高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法，包括：构建表达HttQ蛋白的植物表达载体；利用所述植物表达载体转化植物细胞，获得含有HttQ基因的植物细胞。本发明所述方法制备的植物细胞模型，具有高通量筛选特性、操作简单、成本低、且筛选有效，弥补了原核生物、单细胞真核生物以及哺乳动物细胞模型的不足。与人工合成的polyQ多肽相比较，可大大降低其筛选成本。
【专利说明】高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法及其应用。
【背景技术】
[0002]亨廷顿病(Huntington’s Disease, HD)是一种人类常染色体显性遗传的神经退行性疾病，主要发生在中老年人群，患者的行为能力和认知水平障碍。该疾病的发生，不仅给患者带来身心的痛苦，导致患者的死亡，而且给患者的家庭带来巨大的经济负担。随着老龄化社会的到来，患亨廷顿疾病的老年人群的比例也在增大，因此干预、缓解亨廷顿疾病的发生及发展，有着十分重要的意义。
[0003]现已查明，亨廷顿病是由HD基因突变，即HD基因第一外显子中CAG重复序列异常扩增，其表达产物一亨廷顿蛋白(huntingtin, HttQ)氨基端的多聚谷氨酰胺(PolyQ)异常延伸导致的。正常情况下 ，人表达的正常的HttQ蛋白含PolyQ的长度少于35个谷氨酰胺，正常的HttQ蛋白可弥散分布在神经元胞质内，并不引起人的发病。然而，在患者体内表达的异常HttQ蛋白的PolyQ长度超出一定阈值，即> 35，其表达产物(HttQ蛋白)发生异常聚集，进而对神经细胞产生毒性而使患者发病。在HD患者和HD动物模型的脑组织(或神经元)内，突变的HttQ蛋白聚集形成了淀粉样斑块或形成包涵体。可见，HttQ蛋白中的PolyQ长度与患者发病年龄相关。PolyQ在正常人群中短于35个，在HD患者中突变Htt的PolyQ长度超过36个。在HD成年患者中约为40~50个，老年患者中则> 55个。
[0004]亨廷顿病的发生与亨廷顿蛋白(HttQ)内的多聚谷氨酰胺(PolyQ)长度、多肽的构象变化(形成β -片层)、形成的多聚体及其在神经元内形成的淀粉样斑块沉淀直接相关。亨廷顿蛋白(HttQ)内多聚谷氨酰胺(PolyQ)长度变化是引起亨廷顿疾病发病的重要因素之一。因此，以HttQ为靶点，获得具有抗HttQ蛋白聚集的活性物质及先导性药物，对预防和干预亨廷顿疾病的发生及发展有重要意义。
[0005]从大量天然产物或化合物文库中获得抗HttQ蛋白聚集的活性物质通常采用以下几种模型，如体外模型、Ε.coli模型、酵母模型、哺乳动物细胞模型及果蝇、线虫和哺乳动物模型等。在实践中，这些模型显示出各自的优点和不足。
[0006]如，利用HttQ蛋白的体外聚集模型可以筛选出抗HttQ蛋白聚集的活性分子。Heiser V等利用聚集的HttQ51蛋白不溶于SDS的特性，采用自动滤过阻滞系统对数万种化合物文库进行初筛，从中获得了一些可减缓HttQ51聚集的化合物或天然产物。进一步的实验发现，体外实验表现活性的部分化合物在细胞模型中未表现出抗HttQ51聚集的作用，有的化合物甚至表现出细胞毒性。可见，利用体外模型筛选出可直接抗HttQ蛋白聚集的活性物质，还需在细胞模型或动物模型上进行进一步的活性鉴定。应当指出的是，要获得大量商品HttQ蛋白，需花费高昂的费用；即使可以通过体外表达HttQ蛋白，也需要重组菌发酵、蛋白质诱导表达及冗长的纯化工作，工作量大，所涉及的费用高。[0007]利用细胞模型筛选抗HttQ蛋白聚集的先导药物，成为首选的模型。近年来，一些科学家利用大肠杆菌繁殖能力高、繁殖周期短、遗传操作简单的特征，构建了 EGFP-HttQ蛋白表达、聚集的大肠杆菌模型，利用EGFP-HttQ融合蛋白的绿色荧光，高通量的筛选抗HttQ蛋白聚集的先导性化合物。由于导入的HttQ蛋白含的polyQ长度大于35，表达的HttQ蛋白在大肠杆菌内发生聚集，且重组菌的生长受到抑制。如Invernizzi G等利用E.coli模型模拟出ataxin-3 (HttQ蛋白的短肽)聚集,检测到ataxin_3短肽的表达对大肠杆菌重组子的生长有抑制作用，由此提出了 ataxin-3短肽或HttQ聚集过程中产生的可溶性低聚物可对细胞产生毒性或有生长抑制作用。然而，尚未见到利用这种模型筛选抗HttQ蛋白聚集的活性物质筛选的报告。酵母细胞为单细胞真核生物，具有与真核生物类似的转录调控机制，可较好的模拟HttQ蛋白在细胞中的聚集。Zhang X等将带有报告基因的HttQ103_EGFP转化酵母，并诱导该基因表达，表达后的HttQ103-EGFP蛋白在酵母细胞内发生了聚集。他们来利用酵母重组细胞模型从含有16000种化合物的化合物库中高通量筛选出了可减缓HttQ103聚集的四种先导化合物(Cl - C4)，进一步通过ThT体外实验及果蝇模型验证了化合物C2的同系物C2-8具有很好的抑制HttQ蛋白聚集的作用。哺乳动物细胞属高等生物的细胞。Zhang H等在用哺乳动物细胞进行的活性研究中，发现黄芪多糖在C0S-7细胞模型中具有明显的多聚谷氨酰胺(polyQ)聚集抑制活性。由此可见，利用ThT体外模型和细胞模型筛选和研究抗HttQ蛋白聚集的活性物质，成为科学家常常采用的策略。但，哺乳动物细胞模型进行抗亨廷顿疾病的研究，成本较高，不能用于高通量活性物质的筛选。
