一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法
【专利摘要】本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法。所述培养基由麦芽糖、酵母浸粉、Ca2+维生素E组成。该方法通过将种子发酵液接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量5%，于25℃，转速140r/min下培养。本发明的发酵方法包括菌株活化、种子发酵液培养和发酵优化。本发明可大大提高淀粉酶产量。
【专利说明】一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法。
【背景技术】
[0002]淀粉酶(amylase)是水解淀粉和糖原酶类的统称，是能够将淀粉和糖原分子水解为糊精和更小的分子的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。淀粉酶广泛应用于燃料乙醇、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一。
[0003]虽然淀粉酶在动植物中都存在，但是由于提取过程复杂、成本较高，因此工业化比较困难。微生物来源的淀粉酶提取工艺简单、成本低、产量高、
周期短、性质稳定、使用条件温和，因此微生物来源的淀粉酶在工业上得到了广泛应用，特别是在淀粉水解工业中，几乎完全取代了传统的化学水解法。
[0004]α -淀粉酶是指从淀粉分子内部随机切割α -1, 4_糖苷键，生成糊精和还原糖的一类酶，由于生成的产物末端葡萄糖残基C-1碳原子为α构型，故称为α-淀粉酶。产α -淀粉酶的微生物很多，但是研究较多的主要是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、放线菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、假单胞菌等。由于蜂球囊菌生活周期短，能够从其中快速得到α -淀粉酶，以适应工业化大生产和样品提纯，从而可以提高该菌的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法。
`[0006]本发明首先提供了一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法，其特征在于，所述培养基的原料含有:麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉1-2 g/1OOmL, Ca2+3 X 10_3_6 X IO^mol/L, Ve 0.005-0.010 g/1OOmL, pH6.8-7.2。
[0007]优选为按重量分数计，麦芽糖4 g/100mL，酵母浸粉2 g/1OOmL, Ca2+6X 10_3mol/L，Ve 0.005 g/1OOmL, pH 7.0。
[0008]其次，本发明还提供了一种蜂球囊菌发酵产淀粉酶的方法，所述方法包含以下步骤:
(a)将实验室所保存菌株转接至固体培养基上进行平板活化；
(b)将蜂球囊菌接种于种子培养基，于25°C、转速140r/min条件下培养培养3天，制得种子发酵液；
(c)将步骤(b)中制得的种子发酵液接种于权利要求1或2所述的培养基中，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量为5%，于25°C、转速140 r/min条件下培养。
[0009]所述种子培养基PDA的原料含有:按培养基重量计，马铃薯200g/L，蔗糖20g/L。
[0010]本发明采用的蜂球囊菌(梁勤，陈大福，王建鼎.营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响.中国生态农业学报，2001，9(4): 31-34)。
[0011]采用本发明优化后的培养基，菌龄3d，发酵周期48h，发酵产生结果蜂球囊菌产淀粉酶为41.55U/mL以上。
[0012]本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌发酵生产淀粉酶的培养基，具有淀粉酶产率高，淀粉酶活力高，淀粉酶活性稳定以及重复性好等优点。
【具体实施方式】
[0013]本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
[0014]实施例1
单因素实验确定培养基最优成分
(I)种子培养基配制:马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至1000mL, pH自然。高压灭菌121°C20min。
[0015](2)种子发酵液的制备:将蜂球囊菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于30°C下培养3d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将蜂球囊菌菌块(0.5X0.5cm)接种至种子培养基，25°C，转速140 r/min下培养72h，即为种子发酵液。
[0016](3)将上述种子培养基按5%接种量接种至装有50mL发酵培养基的三角瓶中(250mL)，25°C，转速 140 r/min 下培养 48h。
[0017](4)酶液的制备:取步骤(3)中的发酵液在4°C下,5000 r/min离心，IOmin,得上清
液即为粗酶液，4°C保存，备用。
[0018](5)淀粉酶酶活测定:酶活测定方法采用DNS法。酶活定义为:50 °C，pH 7.5条件下每分钟从可溶性淀粉中释放I ymoL葡萄糖所需的酶量。
[0019]方法:采用DNS法测定还原糖的含量，方法是将底物(I %的淀粉溶液)，即将Ig淀粉溶于100 mL的pH 7.5, Tris - HCl缓冲液中加热使其溶解。对照组(180 yL底物，加20 UL缓冲液，混匀)、样品组(180 yL底物，加20 μ L步骤(4)所制得的酶液，混匀)。将样品组、对照组均放入50 °C水浴锅中保温10 min，取出后各加200 μ L的DNS，沸水浴5 min后取出，用蒸馏水定容至2.5 mL，混匀后520 nm紫外光下测OD值。酶活计算公式:A =( [A1 — A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)
A——样品酶活(u/mL) A1——样品的吸光度值(OD520值)A0——空白对照的吸光度值
(OD520值校准为O) K-p-nitrophenol标准曲线的斜率
C0-p-nitrophenol标准曲线的截距N-稀释倍数V1-反应液的体积(2.5 mL)
V2——酶液的体积(0.02 mL) t——反应时间(10 min)
(5)标准曲线的制作:
【权利要求】
1.一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法，其特征在于，所述培养基的原料含有:麦芽糖 4g/100mL，酵母浸粉 l_2g/100mL，Ca2+3 X 10_3_6 X 10_3mol/L，VE0.005-0.010g/100mL, ρΗ6.8-7.2。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的原料优选为按重量分数计，麦芽糖 4g/100mL，酵母浸粉 2g/100mL，Ca2+6 X l(T3mol/L，VE0.005g/100mL, pH7.0。
3.—种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤: (a)将实验室所保存菌株转接至固体培养基上进行平板活化。 (b)将蜂球囊菌接种于种子培养基，于25C、转速140r/min条件下培养培养3天，制得种子发酵液； (c)将步骤(b)中制得的种子发酵液接种于如权利要求1所述的培养基中，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量为5%，于25°C ±1°C、转速140r/min条件下培养。
4.如权利3所述一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的方法，其特征在于，所述种子培养基为PDA，其原料含有:按培养基重量计，马铃薯200g/L，蔗糖20g/L。
5.如权利3所述一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的方法，其特征在于，步骤(c)的培养时间为2天。
【文档编号】C12R1/645GK103509769SQ201310402428
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月7日 优先权日:2013年9月7日
【发明者】邱君志, 李小霞, 曹丽萍, 孟丽雪, 郭庆丰, 何肖云, 张以盼, 涂洁, 董冬, 姚灵丹 申请人:福建农林大学