4小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养，培养至0D_值达到
1.2时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷至终浓度ImM，于32°C下继续培养16小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌全细胞。
[0024]实施例4含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌的制备方法
将含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养，培养至0D_值达到1.0时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于28°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用3倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟。4°C下15000g离心30min，上清液即得卤醇脱卤酶HHDH液。
[0025]实施例5
将含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养，培养至0D_值达到0.8时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于22°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎30分钟。4°C下15000g离心30min，上清液即得卤醇脱卤酶HHDH液。
[0026]实施例6
将含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养4小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养，培养至0D_值达到1.2时，加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，于32°C下继续培养16小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用8倍体积的三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟。4°C下15000g离心30min，上清液即得卤醇脱卤酶HHDH液。
[0027]实施例7
在10mL三口烧瓶中依次加入0.28g KH2PO4,0.31g K2HPO4.3H20，32mL去离子水，形成pH为7.0的磷酸盐缓冲液，然后依次加入5.0g异丙醇，6.5g底物COBE, 1.0g实施例1制备的重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌细胞，0.028g无水CaCl2, 30 °C下磁力搅拌开始计时反应，4h取样，GC分析监测转化率98.5%，再加入6.5g底物COBE继续反应，1h取样，GC分析监测转化率99.2%，加入pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液10.0ml，然后在真空度0.05 MPa的条件下把温度升至50°C后保持lOmin，加入实施例2制备的卤醇脱卤酶HHDH液1.2g开始第二步反应，反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至7.0。GC分析监测反应进程，反应18h取样，转化率98.2%，结束反应，加入等体积乙酸乙酯多次萃取2次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯10.6g，产物的纯度为98.7%，光学ee为99.8%。其中产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208 °C，气化和检测温度均为230 °C，载气流量20-30ml/min，进样量0.3-0.5 μ L，载气为N2。产物ee值的分析条件为:色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，其余条件同上。
[0028] 实施例8
在1L的反应器中依次加入28g KH2PO4, 31g K2HPO4.3H20, 3.2L去离子水，形成pH为
7.0的磷酸盐缓冲液，然后依次加入500g异丙醇，630g底物COBE，IlOg实施例1制备的重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌细胞，2.8g无水CaCl2, 30 °C下磁力搅拌开始计时反应，4h取样，GC分析监测转化率98.3%，再加入630g底物COBE继续反应，12h取样，GC分析监测转化率98.7%，加入实施例2制备的pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液1.0L,然后在真空度0.05MPa的条件下把温度升至50°C后保持lOmin，加入卤醇脱卤酶HHDH液115g开始第二步反应，反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至7.0。GC分析监测反应进程，反应20h取样，转化率98.5%，结束反应，加入等体积乙酸乙酯多次萃取2次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯1106g，产物的纯度为98.5%，光学ee为99.8%。
【权利要求】
1.两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:其以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，在同一个反应体系，利用生物催化剂，通过两步催化反应，在水相缓冲液中反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，过程中不需对中间产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯提取纯化。
2.根据权利要求1所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述的两步催化反应为，第一步，4-氯乙酰乙酸乙酯在含有重组酮还原酶KREDl基因的大肠杆菌细胞的催化下生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，第二步(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在含有卤醇脱卤酶HHDH基因的大肠杆菌的催化下生成(R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
3.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述的含有重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌细胞的制备方法为:将含有重组酮还原酶KREDl基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD6tltl值达到0.8?1.2时，加入诱导剂，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶KREDl的大肠杆菌全细胞。
4.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述的含有卤醇脱卤酶HHDH基因的大肠杆菌的制备方法为:将含有卤醇脱卤酶HHDH基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至0D600值达到0.8?1.2时，力口入诱导剂，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体，用2?8倍体积的2mM，pH7.0的三乙醇胺缓冲液悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4°C下15000g离心30min，上清液即得卤醇脱卤酶HHDH液。
5.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述第一步反应起始时的反应体系中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度为10%?30%(w/v)，重组酮还原酶KREDl基因的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的0.5%?8.0% (w/w),异丙醇的浓度为总反应体系的3%?15% (w/v),所述不对称还原反应在pH为6.0?8.0的50mM的水相磷酸盐缓冲液中进行，反应体系的温度为30°C。
6.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:在第一步反应体系中加入的Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.5-20mM。
7.根据权利要求2所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:第一步反应结束后，加入PH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，然后在真空度0.05 MPa的条件下把温度升至50°C后保持lOmin，加入卤醇脱卤酶HHDH液开始第二步反应。
8.根据权利要求7所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于:第二步反应起始时的反应体系中，加入氰化钠磷酸溶液的终浓度为2%?6% (w/v)；所述的第二步反应过程中卤醇脱卤酶HHDH液的用量为反应总体积的0.5%?4.0% (w/v)，反应体系的温度为45?50°C ;还用30%的NaCN溶液控制体系的pH至6.8?7.3。
9.根据权利要求1-8任一项所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，具体实施过程如下:在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯、异丙醇、CaCl2、重组酮还原酶KREDl基因的大肠杆菌全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程；至转化率达到80%?100%，分批加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯，继续进行反应，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入pH 7.0的30%氰化钠磷酸溶液，然后在真空度0.05 MPa的条件下把温度升至50°C后保持lOmin，加入卤醇脱卤酶HHDH液开始第二步反应，反应过程中用30%的NaCN溶液控制体系的pH至6.8?7.3 ;利用气相色谱方法检测反应进程，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
10.根据权利要求9所述的两步催化制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，底物4-氯乙酰乙酸乙酯分I?3批加入，每次加入的浓度200?800mM。
【文档编号】C12P7/62GK104372038SQ201310347202
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】陈令伟 申请人:南京朗恩生物科技有限公司