治疗肝癌的药物及raco-1单克隆抗体的应用的制作方法

治疗肝癌的药物及raco-1单克隆抗体的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗肝癌的药物及RACO-1单克隆抗体的应用，本发明治疗肝癌的药物包括药物有效量的RACO-1单克隆抗体，所述RACO-1单克隆抗体为人源RACO-1单克隆抗体，所述人源RACO-1单克隆抗体通过以下步骤制备得到：提取原发性肝细胞癌患者外周血淋巴细胞总RNA，通过逆转录PCR法克隆RACO-1DNA；采用RACO-1DNA进行噬菌体抗体库构建；筛选噬菌体抗体库得到目的细菌；提取目的细菌中的质粒DNA，切除质粒DNA中的噬菌体外壳蛋白Ⅲ基因，将剩余部分的质粒DNA进行表达、纯化得到人源RACO-1单克隆抗体，本发明具有特异性好、亲和力高、免疫原性小、副作用低等诸多优点。
【专利说明】治疗肝癌的药物及RAC0-1单克隆抗体的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，具体而言，涉及一种治疗肝癌的药物及RAC0-1单克隆抗体的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球男性第五大常见肿瘤,具有预后恶劣、死亡率高等特点，严重威胁我国人民的生命与健康。尽管近年来随着影像诊断与手术技术的不断进步以及以索拉非尼为代表的肝癌靶向治疗药物的面世，为肝癌的早期诊断与治疗提供了可能与更多且更有效的治疗选择，使肝癌的治疗水平得到了一定的提高。然而，综观目前肝癌临床治疗现状，现今尚缺乏真正有效、副作用少的肝癌治疗药物，肝癌术后复发转移率仍高居不下，术后5年生存率仍徘徊在30%上下，严重制约了肝癌总体治疗水平的提高，无法使之得到根本性的改善。
[0003]生物技术药研究是当今生命科学研究中最为活跃的领域之一，其中的分子靶向药物因其选择性高，广谱有效，不易发生耐药，同时安全性也明显优于细胞毒性化疗药物，各国均予以高度重视，现已有多个此类药物获得批准上市应用。新近经FDA批准的索拉非尼(Sorafenib)即是一种新型多祀点的抗肿瘤药物。在最近的一项多中心、双盲、安慰剂对照的III期临床试验中，Llovet等随机对602名以前未经过系统性治疗的晚期肝癌患者给予索拉非尼或安慰剂治疗，研究发现:在晚期肝癌中，索拉非尼组患者的中位生存时间比安慰剂组患者延长2.8个月。因此，美国FDA宣布索拉非尼适用于治疗无法手术切除的肝细胞肝癌。国内陈志南院士自主研发的国家生物制品一类新药“碘[1311]美妥昔单抗注射液(利卡汀)”，也是专门用于治疗肝癌的特异性抗体靶向药物，现已经批准在国内上市。该放射免疫靶向药物在前期的临床应用中显示对晚期肝癌具有一定疗效。
[0004]此外，有研究报告，以抗人AFP单抗为载体、1311和丝裂霉素为“双弹头”，治疗中晚期肝癌患者，结果显示治疗后肿瘤缩小率高于对照组。也有报告研究人肝癌单抗Hepama-1与1311偶联制成的1311-Hepama_l单克隆抗体导向治疗晚期肝癌,虽能使部分患者癌性症状减轻。但这后两项研究均未见有关提闻生存率的报告。
[0005]目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题:一是不能有效地激活人体中补体和Fe受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody, HAMA);三是在人体循环系统中被很快清除掉。
[0006]对于不能手术的晚期HCC，药物治疗是其主要治疗方式。然而，迄今系统化疗仍然没有高效的化疗药物或方案，大量的临床试验统计显示，化疗药物单药治疗肝癌的有效率大约在O~25%之间，与非治疗组比较收益甚微，仅有姑息效果，且缺乏相关的大规模III期临床试验的数据以供参考。阿霉素是传统的用于肝癌治疗的药物，但是客观缓解率仅为10%~15%，且不能延长患者生存期。靶向药物的治疗效果也并不理想，其中最为成功的索拉菲尼药物对患者生存时间的延长也仅为3个月。[0007]综上所述，有关肝癌的药物的研究尚存在许多问题，目前仍然无法很好的解决提高肝癌病人临床治疗的生存率这一关键问题，根本无法满足肝癌病人的治疗需求。

【发明内容】

[0008]本发明旨在提供一种治疗肝癌的药物及RAC0-1单克隆抗体的应用，以解决现有技术中无法很好的解决提高肝癌病人临床治疗的生存率的技术问题。
[0009]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种治疗肝癌的药物。该药物包括药物有效量的RAC0-1单克隆抗体。
[0010]进一步地，RAC0-1单克隆抗体为人源RAC0-1单克隆抗体。
