一种制备单宁酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备单宁酶的方法，无花果曲霉斜面菌种经摇瓶扩大培养，以玉米粉、豆粕混合物或蔗渣、麸皮混合物为发酵培养基底物，加入盐溶液配置成发酵培养基。接入无花果曲霉悬液，35℃恒温发酵65h，加入pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，震荡提取90min,经滤纸过滤，收集粗酶液，纯化，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
【专利说明】一种制备单宁酶的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备单宁酶的方法，属于生物发酵领域。
【背景技术】
[0002]单宁酶(Tannase EC3.1.1.20)，又称单宁酯酰水解酶，是一种诱导酶，能由某些微生物在单宁酸等诱导物存在时诱导合成。单宁酶能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和其他化合物。单宁酶广泛应用于饮料、酿酒、医药、制革、化妆品等领域，特别是在制备药用中间体没食子酸和食品抗氧化剂没食子酸丙酯以及在处理茶叶“冷后浑”和啤酒沉淀等方面，具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种制备单宁酶的方法。
[0004]本发明的目的通过如下技术方案实现:
[0005]一种制备单宁酶的方法，包括以下步骤:
[0006](I)种子扩大培养:将无花果曲霉斜面菌种接入摇瓶扩大培养；
[0007](2)配置发酵培养基:以玉米粉、豆柏混合物或蔗渣、麸皮混合物作发酵培养基底物，加入盐溶液，灭菌、 冷却；
[0008](3)单宁酶发酵:培养基冷却后，接入ImL无花果曲霉菌悬液，恒温发酵；
[0009](4)粗酶液制备:往恒温发酵结束后的发酵培养基加入PH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，置于摇床震荡提取90min，过滤，收集粗酶液；
[0010](5)单宁酶纯化。
[0011]步骤(2)中所述的玉米粉、豆柏混合物由玉米粉、豆柏以2: I的质量比均匀混合而成，蔗渣、麸皮混合物是由蔗渣、麸皮以1:1质量比均匀混合制成，培养基底物和加入的盐溶液成6: 7质量体积比比例，每升盐溶液含有10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7H20。
[0012]步骤(3)中所述的无花果曲霉悬液为无花果曲霉Gim3.6(购于广东省菌种保藏中心)悬液，浓度为I X IO8个孢子/mL，单宁酶发酵条件为35°C恒温发酵65h。
[0013]步骤(4)中所述的发酵培养基与pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1: 10质量体积比，摇床摇速为160r/min。
[0014]步骤(5)中所述的单宁酶纯化包括三种方法，单宁酶纯化包括三种方法，方法一是硫酸铵分级沉淀法，往粗酶液中加入饱和度为30%?70%硫酸铵，收集沉淀，加入与步骤
(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉；方法二是丙酮沉淀法，往粗酶液中加入_20°C丙酮，4°C静置3h，6000r/min离心分离20min，收集沉淀，加入与步骤(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉；方法三是反胶团萃取法，将收集到的粗酶液作为水相，以1:1体积比加入有机相75mmol/LCTAB-异辛烷反胶团溶液，在200r/min摇床上震荡混合13min,4000r/min离心分离5min,取有机相,按1:1体积比加入反萃取水相0.5mol/L NaCl溶液,在200r/min摇床上震荡混合30min, 4000r/min离心分离5min,获取水相，用聚乙二醇6000包埋浓缩，以葡聚糖凝胶Sephacryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
[0015]用无花果曲霉发酵生产单宁酶，发酵周期短，发酵工艺简单，培养过程易于控制。反胶团萃取技术对粗酶液进行纯化，经济适用，容易进行工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明单宁酶制备工艺流程。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此夕卜，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0018]实施例1
[0019]无花果曲霉Gim3.6 (购于广东省菌种保藏中心)斜面菌种经摇瓶扩大培养。玉米粉、豆柏按2: I的质量比均匀混合作为发酵培养基底物，按6: 7质量体积比加入盐溶液(每升盐溶液含有10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7H20。)，灭菌、冷却。接入浓度为IX IO8个孢子/mL的无花果曲霉菌悬液lmL,35°C恒温发酵65h。恒温发酵结束后,按1:10质量体积比把pH5.5 的朽1檬酸-朽1檬酸钠缓冲液加入发酵培养基中，置于摇速为160r/min的摇床上震荡提取90min，过滤，收集粗酶液。往粗酶液中加入饱和度为30%硫酸铵，收集沉淀，加入与PH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
[0020]实施例2
[0021]无花果曲霉Gim3.6 (购于广东省菌种保藏中心)斜面菌种经摇瓶扩大培养。玉米粉、豆柏按2: I的质量比均匀混合作为发酵培养基底物，按6: 7质量体积比加入盐溶液(每升盐溶液含有10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7H20。)，灭菌、冷却。接入浓度为IX IO8个孢子/mL的无花果曲霉菌悬液lmL,35°C恒温发酵65h。恒温发酵结束后,按1:10质量体积比把pH5.5的朽1檬酸-朽1檬酸钠缓冲液加入发酵培养基中，置于摇速为160r/min的摇床上震荡提取90min，过滤，收集粗酶液。往粗酶液中加入饱和度为50%硫酸铵，收集沉淀，加与PH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
[0022]实施例3