[0008]果蝇和线虫是一种多细胞模式动物。将导致亨廷顿疾病基因(HttQ基因)转入果蝇，以构建的转基因果蝇模型也可用于筛选干预亨廷顿疾病发生的活性物质。如Kazantsev等通过构建果蝇模型，以此筛选出了可减缓HttQ蛋白聚集的活性的Sup3蛋白。我国学者黄泽波等也利用表达EGFP-HttQ102绿色荧光蛋白的秀丽线虫，筛选出了可间接抑制HttQ150蛋白聚集的黄芪多糖PS5。小鼠有着与人类高度同源的生物学特性。通过转基因技术获得患亨廷顿疾病的小鼠品系。通过对其药物喂养，观察转基因鼠的行为学、解剖学和生物学特性，筛选出干预小鼠亨廷顿疾病发生的药物。Southwell AL等通过转基因鼠模型，证明了HttQ蛋白的表达在2型亨廷顿舞蹈症发病中起到了关键的作用，由此提出干预HttQ蛋白聚集可作为干预和治疗亨廷顿疾`病的祀点。Venkatraman P等证实雷帕霉素能减少细胞中PolyQ蛋白的聚集，并且减轻HD小鼠模型中的神经毒性。可见，模式动物模型、特别是哺乳动物模型中是研究药理、药效的理想模型。如在小鼠体内证明活性物质对亨廷顿疾病的干预和抑制作用，则可为先导药物临床试验打下重要基础。然而，在哺乳动物模型上进行实验需要的实验周期长，培养动物需要较多的人力、物力和实验条件，最重要的一点是，整体动物模型不适合于活性化合物的高通量筛选。
[0009]到目前为止，还未见将人亨廷顿疾病相关蛋白基因(HttQ基因)转入植物细胞中的?艮告。
【发明内容】
[0010]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法。
[0011]一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法，包括:[0012]构建表达HttQ蛋白的植物表达载体；
[0013]利用所述植物表达载体转化植物细胞，获得含有HttQ基因的植物细胞。
[0014]所述高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法,进一步还包括:转基因植物细胞筛选。
[0015]所述植物表达载体通过农杆菌侵染转化植物细胞。
[0016]适于本发明转染的农杆菌包括但不限于，例如:根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105.GV3101 等。
[0017]本发明首次提出构建亨廷顿疾病蛋白(HttQ蛋白)的植物细胞模型，即利用DNA重组技术，构建EGFP-HttQ23和EGFP_HttQ52表达载体。通过农杆菌浸染法，将上述融合蛋白基因转化烟草悬浮细胞(BY-2)。在激光共聚焦显微镜(confocal)观察，可知显示绿色荧光的EGFP-HttQ23和EGFP_HttQ52蛋白在BY-2细胞中表达。其中，EGFP_HttQ23融合蛋白在转基因烟草悬浮细胞的细胞质内均匀分布，而EGFP-HttQ52蛋白在转基因烟草悬浮细胞的细胞质中形成聚集呈点状分布。经统计，EGFP-HttQ52蛋白在转基因植物细胞中的聚集率为100%。与含EGFP-HttQ23重组细胞相比，转EGFP_HttQ52基因的植物细胞生长速率要缓慢，表明在转基因植物细胞中EGFP-HttQ52蛋白的表达及聚集对宿主细胞的生长明显的抑制。
[0018]利用24-孔板培养法，将转EGFP_HttQ52基因的植物细胞在24-孔板进行培养，并将不同浓度的HttQ蛋白聚集抑制剂(EGCG，茶多酚)加入转基因烟草细胞的培养基中。经过一定时间的培养，将24-孔板中的样品取出测量其密实体积，可见在培养基中加入EGCG的转EGFP-HttQ52基因烟草细 胞生长缓慢现象得到明显的恢复。其中，加入200uM、300uM和500uM EGCG的转基因烟草细胞的生长恢复达显著性差异。
[0019]本发明的第二个目的在于提供一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型。