[0011]进一步地，人源RAC0-1单克隆抗体通过以下步骤制备得到:提取原发性肝细胞癌患者外周血淋巴细胞总RNA，通过逆转录PCR法克隆RAC0-1 DNA ;采用RAC0-1 DNA进行噬菌体抗体库构建；筛选噬菌体抗体库得到目的细菌；提取目的细菌中的质粒DNA，切除质粒DNA中的噬菌体外壳蛋白III基因，将剩余部分的质粒DNA进行表达、纯化得到人源RAC0-1单克隆抗体。
[0012]进一步地，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:1;下游引物的序列如 SEQ ID NO:2o
[0013]进一步地，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 ;下游引物的序列如 SEQ ID NO:4ο
[0014]根据本发明的另一个方面，提供一种RAC0-1单克隆抗体在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0015]进一步地，RAC0-1单克隆抗体为人源RAC0-1单克隆抗体。
[0016]根据本发明的再一个方面，提供一种RAC0-1单克隆抗体在体外抑制肝癌细胞中的应用，包括将RAC0-1单克隆抗体以有效抑制浓度与肝癌细胞接触。
[0017]应用本发明的技术方案，将RAC0-1单克隆抗体用于制备肝癌的药物，RAC0-1单克隆抗体能够特异性地抑制RAC0-1在人体内的表达水平，从而有效的降低肝癌侵袭转移能力，提高肝癌患者的五年生存率。优选地，RAC0-1单克隆抗体采用的是人源RAC0-1单克隆抗体，其具有特异性好、亲和力高、免疫原性小、副作用低等诸多优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了 RAC0-1 mRNA和蛋白在肝癌组织中高表达；A:Real-time PCR检测25对肝癌组织及相应的癌旁组织中RACO-1mRNA水平，结果显示RACO-1mRNA在肝癌组织中呈显著性高表达；T，肝癌组织；ANLT，邻近非肿瘤肝组织；NL，正常肝组织；B: Western-blot检测肝癌组织及邻近非肿瘤肝组织中RAC0-1蛋白的表达，结果显示，RAC0-1蛋白在肝癌组织中表达明显高于邻近非肿瘤肝组织及正常肝组织，'^,P〈0.01 ；
图2示出了 Real-time PCR及Western-blot检测RAC0-1在5种肝细胞系中的表达；A: Real-time PCR检测5种肝细胞系中RACO-1mRNA水平，结果显示RACO-1mRNA水平随细胞系侵袭转移潜能升高而增加ffestern-blot检测5种肝细胞系中RAC0-1蛋白水平，结果显示RACO-1蛋白水平随细胞系侵袭转移潜能升高而增加；
图3示出了 RAC0-1在肝癌组织的免疫染色(X400)，结果显示RAC0-1主要分布于细胞衆内:A:Shimizu评分为一，阴性表达；B:Shimizu评分为1+ ；C:Shimizu评分为2+ ；D:Shimizu评分为3+ ；E =RACO-1免疫染色强度与肝癌的预后分析，高表达组总体生存时间明显低于低表达组Gd=0.004) ；F =RACO-1免疫染色强度与肝癌复发转移分析；
图4示出了抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体在体外抑制肝癌细胞侵袭转移；A:划痕愈合实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞HCCLM3迁移运动能力的影响；B =Transwell侵袭小室实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞系HCCLM3侵袭能力的影响；C:划痕愈合实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞MHCC97-H迁移运动能力的影响；D =Transwell侵袭小室实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞MHCC97-H侵袭能力的影响；
图5示出了抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体在体内抑制肝癌侵袭转移；A:利用HCCLM3细胞构建裸鼠肝癌转移模型；红色箭头指原位瘤，黑色箭头指转移瘤；B:示镜下转移灶；C:抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体处理组与对照组转移灶数目比较；以及
图6示出了抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体在体内外抑制肝癌细胞侵袭转移A:划痕愈合实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞系HCCLM3和MHCC97-H迁移运动能力的影响。B =Transwell侵袭小室实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞系HCCLM3和MHCC97-H侵袭能力的影响。C:抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体组与对照组裸鼠肝内转移灶数目比较。
