一种水稻的甜菜碱醛脱氢酶2香味基因、分子标记的引物及筛选方法
【专利摘要】本发明公开了能够使稻米呈现出淡香型特性的新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，与非香水稻“日本晴”比较，其突变位点不位于编码链上，是属于编码链上游突变类型的甜菜碱醛脱氢酶2基因。在编码链起始密码子的第一个核苷酸上游-81位点处缺失了3个核苷酸，同时在-1314处插入了8个核苷酸。将这个基因通过杂交转入非香水稻并获得纯合后代即可培育出新的淡香型的水稻新品种。本发明还公开了筛选具有这种淡香型特性基因水稻的方法及分子标记引物。本发明为培育淡香型水稻提供了新的基因，也可辅助选择含有淡香味基因的植株，有利于提高选择效果，还能对育种过程后期形成的自交后代淡香味基因是否呈纯合状态进行鉴定，从而快速有效地实现育种目标。
【专利说明】一种水稻的甜菜碱醛脱氢酶2香味基因、分子标记的引物及筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学和植物育种领域，具体为一个新的水稻香型等位基因，以及利用这个新的等位基因，采用分子标记筛选方法辅助常规育种快速选育新的淡香型水稻。
【背景技术】
[0002]香型稻米价格总体上都比非香型稻米高出许多，使其在国际稻米贸易中占有特别重要的地位。随着人们生活水平的提高，目前市场对香米需求量日益增加，由此也促进了香型水稻的遗传和育种研究。
[0003]香米在蒸煮中会产生特别的香气因而受到大多消费者的青睐。然而，对于香米具有的香味程度，不同人的接受度并不相同。有人喜欢浓香型稻米，也有人喜爱淡香型稻米。目前市场提供的香米商品主要是浓香类型的。对于淡香型香米商品可以通过分别取一定量的浓香型香米和非香米混合配制获得。
[0004]有报道显示，水稻香味与一种香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(简称2-AP)密切相关(Buttery 等，J Agric Food Chem, 1983, 31:823-826 ;Widjaja等，Journal of the Scienceof Food and Agriculture, 1996，70 (2): 151-161 )。在稻米中，2-AP 含量高,稻米香味就浓郁，2-AP含量相对较低，稻米香味就淡些。
[0005]尽管过去人们对于稻米香味遗传研究结果存在分歧，但多数学者认为稻米香味是由隐性主基因控制的(闵绍揩，申宗坦，熊振民，等.水稻育种学.北京:中国农业出版社，1996.322-353)，并位于第8 号染色体上(Aha等，Theor Appl Genet, 1992, 84:825-828 ；Garland 等，Theor Appl Genet, 2000, 101:364-71 Jin 等，Plant Sci, 2003, 165:359-64 ；Cordeiro 等,Mo I Breeding, 2002, 9 (4):245-250 ；Chen 等，Plant Sci, 2006, 171:505-14)。
[0006]Bradbury 等(Bradbury 等，Plant Biotechnology Journal, 2005, 3(3):363-370)最先报道，甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)与水稻香味直接相关，该基因位于水稻8号染色体上，包含了 15个外显子和14个内含子，其第七外显子8个碱基的缺失和3个核苷酸的多态性(badh2-E7)导致BADH2原有的功能丧失，使其具有香味的作用底物2-AP的代谢途径中断,2-AP不断积累使水稻变香。这个设想通过Badh2基因的互补试验(Chen等,Plant cell,2008，20 (7): 1850-1861)和 Badh2 基因 RNAi 试验(Niu 等，BMC Plant Biol, 2008; 8:1-10.)得到了验证。
[0007]继badh2_E7报道之后，人们对发现新的甜菜碱醛脱氢酶2基因的等位基因投入了很大的关注，并陆续发表了相关报道。Shi等(Shi等，Mol Breed, 2008, 22 (2): 185-192)发现甜菜碱醛脱氢酶2基因的等位基因是在第二外显子上有7个连续核苷酸的缺失(badh2_E2)。Amarawathi Y 等(Amarawathi Y 等,Mol Breed, 2008, 21 (I):49_65)发现在第七外显子上与badh2_E7突变一致以外,还在第八外显子存在7个核苷酸的插入。Kovach等(Kovach等，PNAS，2009, 106:14444 - 14449)报道了在甜菜碱醛脱氢酶2基因其它外显子上存在的插入突变或缺失突变或单核苷酸多态性(SNP, Single-nucleotide polymorphism)变化的 8 个等位基因。Shao 等(Shao 等,Plant Breeding, 2011, 130:172-176)发现了一种新的甜菜碱醛脱氢酶2基因缺失突变，在第4和第5外显子之间出现803bp的缺失。
