茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用的制作方法

茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其中茜草多糖可以为市售产品或者 申请人:制备的产品，茜草多糖更优选的可以为茜草酸性多糖，本发明还公开了该茜草酸性多糖的制备方法，该方法制备获得的茜草酸性多糖具有多糖含量高、杂质少和均一性良好特点，且该制备方法简单高效，适合工业化生产；本发明中的茜草多糖经体外聚集模型、哺乳动物细胞和秀丽线虫疾病模型试验证实，能够有效抑制多聚谷氨酰胺和β-淀粉样蛋白的异常聚集及其神经毒性，还能显著降低疾病模型的活性氧自由基水平，表明其对神经退行性疾病具有良好的防治作用。
【专利说明】茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用【技术领域】
[0001]本发明属于健康食品/保健食品【技术领域】，具体涉及茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用。
技术背景
[0002]神经退行性疾病是一类以特定神经细胞和组织逐渐衰退乃至死亡为主要特征的进行性疾病，包括阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏综合症等。随着全球人口老龄化趋势的加剧，神经退行性疾病已经成为严重危害人类生命健康和生活质量的重大疾病，并引起了世界各国的高度重视，尽管已有减轻患者症状的药物上市，但这些药物缺乏对疾病前期发生和发展的关注。因此，积极开发健康食品/保健食品以针对神经退行性疾病进行预防和治疗无疑具有重大的民生意义。
[0003]目前已知的多种神经退行性疾病都涉及到蛋白质的异常聚集，例如，阿尔茨海默症的主要病理特征表现为细胞外的β -淀粉样蛋白(amyloidP protein;A0 )沉淀和神经元内过度磷酸化tau蛋白形成的聚集体，亨廷顿舞蹈病的主要病理特征表现为细胞内由多聚谷氨酰胺(polyglutamine;polyQ)异常延伸引起的亨廷顿蛋白包涵体。这些蛋白质异常聚集形成的产物将诱发氧化、炎症等多种胁迫反应，导致神经元损伤并产生神经退行性病变。因此，通过抑制疾病蛋白质异常聚集以及缓解由异聚蛋白引起的毒性胁迫损伤是防治神经退行性病症的重要研究策略。
[0004]传统中医在神经相关疾病的防治方面已有大量研究和实践，而且丰富的中药材种类为之提供了庞大的药用和保健资源库。其中茜草是我国传统用于止血凉血和活血化瘀的中药，始载于《神农本草经》，应用历史悠久，具有凉血止血、活血化瘀、止咳祛痰等功效，可用于治疗血热咯血、经闭瘀阻、跌打损伤和风湿痹痛等病症，具有显著的药用保健价值。现代研究表明，中草药来源多糖不仅资源丰富、作用安全，而且具有多种生物活性，在保健领域具有巨大的开发和应用 潜力。然而，目前中药多糖的制备工艺较为粗放，存在多糖含量低、小分子和蛋白质等杂质多、负电性和分子量分布不均一等问题，而且对其活性功能的开发大多集中在免疫调节、抗肿瘤和抗氧化方面，神经保护有关研究尚未深入，相应开发利用极少。比如有研究表明茜草多糖具有抗氧化、抗辐射等多种作用，但是其在神经退行性疾病领域中的研究和应用尚未见报道，而且其制备工艺仍有待改进。因此，加强开发具有神经保护功效的中药多糖将为神经相关疾病的防治提供新的方向，并能推动多糖在医药保健领域的深入应用。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品(健康食品或功能食品，保健食品在欧美国豕被称为健康食品，在日本被称为功能食品)中的应用。[0006]其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏综合症在内的以蛋白质异常聚集、特定神经细胞和组织逐渐衰退死亡为主要病理特征的神经系统疾病。
[0007]本发明中所述的茜草多糖可以为市售产品，也可以是采用常规方法制备获得的茜草多糖。
[0008]本发明中所述的茜草多糖优选为茜草酸性多糖。
[0009]本发明中所述的茜草酸性多糖优选通过以下方法制备获得:以茜草为原料，经含脱脂、水提、酶解、醇沉、离子交换和透析工序制备获得茜草酸性多糖，所述茜草酸性多糖具有神经保护作用，能制备具有防治神经退行性疾病的保健食品。
[0010]在茜草酸性多糖的制备过程中，各工序的具体参数如下:
[0011]脱脂时，采用乙醇为脱脂溶剂，茜草和乙醇的质量体积比为1:2?1:20，脱脂温度为50?90°C，时间为I?IOh ;水提时，茜草和水的质量体积比为1:2?1:20，提取温度为50?100°C，水提取时间为I?10h。
[0012]酶解时，采用的酶为木瓜蛋白酶、胰酶、果胶酶或中性蛋白酶，酶解的作用是除去茜草的药用部位根或根茎中的蛋白质，酶解时酶的质量体积百分含量为0.5?5.0%，pH为
2.0?8.0，温度为30?60°C，时间为0.5?5h ;醇沉时，采用乙醇沉淀酶解液获得茜草酸性粗多糖，乙醇和酶解液的体积比为3:1?5:1。
[0013]离子交换包括阳离子交换和阴离子交换，首先进行阳离子交换，将醇沉获得的茜草酸性粗多糖，进行阳离子交换，水洗脱后，洗脱液经透析袋透析获得透析液，将透析液进行阴离子交换，依次采用水和洗脱液洗脱后，过透析袋透析，透析液经浓缩和干燥处理，获得茜草酸性多糖。
[0014]所述阳离子交换和阴离子交换的材料为纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或树脂；透析袋的截留分子量为1.0?5.0kD。