【具体实施方式】
[0019]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0020]本发明的发明人采用Real-time PCR方法检测RAC0-1 (RACO-1为已知基因，基因序列可在互联网上的基因库中下载，例如NCBI)在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达，结果发现RAC0-1 mRNA在肝癌组织中呈高表达，且其在高侵袭转移能力的肝癌细胞系HCCLM3中的表达也明显高于低侵袭转移能力的肝癌细胞系H印G2，RAC0-1 mRNA表达水平随着肝癌细胞系侵袭转移能力由弱到强依次增强。由此可见RAC0-1与肝癌的侵袭转移能力关系密切。同时，采用Western-bolt方法检测RAC0-1蛋白在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达，结果同样显示RAC0-1蛋白在肝癌组织中呈高表达，且其表达水平随着肝癌细胞系侵袭转移能力由弱到强依次增强，与Real-time PCR结果完全一致，如图1和图2所示。
[0021]图1示出了 RAC0-1 mRNA和蛋白在肝癌组织中高表达。图1中的A示出了Real-time PCR检测25对肝癌组织及相应的癌旁组织(编号分别为N129、N190、N109、N185、N122、N124、N116、N191、N160、N106、N107、N126、N143、N152、N128、N132、N144、N114、N103、N163、N013、N033、N056、N098、N121)中 RACO-1mRNA 水平。其中，RAC0-1 PCR 检测引物如下:上游引物序列为 SEQ ID NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3’);下游引物序列为 SEQ IDNO:2: (5’-tgtagtcggtcagtgccttct_3，)。GAPDH (甘油醒 _3_ 磷酸脱氢酶)作为内参引物:上游引物:5’ -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物:5’ -TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’。所有引物均按100 μΜ浓度稀释备用。按Τ0Υ0Β0公司PCR试剂盒说明书，建立50 μ I PCR反应体系如下:SYBR? Green Realtime PCR MasterMix-Plus-25 μ I ；Plus Solution 5μ I ;上游引物(10 μ M) 2 μ I ;下游引物(10 μ Μ) 2 μ I ;所检测样品cDNA溶液5 μ I ；dH2011 μ 1 PCR 反应过程在 ABI Prism 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Foster City，CA，USA)上完成。反应条件为 95°C预变性 60 sec ；95°C 15 sec,60 °C 15sec, 72 V 45 sec。结果发现RAC0-1 mRNA在肝癌组织中呈高表达，且其在高侵袭转移能力的肝癌细胞系HCCLM3中的表达也明显高于低侵袭转移能力的肝癌细胞系H印G2，RAC0-1mRNA表达水平随着肝癌细胞系侵袭转移能力由弱到强依次增强。
[0022]图1中的B示出了 Western-blot检测肝癌组织及邻近非肿瘤肝组织中RAC0-1蛋白的表达。其操作步骤如下:取预先加入loading buffer的100 μ g从组织或细胞提取的总蛋白。在沸水中变性约十分钟，然后将样本以12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bio-Rad，Hercules, CA，USA)，先80V电泳约30min，蛋白样品跑出积层胶后转至120V电泳到底后分离蛋白后经电泳槽湿转法至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA。将所需条带区域胶切下后在12V下转膜约80-90min后，将5%脱脂奶粉溶于PBST封闭约一小时后置入一定浓度的一抗溶液中(抗体浓度按抗体说明书稀释)，4°C孵育过夜，PBST洗涤PVDF膜45 min,再置入1: 3000稀释的HRP标记的兔抗山羊IgG 二抗常温下孵育约一小时，用PBST洗涤PVDF膜十分钟，三次后，用高灵敏度化学发光试剂盒一比一混合后显影。本试验使用的一抗为 antihuman RAC0-1 antibody (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO),内参照一抗选择鼠抗人 β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology), 二抗选择HRP标记的兔抗鼠 IgG抗体(KPL，Gaithersburg, MD)。数码相机拍取结果,用Bandscan 5.0对条带图像进行分析，以条带的灰度值表示蛋白水平的表达量。每个样本重复检测3次，结果取其平均值。结果同样显示RAC0-1蛋白在肝癌组织中呈高表达。