[0008]新的甜菜碱醛脱氢酶2基因等位基因的发现能够为香稻育种提供重要的基因资源。虽然目前人们已发现甜菜碱醛脱氢酶2基因有突变的等位基因有12个，但分析它们的突变位点都是存在于编码链上，因此都属于编码链突变类型。
[0009]Lee等(Lee等，Crop sci, 1989，29:1067-1071)报道认为，玉米不同单交种之间的RFLP遗传距离与Fl杂种优势表现存在极显著正相关。张培江等(张培江等，杂交水稻，2001,16 (5):50-54)的研究结果显示，当两个亲本遗传距离较远时，其杂交水稻后代能够表现出更大的杂交优势。也就是说，亲本之间基因差异大，杂交产生的后代的优势也会较强。因此，从水稻杂种优势角度分析，需要发现更多甜菜碱醛脱氢酶2基因突变位点具有与现已报道不同的等位基因类型。
[0010]基因基本结构包括启动子、转录区和终止子。尽管决定基因功能的遗传信息储存在位于转录区的编码链中，但启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因转录区的5'端上游。而且在启动子上还存在调控基因表达的重要顺式作用元件。因此，启动子对于控制其下游包含编码链的转录区转录具有非常重要的作用。在转录区中介于转录起始位点至编码蛋白质翻译的起始密码子之间是一段5'非翻译区，即5' UTR0有报道显示，5' UTR高度结构化对mRNA的翻译起始进行调控，既具有介导内部翻译起始的功能，也含有内部核糖体进入的位点(IRES) (Cullen, Mol Cell Biol，2000，20:4181-4187)。因此，在基因蛋白质翻译起始密码子的上游序列对该基因的表达具有重要的调控作用。在人们对于基因功能研究中，需要通过人为诱变的方式获得编码序列有突变的突变体。同样，如果能够得到编码区上游序列，包括启动子序列和5/ UTR序列有改变的突变体，对于基因表达的调控研究也是非常有价值的。目前还未见关于甜菜碱醛脱氢酶2基因在编码区上游序列有突变方面的研究报 道。
【发明内容】
[0011]本发明的目的提供一种新的能使稻米呈现淡香型的香味基因，以及提供一种鉴定该香味基因的方法。
[0012]本发明的目的还提供一种简便筛选该香味基因分子标记的引物，并使用分子标记辅助，快速进行淡香型水稻育种的方法。
[0013]这种新的淡香型香味基因是一种甜菜碱醛脱氢酶2基因，在启动子区域和5' UTR区域都发生突变，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处，即5' UTR区域有3bp缺失，在上游-1314处，即启动子区域具有8bp插入突变的水稻新的甜菜碱醛脱氢酶2基因，缺失的序列为gtc,插入的序列为5’ -aaatctag-3’。
[0014]优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的启动子和5' UTR区域包含如SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。更优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的启动子和5' UTR区域如SEQ ID N0.1所示。(根据Genbank登录号AP004463.2中显示的信息判断，甜菜碱醛脱氢酶2基因的5' UTR区长度为147个核苷酸，再向5'上游的序列即为启动子序列。)
[0015]优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因包括SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。更优选的，这种突变型甜菜碱醛脱氢酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0016]我们实验室曾对本校董彦君教授惠赠的“上师香2号”香型水稻
[0017](http://cms.shnu.edu.cn/Default.aspx?tabid=10725&ctl=Details&mid=2755l&Iteml D=99943&SkinSrc=%5BL%5DSkins/zzl_l 106/zzl_l 106&language=zh_CN)的甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链进行分析，结果很意外地发现，该水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因的编码链与非香水稻完全相同。
[0018]进一步研究后发现，在“上师香2号”香型水稻的甜菜碱醛脱氢酶2基因中，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81位点处，即5' UTR区域缺失了 3个核苷酸，同时在-1314处，即启动子区域又插入了 8个核苷酸。又进一步分析“上师香2号”香型水稻选育中的香型亲本“南海 138” 水稻(Yamashita, 1999, Sogo Nogyo no Shingi jutsul2:16 - 20)的甜菜碱醛脱氢酶2基因，结果与“上师香2号”香型水稻完全相同。这个新的甜菜碱醛脱氢酶2基因被我们定名为badh2-p-5' UTR0