[0015]阴离子交换时，洗脱液为醋酸盐、磷酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、铵盐或甘氨酸，其浓度为0.1?2.0moI/LO
[0016]本发明中所述茜草优选是指茜草的药用部位根或根茎。
[0017]采用本发明上述方法制备获得的茜草酸性多糖，多糖含量高，杂质含量低，负电性和分子量分布均一，具有良好的神经保护作用。
[0018]采用本发明上述方法制备的茜草酸性多糖的多糖得率在1.0%?5.0%，单糖组分分析显示该多糖含有糖醛酸，表明其为电负性的酸性多糖，苯酚硫酸法测定多糖含量大于70%，淀粉碘试验表明不含淀粉成分，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量小于5%，Sepharose6凝胶层析显示仅有一个酸性多糖组分峰，表明分子量较为均一。
[0019]本发明提供的茜草酸性多糖具有神经保护作用是指其能够在体外、细胞和整体动物水平上抑制多聚谷氨酰胺和β-淀粉样蛋白的聚集及聚集毒性并能降低氧化胁迫损伤，从而可用于防治包括阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏综合症等在内的以蛋白质异常聚集、特定神经细胞和组织逐渐衰退死亡为主要病理特征的神经系统疾病。
[0020]本发明提供的茜草酸性多糖用途还包括在制备具有神经保护功效的健康食品或保健食品中的应用。将上述茜草酸性多糖添加其它原料如乳清蛋白、辅料如麦芽糊精，可制备成为具有神经保护功效的健康食品或保健食品。[0021]本发明具有如下优点:
[0022](I)本发明制备的茜草酸性多糖具有多糖含量高、杂质少、均一性良好优点，制备工艺简单完善，稳定高效，解决了茜草多糖提取工艺粗放、质量较差的问题，适合工业化生产；
[0023](2)本发明制备的茜草酸性多糖在体外、细胞和整体动物水平上对神经退行性疾病相关的蛋白质异常聚集及由此诱发的神经毒性均有抑制作用，表明其可应用于具有神经保护功效的固液制剂健康食品或保健食品中，为中药现代化和多糖产品深入应用提供了新方向，也可为延缓衰老和防治神经退行性疾病做出贡献。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]下面通过【具体实施方式】及药效学研究结果对本发明作进一步说明。
[0025]图1为实施例6中茜草多糖抑制神经退行性疾病相关蛋白质体外聚集的数据表征图，其中图1A表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖抑制Αβ42的体外聚集，图1B表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖抑制polyQ40的体外聚集；
[0026]图2为实施例7中茜草多糖分别抑制Αβ42、3_硝基丙酸和百草枯细胞毒性的数据表征图，其中图2Α表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖缓解A β 42对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的细胞毒性，图2Β表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖缓解3-硝基丙酸对SH-SY5Y的细胞毒性，图2C表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖缓解百草枯对SH-SY5Y的细胞毒性，其中*表示p〈0.05 ；
[0027]图3为实施例8中茜草多糖抑制多聚谷氨酰胺在秀丽线虫体内聚集及聚集毒性的数据表征图；其中图3A表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL菌草多糖和菌草酸性多糖抑制多聚谷氨酰胺聚集对HA759秀丽线虫ASH神经元的神经毒性，图3B表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖抑制多聚谷氨酰胺聚集在AM141秀丽线虫体壁肌肉细胞中的聚集，图3C表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖降低HA759秀丽线虫体内的活性氧自由基水平，其中*表示 ρ〈0.05。
【具体实施方式】
[0028]下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0029]实施例1
[0030]本实施例提供的一种茜草酸性多糖，其通过如下方法制备获得:将500g茜草根茎粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C下加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:20 (g/mL)加水，在90°C下加热搅拌提取3h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照2.0g/mL浓度加入木瓜蛋白酶，在40°C、pH6.0条件下加热搅拌2h。酶解结束后将4倍(酶解液体积)体积乙醇加入酶解液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集多糖，经过真空冷冻干燥获得粗多糖。将粗多糖溶于水后过732型阳离子交换树脂，以水洗脱，洗脱液采用1.0kD透析袋进行透析。透析截流液经减压浓缩后再过DEAE-sepharose阴离子交换葡聚糖凝胶柱，依次采用水和1.0mol/L氯化钠溶液洗脱，收集1.0mol/L氯化钠溶液的洗脱液，采用1.0kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得茜草酸性多糖，称重为13.0g,以茜草重量相比可计算得率为2.6%。