[0023]图2示出了 Real-time PCR及Western-blot检测RA⑶-1在5种肝细胞系中的表达(步骤同上)，这5种肝细胞系分别为L02、H印G2、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3。其中，图2中的A示出了 Real-time PCR检测5种肝细胞系中RACO-1mRNA水平，结果显示RACO-1mRNA水平随细胞系侵袭转移潜能升高而增加；图2中的B示出了 Western-blot检测上述5种肝细胞系中RAC0-1蛋白水平，结果显示RAC0-1蛋白水平随细胞系侵袭转移潜能升高而增加。
[0024]进一步采用免疫组化法检测了肝癌组织中RAC0-1蛋白的表达，图3结果显示，RAC0-1蛋白在肝癌组织中高表达，而癌旁肝组织中则未见明显表达，且RAC0-1高表达组的患者术后无瘤生存时间及总生存时间低于RAC0-1低表达组，证实其高表达与肝癌差的预后密切相关。图3示出了 RAC0-1在肝癌组织的免疫染色(X 400)，结果显示RAC0-1主要分布于细胞衆内:其中图3中的A Shimizu评分为一,阴性表达；图3中的B Shimizu评分为1+ ;图3中的C Shimizu评分为2+ ;图3中的D Shimizu评分为3+ ；E =RACO-1免疫染色强度与肝癌的预后分析，高表达组总体生存时间明显低于低表达组Gd=0.004) ；F =RACO-1免疫染色强度与肝癌复发转移分析。实验操作步骤如下:所有石蜡标本均以3~5 μ m厚度进行连续切片，在开展免疫组化前将石蜡切片60 °C烤片约30min，然后把片子浸泡在二甲苯中进行脱蜡。大约20分钟后取出，分别用100%，95%，80%，70%乙醇和蒸馏水依次梯度脱水，室温下3 min,迅速取出载玻片，浸泡在PBS (Phosphate Buffered Saline)中5min。将玻片用放于破片架，浸在1:50稀释的EDTA修复液(北京中杉金桥生物技术有限公司，北京)中，放入微波炉中用高火煮10分钟。然后用Polink-2 plus?通用型二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，北京)进行染色，染色后用PBS漂洗3次后，漂洗后的片子滴加3% H2O2孵育。大约10分钟后PBS漂洗3次。滴加1:400稀释的antihumanRAC0-1 抗体(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 37°C孵育 I 小时，PBS 漂洗 3 次后，滴加Po I y-HRP ant1-Goat IgG, 37°C下孵育30分钟，PBS漂洗3次。漂洗后滴加新鲜配置的DAB(二氨基联苯胺，Diaminobenzidine)显色液显色。当镜下观察到细胞衆内出现明显棕黄色着色时迅速停止染色。自来水冲洗后，浸入苏木素复染液复染后，大约I分钟左右，完成后用60 1:烤箱烘干切片，中性树脂封片。[0025]发明人研究结果表明，RAC0-1在肝癌的侵袭转移过程中发挥了关键性作用。RAC0-1通过AP-1信号通路调控肝细胞癌的上皮细胞间质转化过程从而促进肝癌侵袭转移，作用机制明确，功能强大，特异性强，有望成为肝癌治疗靶点。
[0026]本发明的发明人在上述发现的基础上，制备相应的人源性单克隆抗体，通过离体及在体实验验证其抗肿瘤的药效学作用，最终获得肝癌治疗候选药物。采取噬菌体抗体库技术制备RAC0-1人源性单克隆抗体,曬菌体抗体库(phage antibody library)技术是20世纪90年代初期抗体工程领域的重大研究进展，它结合了噬菌体展示与抗体组合文库技术，把外源的DNA插入噬菌体编码的外壳蛋白pill或pVDI的基因中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体外壳蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌体库的产生、结合抗原的展不抗体的筛选、展不有闻未和力抗体的曬菌体扩增、有闻未和力的抗体的分尚和定性的具体步骤。其具体操作步骤如下:
其基本方法是从人外周血淋巴细胞中提取RNA或基因组DNA，设计核苷酸引物，用PCR方法克隆人全套抗体重链及轻链可变区基因组装到噬菌体表达载体内，与噬菌体外壳蛋白基因融合，感染大肠杆菌并使抗体片段表达于噬菌体。然后利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆性扩增，获得可溶性抗体片段(如Fab、scFV及dsFv等)，即噬菌体抗体。
[0027]根据本发明一种典型的实施方式，提供一种治疗肝癌的药物。该治疗肝癌的药物包括RAC0-1单克隆抗体。RAC0-1单克隆抗体可以是本领域技术人员通过常规的技术手段根据RAC0-1全基因序列制备的单克隆抗体。抗体制剂用于体内给药时必须是无菌的，这一点易于实现，比如，使用除菌滤膜过滤。抗体给药途径与已知方法一致，如通过静脉、腹膜、大脑、肌肉、眼内、动脉、鞘内、吸入或损伤区途径注射或输液等。
[0028]治疗所用的抗体的有效量依赖于，比如，治疗目标、给药的途径和患者的病情。因此，治疗学家优选滴定确定剂量并根据要求修改给药途径，以获得最佳治疗效果。一般情况下，临床医师将给药抗体直至达到实现所需效果的剂量。这种治疗方法的进行易于由常规检测方法监控。本发明中所提到的“有效量”与本领域通常的“有效量”含义相同；同样，本发明中所指的“有效抑制浓度”是临床医师将给药抗体直至达到实现所需效果的浓度。
[0029]本发明所述的单克隆抗体，可以同药用的载体制备成混合物。这种药物组合物可通过静脉、鼻或肺给药，优选为液体或粉末气雾剂(冻干)。组合物还可以根据需要肠胃外给药或皮下给药。当全身给药时，治疗组和物应该是无菌、无热源，并且在可用于肠胃外的溶液中，并适当考虑到PH值、等渗压性和稳定性。这些条件均为本领域技术人员所公知的。简言之，将具有所需纯度的单克隆抗体同生理可用的载体、赋形剂或稳定剂混合。这些物质的使用量和浓度上对接受者是无毒的，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机盐；抗氧化剂如抗坏血酸；小分子量(小于10个氨基酸残基)肽如聚精氨酸，蛋白如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白等。
[0030]人源化抗体是指抗体的可变区部分(即Vh和Vl区)或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。优选地，RAC0-1单克隆抗体为人源RAC0-1单克隆抗体。因为，人源单克隆抗体具有特异性好，亲和力高，免疫原性小，副作用低的特点。
[0031]优选地，人源RAC0-1单克隆抗体通过以下步骤制备得到:提取原发性肝细胞癌患者外周血淋巴细胞总RNA，通过逆转录PCR法克隆RAC0-1 DNA;采用步骤I)克隆获得的RAC0-1 DNA进行噬菌体抗体库构建；筛选噬菌体抗体库得到目的细菌；提取目的细菌中的质粒DNA，切除质粒DNA中的噬菌体外壳蛋白III基因，将剩余部分的质粒DNA进行表达、纯化得到人源RAC0-1单克隆抗体。[0032]根据本发明一种典型的实施方式，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如 SEQ ID NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3’)；下游引物的序列如 SEQ ID NO:2(5， -tgtagtcggtcagtgccttct-3，)。
[0033]根据本发明另一种典型的实施方式，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 (5，- TCAGGGAGAGAAAGGAAGACTG _3’);下游引物的序列如 SEQ ID NO:4 (5，-GTGGACAGAGCGACTTGGATAA -3，)。
[0034]本发明中，提供一种RAC0-1单克隆抗体在制备治疗肝癌药物中的应用，其中，RAC0-1单克隆抗体为人源RAC0-1单克隆抗体，即将干扰RAC0-1基因的表达作为治疗肝癌的一种方法。
[0035]下面将结合实施例进一步说明本发明。
[0036]实施例1
O总RNA的提取、逆转录PCR法克隆RAC0-1基因。
[0037]用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RAC0-1高表达原发性肝细胞癌患者(原发性肝细胞癌患者，女性，41岁)外周血淋巴细胞总RNA。取约20 μ g总RNA，加入I μ gOligodT, 5ul 250mmol/LdNTP 及 200UM-MLV 逆转录酶(GIBC0LBRL)，按产品说明书进行cDNA合成。PCR扩增RAC0-1基因，其中，扩增引物如下:上游引物序列为SEQID NO:1 NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3，)；下游引物的序列如 SEQ ID NO:2(5，-tgtagtcggtcagtgccttct-3’)。PCR 扩增的条件为:94°C变性 20min、52°C退火 50s、72°C延伸1.5min、共进行35轮循环，最后72°C延伸lOmin。