[0019]我们曾选取了第二外显子突变类型(badh2_E2)、第七外显子突变类型(badh2-E7)、编码链上游突变类型的3种香稻和非香稻，共4个水稻品种为材料，分析了它们在不同发育阶段(从开花后第3天起开始取样，随后每隔3天取一次样，一直到开花后30天)幼嫩种子中甜菜碱醛脱氢酶2基因的mRNA表达量，结果显示，非香稻甜菜碱醛脱氢酶2基因的mRNA表达量最高，2种类型编码链有突变的香稻mRNA表达量都非常低，含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因，即甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香稻mRNA表达量介于非香稻和编码链有突变类型的香稻之间(图2)。这表明含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因的水稻稻米属于淡香型香稻。以分别含有突变发生在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链第二外显子的香稻、突变发生在甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游的香稻、正常甜菜碱醛脱氢酶2基因的非香稻的成熟种子为材料，分析了它们各自的2-AP含量，结果也表明，含有新的甜菜碱醛脱氢酶2等位基因，即甜菜碱醛脱氢酶2基因编码链上游有突变的香稻成熟种子2-AP含量也基本介于非香稻和编码链有突变类型的香稻之间(表1)。
[0020]表1不同水稻成熟种子2AP含量检测
【权利要求】
1.一种水稻香味基因，其特征在于，是甜菜碱醛脱氢酶2基因，在编码链起始密码子第一个核苷酸上游-81处有3bp缺失，在上游-1314处具有8bp插入突变的水稻新的甜菜碱醒脱氢酶2基因,缺失的序列为gtc,插入的序列为aaatctag。
2.权利要求1所述水稻香味基因，其特征在于，其编码链起始密码子第一个核苷酸上游区域包含如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述水稻香味基因，其特征在于，其核苷酸序列包括如SEQID N0.2所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述水稻香味基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
5.一组筛选香型水稻分子标记的引物，其特征在于，所述引物用于鉴定筛选含有权利要求I~4任一项所述香味基因的水稻，上游和下游的引物序列分别含有如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
SEQ ID N0.3 5’-ATAATATCGGTCGAAACATTTTTATT-3’
SEQ ID N0.4 5’ -GAGAAGCTTTTACACTTTATGCACATC-3’。
6.权利要求5所述筛选香型水稻分子标记的引物，其特征在于，上游和下游的引物序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
7.一种筛选香型水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取水稻总DNA为 模板，用权利要求5或6所述的引物进行扩增； (2)将PCR产物进行凝胶电泳检测； 如模板总DNA由纯合非香型水稻提取，扩增产物只有198bp条带； 如模板总DNA由纯合香型水稻提取，扩增产物只有206bp条带； 如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交后代的杂合子水稻提取，同时具有198bp条带和206bp条带扩增产物； 如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代水稻提取，只有198bp条带的为无香味基因纯合植株；同时具有198bp和206bp条带的为香味基因杂合类型植株； 如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代水稻提取，只有206bp条带的为香味基因纯合植株；只有198bp条带的为非香味基因纯合植株； 同时具有206bp和198bp条带的为香味基因杂合类型植株； 所述的香型水稻含有权利要求1~5任一项所述香味基因。
8.权利要求7所述筛选香型水稻的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为:93°C~950C预变性5分钟；93°C~95°C变性45秒，52°C退火45秒，71 °C~73°C延伸30秒，共32~35个循环；最后71°C~73°C延伸8~12分钟。
【文档编号】C12N15/53GK103525840SQ201310476131
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】李建粤, 时亚琼, 王俊峰, 窦兰兰, 黄菊 申请人:上海师范大学