[0023]无花果曲霉Gim3.6(购于广东省菌种保藏中心)斜面菌种经摇瓶扩大培养。蔗渣、麸皮按1:1质量比均匀混合作为发酵培养基底物，按6: 7质量体积比加入盐溶液(每升盐溶液含有 10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7Η20。)，灭菌、冷却。接入浓度为 IX IO8 个孢子/mL的无花果曲霉菌悬液lmL，35°C恒温发酵65h。恒温发酵结束后，按1: 10质量体积比把PH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入发酵培养基中，置于摇速为160r/min的摇床上震荡提取90min，过滤，收集粗酶液。往粗酶液中加入饱和度为70%硫酸铵，收集沉淀，力口与PH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
[0024]实施例4
[0025]无花果曲霉Gim3.6(购于广东省菌种保藏中心)斜面菌种经摇瓶扩大培养。蔗渣、麸皮按1:1质量比均匀混合作为发酵培养基底物，按6: 7质量体积比加入盐溶液(每升盐溶液含有 10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7Η20。)，灭菌、冷却。接入浓度为 IX IO8 个孢子/mL的无花果曲霉菌悬液lmL，35°C恒温发酵65h。恒温发酵结束后，按1: 10质量体积比把PH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入发酵培养基中，置于摇速为160r/min的摇床上震荡提取90min，用双层定性滤纸过滤，收集粗酶液，加入_20°C丙酮，4°C静置3h，6000r/min离心分离20min，收集沉淀，加入与pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
[0026]实施例5
[0027]无花果曲霉Gim3.6 (购于广东省菌种保藏中心)斜面菌种经摇瓶扩大培养。玉米粉、豆柏按2: I的质量比均匀混合作为发酵培养基底物，按6: 7质量体积比加入盐溶液(每升盐溶液含有10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7H20。)，灭菌、冷却。接入浓度为IX IO8个孢子/mL的无花果曲霉菌悬液lmL,35°C恒温发酵65h。恒温发酵结束后,按1:10质量体积比把pH5.5的朽1檬.酸-朽1檬酸钠缓冲液加入发酵培养基中，置于摇速为160r/min的摇床上震荡提取90min，过滤，收集粗酶液。将收集到的粗酶液作为水相，在温度为30°C的条件下按1:1的体积比加入有机相75mmol/L的CTAB-异辛烷反胶团溶液，在转速为200r/min的摇床上震荡混合13min, 4000r/min转速离心分离5min,取有机相,按1:1的体积比加入反萃取水相0.5mol/L的NaCl溶液，在转速为200r/min的摇床上震荡混合30min,以4000r/min转速离心分离5min,获取水相；用聚乙二醇6000将获取的水相包埋浓缩，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱，上样、洗脱，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
[0028]用无花果曲霉发酵生产单宁酶，发酵周期短，发酵工艺简单，培养过程易于控制。反胶团萃取技术对粗酶液进行纯化，经济实用，容易进行工业化生产。
【权利要求】
1.一种制备单宁酶的方法，包括以下步骤: (1)种子扩大培养:将无花果曲霉斜面菌种接入摇瓶扩大培养； (2)配置发酵培养基:以玉米粉、豆柏混合物或蔗渣、麸皮混合物作发酵培养基底物，加入盐溶液，灭菌、冷却； (3)单宁酶发酵:培养基冷却后，接入ImL无花果曲霉菌悬液，恒温发酵； (4)粗酶液制备:往恒温发酵结束后的发酵培养基加入pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，置于摇床震荡提取90min，过滤，收集粗酶液； (5)单宁酶纯化。
2.根据权利I所述的制备单宁酶的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的玉米粉、豆柏混合物由玉米粉、豆柏以2: I的质量比均匀混合而成，蔗渣、麸皮混合物是由蔗渣、麸皮以I: I质量比均匀混合制成，培养基底物和加入的盐溶液成6: 7质量体积比比例，每升盐溶液含有 10gNH4Cl、IgKCl、2gK2HP04、IgMgSO4.7H20。
3.根据权利I所述的制备单宁酶的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的无花果曲霉悬液为无花果曲霉Gim3.6 (购于广东省菌种保藏中心)悬液，浓度为I X IO8个孢子/mL，单宁酶发酵条件为35°C恒温发酵65h。
4.根据权利I所述的一种制备单宁酶的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的发酵培养基与pH5.5朽1檬酸-朽1檬酸钠缓冲液成1: 10质量体积比,摇床摇速为160r/min。
5.根据权利I所述的制备单宁酶的方法，其特征在于:单宁酶纯化包括三种方法。
6.根据权利I或5所 述的单宁酶纯化，其特征在于:第一个方法是硫酸铵分级沉淀法，往粗酶液中加入饱和度为30%?70%硫酸铵，收集沉淀，加入与步骤⑷中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
7.根据权利I或5所述的单宁酶纯化，其特征在于:单宁酶纯化的第二个丙酮沉淀法，往粗酶液中加入_2(TC丙酮,4?静置3h,6000r/min离心分离20min,收集沉淀,加入与步骤(4)中pH5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液成1:1体积比的5°C的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
8.根据权利I或5所述的单宁酶纯化，其特征在于:单宁酶纯化的第三个方法是反胶团萃取法，将收集到的粗酶液作为水相，以1:1体积比加入有机相75mmol/L CTAB-异辛烧反胶团溶液，在200r/min摇床上震荡混合13min,4000r/min离心分离5min,取有机相，按1:1体积比加入反萃取水相0.5mol/L NaCl溶液，在200r/min摇床上震荡混合30min,4000r/min离心分离5min,获取水相，用聚乙二醇6000包埋浓缩，以葡聚糖凝胶SephaCryl200-HR为层析柱层析，得单宁酶纯化液，冷冻干燥制得单宁酶冻干粉。
【文档编号】C12N9/18GK103436505SQ201310350225
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月13日 优先权日:2013年8月13日
【发明者】杨洋, 严东, 候杰, 马万良, 胡振兴 申请人:广西大学