[0038]2)大肠杆菌的电穿孔转化
2.5ml过夜培养的XLl-Blue菌液接种到500ml SB培养基中，37 °C培养至A600=0.7~0.8，冰浴15min，4°C离心，弃上清，用10%冷甘油将细菌洗涤2次后，悬浮于2ml 10%甘油中，-70°C冻存备用。电穿孔时将细菌取出融化，使用Bio-Rad公司的Genepulsertransfection系统,按说明书进行穿孔。
[0039]3)噬菌体抗体库的构建
将PCR扩增的RAC0-1 DNA经Sacl+Xbal消化、电泳纯化后插入载体pComb3H中，电穿孔转化XLl-Blue细胞，然后向XLl-Blue中加3ml SOC培养液，30°C培养Ih后加入含氨苄青霉素50yg/ml、四环素10yg/ml的SB培养基20ml，37°C振荡培养2h，加入约1012空斑形成单位(PFU)的辅助噬菌体VCSMl3，接种到100ml含相同(即氨苄青霉素50 μ g/ml、四环素10 μ g/ml)抗生素的SB培养基中，37°C振荡培养2h，加入卡那霉素至终浓度70μ g/ml，30~37°C振荡培养过夜，离心收集上清，加入PEG-8000到4%，NaCl到3%，冰浴30min后，离心弃上清，以2ml含1% BSA的TBS溶解沉淀，离心收集上清即为噬菌体抗体库。
[0040]4)噬菌体抗体库滴度的测定
将噬菌体抗体库溶液按1:100的比例稀释于SB培养基中，取IOml加到100mlXLl-Blue (A600=l.0)中，铺氨苄青霉素培养基，37°C培养过夜，次日计数集落，计算集落形成单位(CFU)。
[0041] 5 )菌落直接PCR鉴定法
挑取单个细菌集落，悬于200ml水中，煮沸2min，取2ml用适当引物(上游引物序列为 SEQ ID NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3’)；下游引物序列为 SEQ ID NO:2:(5’ -tgtagtcggtcagtgccttct-3’ )进行PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测相应扩增带。
[0042]6)卩遼菌体抗体库的筛选(Panning)
将噬菌体抗体库溶液以0.05%碳酸盐缓冲液稀释至40μ g/ml，每孔25 μ I (lugRACO-1)包被ELISA板，吸去包被液，以含3% BSA (牛血清白蛋白)的PBS缓冲液加满小孔，37°C封闭lh，吸去封闭液，加入50 μ I噬菌体抗体库液(约1011~1012个CFU)，37°C培育2h，吸去噬菌体抗体液，以含0.05%吐温的TBS加满小孔，用力吹打。5min后吸弃TBS (第2轮洗5次，第3轮以后洗10次)，加入50μ I的洗脱液(0.lmol/L HC1，以甘氨酸调至pH2.2，加BSA至0.1%)，室温静置lOmin，将洗脱液稍加吹打后吸出，立即加入3μ I 2mol/L Tris中和，加2ml XLl-Blue (A600=l)，室温静置15min感染，接种到IOml SB培养基(含氨苄青霉素20 μ g/ml,四环素10 μ g/ml)中，取1.0 μ I和10 μ I铺盘测定CFU，其余菌液30°C振荡培养lh，加入氨苄青霉素至终浓度50μ g/ml，37°C继续培养lh，加入辅助噬菌体(VCSM13)1012 PFU，接种到100ml SB培养基(含氨苄青霉素20 μ g/ml，四环素10 μ g/ml)中，37°C培养2h，加入卡那霉素至终浓度70 μ g/ml，30~37°C振荡培养过夜，离心，上清进行PEG (聚乙二醇)沉淀。
[0043]7 )可溶性Fab分子的表达
将筛选扩增的噬菌体抗体库提取双链质粒DNA，用Spel/Nhel消化，切除噬菌体外壳蛋白III的编码基因，经连接酶连接自身环化后转化XLl-Blue细菌，铺氨苄青霉素盘(20yg/ml),次日随机挑取单集落，接种到IOml SB培养基(含50 μ g/ml氨节青霉素,20mmol/LMgCl2), 37°C振荡培养6h，加入IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至lmmol/L，诱导表达可溶性Fab分子，然后降低培养温度至30°C，振荡培养过夜，离心收集上清用于ELISA检测(上清即为可用于治疗肝癌的单克隆抗体)。
[0044]实施例2
PCR扩增RAC0-1基因(来自原发性肝细胞癌患者I例，女性，48岁)，其中，扩增引物如下:上游引物的序列如SEQ ID NO: 3 (5’- TCAGGGAGAGAAAGGAAGACTG-3’)；下游引物的序列如SEQ ID NO:4 (5，- GTGGACAGAGCGACTTGGATAA -3’)。其余实验条件均与实施例1相同。