[0020]一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型，所述植物细胞含有表达HttQ蛋白的植物表达载体。
[0021]所述植物表达载体为PCAMBIA1302-EGFP-HttQ。
[0022]适用于本发明的植物表达载体包括但不限于双元农杆菌表达载体、可用于植物微弹轰击的载体等。
[0023]使用EGFP-HttQ构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin);或加入任何一种诱导型启动子，如拟南芥rd29A启动子和葡萄白藜芦醇合酶基因Vstl启动子；上述启动子可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0024]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
[0025]本发明的第三个目的在于提供一种植物细胞模型的应用。
[0026]抗亨廷顿疾病活性物质的筛选方法，包括:
[0027]培养含有HttQ基因的植物悬浮细胞；
[0028]将待筛选的活性物质加入含有上述植物悬浮细胞的培养基中；
[0029]检测植物悬浮细胞的密实体积；
[0030]判断抗HttQ蛋白聚集的活性物质。
[0031]所述活性物质为化合物或天然产物，或馏分等。
[0032]本发明以构建的表达EGFP_HttQ52融合蛋白的烟草悬浮细胞模型，将其在24-孔板上进行培养，将待筛选的化合物、或天然产物配置成适当的浓度加入培养基中，培养一段时间后检测24-孔板每个井中的烟草悬浮细胞的体积；以加入EGCG样品的为阳性对照，可用于高通量筛选抗HttQ蛋白聚集的活性物质及先导化合物，如图1所示。
[0033]本发明所述植物细胞模型具有高通量筛选特性、操作简单、成本低、且筛选有效，弥补了原核生物、单细胞真核生物以及哺乳动物细胞模型的不足。与人工合成的polyQ多肽相比较，可大大降低其筛选成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1用表达EGFP_HttQ52融合蛋白的烟草悬浮细胞模型高通量筛选抗HttQ蛋白聚集的活性物质结果示意图，化合物1，2，3代表待筛选的不同的化合物，每行为同一种化合物，每种化合物用不同浓度进行筛选，浓度I和浓度2分别代表两种不同的浓度；
[0035]图2重组质粒PCAMBIA1302-EGFP-HttQ23/52的酶切位点示意图，其中TL、TR分别为载体的左、右边界，T为载体的终止序列，35S为CaMV35S启动子；
[0036]图3转EGFP-HttQ基因细胞的RNA提取电泳图，T1、T2、T3为EGFP_HttQ23的三个细胞团，τ’ 1、T’ 2、Τ’ 3为EGFP-HttQ52三个的细胞团；
[0037]图4BY-2的内参基因Actin9及目的基因HttQ23、HttQ52的RT-PCR结果电泳图，Tl、T2、T3 为 EGFP-HttQ23 三个细胞团，T’ 1、T’ 2、T’ 3 为 EGFP_HttQ52 三个细胞团；
[0038]图5在转基因烟草悬浮细胞中表达的EGFP-HttQ23/EGFP-HttQ52融合蛋白的分布图，注:标尺为20 μ m ；
[0039]图6转EGFP-HttQ23和EGFP_HttQ52基因细胞在24孔板内的生长变化图；
[0040]图7A利用24-孔板培养法，加入不同浓度的EGCG对转EGFP_HttQ52基因细胞生长的影响；
[0041]图7B是加入不同浓度的EGCG对表达EGFP_HttQ52蛋白的聚集的影响；
[0042]图7C加入300 μ M EGCG后，EGFP_HttQ52融合蛋白的分布情况；
[0043]注:图7A 至图 7C 中标尺为 20 μ m，* 为 ρ〈0.05，# 为 ρ〈0.01。
【具体实施方式】
[0044]以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0045]本发明用到的实验材料:
[0046]大肠杆菌菌株Τ0Ρ10，根癌农杆菌LBA4404，烟草悬浮细胞(Nicotianatabacumcv.bright yellow-2, BY-2),大肠杆菌重组质粒 pGEX_5X/HttQ23/52、PCAMBIA1302-EGFP。
[0047]pGEX-5X/HttQ23/52质粒构建方法如下:将HttQ23和HttQ52基因进行BamH I和EcoR I双酶切后，连接至经同样双酶切的PGEX-5X-1载体中，转化大肠杆菌，获得pGEX_5X/HttQ23/52 质粒，pGEX-5X-l 购自 GE Healthcare 公司。
[0048]HttQ23基因序列如SEQ ID NO:1所示，具体为:
[0049]
ggatccatgg cgaccctgga aaagctgatg aaggccttcg agtccctcaa gtcctcccag 60
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120
cagcagccgc caccgccgcc gccgccgccg ccgcctcctc agcttcctca gccgccgccg 180
caggcacagc cgctgctacc tcagccgcag ccgcccccgc cgccgccccc gccgccaccc 240
[0050]
ggcccggctg tggctgagga gccgctgcac cgaccgtgag aattc285
[0051]HttQ52基因序列如SEQ ID NO:2所示，具体为:
[0052]
ggatccatgg cgaccctgga aaagctgatg aaggccttcg agtccctcaa gtcctcccag 60
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 120
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180
cagcagcagc` agcagcagca gcagcagcaa cagccgccac cgccgccgcc gccgccgccg 240
cctcctcagc ttcctcagcc gccgccgcag gcacagccgc tgctacctca gccgcagccg 300
cccccgccgc cgcccccgcc gccacccggc ccggctgtgg ctgaggagcc gctgcaccga 360
ccgtgagaat tc372
[0053]pCAMBIA1302-EGFP质粒构建方法如下:以质粒pEGFP-Cl为模板，以EGFP_F(5’-CCATGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’)和 EGFP-R(5，-GGTCACCTCAAGATCTCTTGTACAGCTCGTCCA-3’)为引物，利用PCR方法扩增EGFP基因片段。切胶并纯化基因片段，经Nco I和BstP I酶切后，连接至经相同双酶切的PCAMBIA1302载体。转化大肠杆菌，获得pCAMBIA1302_EGFP质粒。
[0054]EGFP基因序列如SEQ ID NO:3所示，具体为:
[0055]
【权利要求】
1.一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法，包括: 构建表达HttQ蛋白的植物表达载体； 利用所述植物表达载体转化植物细胞，获得含有HttQ基因的植物细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法，进一步还包括:转基因植物细胞筛选。
3.根据权利要求1所述的一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法，其特征在于:所述植物表达载体通过农杆菌侵染转化植物细胞。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型的建立方法，其特征在于:所述表达HttQ蛋白的植物表达载体为pCAMBIA1302-EGFP-HttQo
5.一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型，其特征在于，所述植物细胞含有表达HttQ蛋白的植物表达载体。
6.根据权利要求5所述的一种高通量筛选抗亨廷顿疾病活性物质的植物细胞模型，其特征在于:所述植物表达载体为pCAMBIA1302-EGFP-HttQ。
7.权利要求1-4任意一项所述方法建立的植物细胞模型在筛选抗亨廷顿疾病活性物质中的应用。
8.权利要求5-6任意一项所述细胞模型在筛选抗亨廷顿疾病活性物质中的应用。
9.抗亨廷顿疾病活性物`质的筛选方法，包括: 培养含有HttQ基因的植物悬浮细胞； 将待筛选的活性物质加入含有上述植物悬浮细胞的培养基中； 检测植物悬浮细胞的密实体积； 判断抗HttQ蛋白聚集的活性物质。
10.根据权利要求9所述的抗亨廷顿疾病活性物质的筛选方法，其特征在于:所述活性物质为化合物或天然产物。
【文档编号】C12N15/82GK103525858SQ201310454085
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】郑易之, 刘国宝, 胡跃明, 刘昀 申请人:深圳大学