[0045]下述实验中RAC0-1单克隆抗体是通过加入细胞培养液中对细胞进行处理的。[0046]将实施例1获得的单克隆抗体进行体外试验操作如下:
先按常规流程培养实验所需细胞(HCCLM3_tMl和HCCIiOantiL1以及MHCC97_H_t?i和MHccgT-HantiL1)，所有能灭菌的器械均消毒灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min。先以0.25%胰酶消化细胞，用含10% FBS的DMEM培养液中和，并轻微吹打制成单细胞悬液，按5 X 105个/孔细胞密度接种于小培养皿或6孔板，当细胞贴壁生长至95%-100%融合时，用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5-lcm 一道，用10 μ I移液器头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，划痕后用无菌PBS洗细胞3次，清洗漂浮起来的碎细胞，然后加入无血清培养基在5% CO2、37°C培养箱中继续培养24-48小时。分别于划痕后48小时给细胞拍照，观察划痕愈合情况，每组细胞做3个平行孔，重复3次，计算划痕愈合率(图4中的B和D，其中，B中示出了 Transwell侵袭小室实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞系HCCLM3侵袭能力的影响；D中示出了 Transwell侵袭小室实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞MHCC97-H侵袭能力的影响)。实验结果表明经RAC0-1单克隆抗体处理后的肝癌细胞迁移运动能力明显下降。用侵袭小室实验观察抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞侵袭能力的影响。所需检测细胞(HCCLM3e°ntMl 和 HCCLM3antHAaM 以及 MHCC97-He°ntMl 和 MHCC97-Hanti以2X IO4细胞总数加入每个小室，再加入300 μ I DMEM无血清培养基培养，同时于下室加入500 μ I含10% FBS的DMEM培养基，将小室置于配套的下室上，我们采用孔径为8 μ m的预铺Matrigel胶的Transwell板(Costar,Cambridge,USA)检测肝癌细胞侵袭能力。每板为16孔，使用前于小室内加入少量的无血清DMEM让其水化。完成上述操作后在5% CO2,370C条件下培养12-24小时。取出Transwell小室，用棉签擦尽上室面的Matrigel胶和细胞，固定后下室面用1%结晶紫溶液染色，显微镜观察。随机取3个高倍镜视野，计数小室下室面的细胞数即为穿透Matrigel胶的细胞数，实验重复3次，结果取平均值(图4中的A和C，其中A中示出了划痕愈合实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞HCCLM3迁移运动能力的影响；C中示出了划痕愈合实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞MHCC97-H迁移运动能力的影响)，证实RAC0-1单克隆抗体能明显降低肝癌细胞系的运动侵袭能力。
[0047]将实施例1获得的单克隆抗体进行体内裸鼠成瘤实验操作如下:在实验过程中对动物的饲养及取材均遵守实验动物管理与保护的有关规定。饲养条件如下:恒温(25°C -27°C)、恒湿(45% -50%)、新鲜空气高度除尘除菌、无特殊支原体环境下饲养一周左右。购买4-6周龄雄性BALB/C-nu/nu裸鼠8只(每组4只)，饲养于SPF级无菌饲养室。动物置于专用培养箱内，安放于层流式超净架内。将处于对数生长期的实验组细胞(加入GFP荧光)和对照组细胞(无GFP)，培养至足够量时(达到IXlO7/只)时开展裸鼠肝脏原位种植成瘤实验。
[0048]细胞实验前准备:首先将实验组细胞和对照组细胞1:1混合(HCCLM3_tn)1和HCCIiO31^.4 以及 MHCC97-H_tMl 和 ΜΗ(Χ97-!η+ΚΑαΜ)，用 ImlTIP 头将细胞反复吹打使其成为细胞悬液，将细胞转移至离心管离心后，继续加培养基将细胞浓度调整为5X107/ml。实验用裸鼠用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，每只裸鼠用量约0.2-0.5ml，先注射0.2ml，观察2分钟左右，如注射量不够再加0.1ml，直至裸鼠达到麻醉效果为止。用络合碘消毒已麻醉好裸鼠右上腹部皮肤，范围约3cm左右，于右上腹肋缘下作长约Icm斜切口，显露肝脏右叶，用注射器吸取准备好的细胞悬液0.2ml，在肝右叶区域作肝脏被膜下注射0.2ml量后，观察肝脏出血情况，必要时止血。仔细缝合关腹，平均缝合2针每只。实验结果观察:约40天时，采用颈椎脱位法处死裸鼠，完整解剖取出肝脏种植瘤，肉眼观察肝脏种植瘤并拍照，将肺组织浸泡于10%的中性甲醛中过夜，石蜡包埋后行连续切片，常规用抗GFP抗体做免疫组织化学染色后显微镜下计数肝肺转移灶的数量。并做统计分析。[0049]在体内裸鼠成瘤实验中，证明抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体下调RAC0-1能明显抑制HCCLM3细胞的侵袭转移(结果如图5所示，图5中A示出了利用HCCLM3细胞构建裸鼠肝癌转移模型；红色箭头指原位瘤，黑色箭头指转移瘤示出了示镜下转移灶；C示出了抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体处理组与对照组转移灶数目比较)。
[0050]将实施例2获得的单克隆抗体进行实验，实验步骤同上，也得出了相近的结果，如图6所示。图6示出了抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体在体内外抑制肝癌细胞侵袭转移。其中，图6中的A:划痕愈合实验研究抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体对肝癌细胞系HCCLM3和MHCC97-H迁移运动能力的影响。B =Transwell侵袭小室实验研究抗肝癌人源性RA⑶-1单克隆抗体对肝癌细胞系HCCLM3和MHCC97-H侵袭能力的影响。C:抗肝癌人源性RA⑶-1单克隆抗体组与对照组裸鼠肝内转移灶数目比较
RAC0-1在肝癌的侵袭转移过程中发挥了关键性作用。RAC0-1通过与AP-1成员C-JunD的相互作用调控AP-1信号通路，这对AP-1信号通路的激活十分关键。研究发现敲除RAC0-1的细胞增殖明显减慢，同时，AP-1通路中增殖相关蛋白cdc2、cyclinDl和hb_egf的表达明显减弱。更重要的是过表达RAC0-1可促进小鼠消化道肿瘤的形成。另外，RAC0-1对其他肿瘤信号通路如Wnt和Ras信号通路也存在重要的调控作用。我们的研究已经证实RAC0-1通过调控上皮细胞间质转化而促进肝癌的侵袭转移，通过抗肝癌人源性RAC0-1单克隆抗体可以在体内外显著抑制肝癌的侵袭转移，有望成为临床治疗肝癌的重要药物，从而推动肝癌治疗水平的提高。
[0051]应用本发明的技术方案，将RAC0-1单克隆抗体用于制备肝癌的药物，RAC0-1单克隆抗体能够特异性的抑制RAC0-1在人体内的表达水平，从而有效的降低肝癌侵袭转移能力，提高肝癌患者的五年生存率。RAC0-1单克隆抗体采用的是人源RAC0-1单克隆抗体，其具有特异性好、亲和力高、免疫原性小、副作用低等诸多优点。
[0052]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，包括药物有效量的RACO-1单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述RAC0-1单克隆抗体为人源RAC0-1单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述人源RAC0-1单克隆抗体通过以下步骤制备得到: 1)提取原发性肝细胞癌患者外周血淋巴细胞总RNA，通过逆转录PCR法克隆RAC0-1DNA ； 2)采用所述RAC0-1DNA进行噬菌体抗体库构建； 3)筛选所述噬菌体抗体库得到目的细菌； 4)提取所述目的细菌中的质粒DNA，切除所述质粒DNA中的噬菌体外壳蛋白III基因，将剩余部分的所述质粒DNA进行表达、纯化得到所述人源RAC0-1单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述克隆RAC0-1DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:1 ;下游引物的序列如SEQ ID NO:2。
5.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述克隆RAC0-1DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO: 3 ;下游引物的序列如SEQ ID NO:4。
6.RAC0-1单克隆抗体在制备治疗肝癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述RAC0-1单克隆抗体为人源RAC0-1单克隆抗体。
8.RAC0-1单克隆抗体在体外抑制肝癌细胞中的应用，其特征在于，将所述RAC0-1单克隆抗体以有效抑制浓度与所述肝癌细胞接触。
【文档编号】C12N15/70GK103520718SQ201310439418
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】徐江锋, 刘细玉 申请人:浙江大学医学院附属义乌医院