[0031]利用甲醇和三甲基硅醚将茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用气相色谱分析并对照9种标准单糖混合物的衍生物气相色谱图，可以得出茜草酸性多糖组分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸组分表明其是电负性的酸性多糖。
[0032]通过苯酚-硫酸反应后在490nm下测吸光值，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得多糖含量为76.2%。
[0033]通过考马斯亮蓝法在570nm下测吸光值，以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得蛋白质含量为4.0%。这些含量测定结果表明所制备茜草酸性多糖杂质少，多糖含量高。
[0034]以碘化钾为试剂检测茜草酸性多糖未呈现蓝色，表明其不含淀粉类成分。
[0035]将菌草酸性多糖过Sepharose6凝胶柱，以水洗脱,按ImL/管收集洗脱峰,采用苯酚-硫酸法检测每管多糖含量，将每管吸收峰按洗脱时间绘制吸光值图谱，发现仅存在一个连续的吸收峰，表明该酸性多糖分子量分布较为均一。
[0036]实施例2
[0037]本实施例提供的一种茜草酸性多糖，其通过如下方法制备获得:将500g茜草根茎粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加入乙醇，80°C下加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在100°C下加热搅拌提取3h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照1.0g/mL浓度加入木瓜蛋白酶，在50°C、pH6.0条件下加热搅拌3h。酶解结束后将4倍体积乙醇加入酶解液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集多糖，经过真空冷冻干燥获得粗多糖。将粗多糖溶于水后过732型阳离子交换树脂，以水洗脱，洗脱多糖溶液采用3.5kD透析袋进行透析。透析截流液经减压浓缩后再过DEAE-sephadex A_25阴离子交换纤维素柱，依次采用水和1.0mol/L氯化铵溶液洗脱，收集1.0mol/L氯化铵溶液的洗脱液，采用3.5kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得茜草酸性多糖，称重为11.6g，以茜草重量相比可计算得率为2.3%。
[0038]利用甲醇和三甲基硅醚将茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用气相色谱分析并对照9种标准单糖混合物的衍生物气相色谱图，可以得出茜草酸性多糖组分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸组分表明其是电负性的酸性多糖。
[0039]通过苯酚-硫酸反应后在490nm下测吸光值，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得多糖含量为80.3%。
[0040]通过考马斯亮蓝法在570nm下测吸光值，以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得蛋白质含量为3.5%。这些含量测定结果表明所制备茜草酸性多糖杂质少，多糖含量高。
[0041]以碘化钾为试剂检测茜草酸性多糖未呈现蓝色，表明其不含淀粉类成分。
[0042]将菌草酸性多糖过Sepharose6凝胶柱，以水洗脱,按ImL/管收集洗脱峰,采用苯酚-硫酸法检测每管多糖含量，将每管吸收峰按洗脱时间绘制吸光值图谱，发现仅存在一个连续的吸收峰，表明该酸性多糖分子量分布较为均一。[0043]实施例3
[0044]本实施例提供的一种茜草酸性多糖，其通过如下方法制备获得:将500g茜草根茎粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加入乙醇，70°C下加热搅拌回流2h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在100°C下加热搅拌提取3h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照1.(^/11^浓度加入胃蛋白酶，在371:、？!14.0条件下加热搅拌311。酶解结束后将5倍体积乙醇加入酶解液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集多糖，经过真空冷冻干燥获得粗多糖。将粗多糖溶于水后过CM Sephadex C_25阳离子交换葡聚糖凝胶，以水洗脱，洗脱多糖溶液采用3.5kD透析袋进行透析。透析截流液经减压浓缩后再过DEAE-sepharose阴离子交换葡聚糖凝胶柱,依次采用水和0.5mol/L氯化钾溶液洗脱,收集
0.5mol/L氯化钾溶液的洗脱液，采用3.5kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得茜草酸性多糖，称重为9.7g，以茜草重量相比可计算得率为1.9%。
[0045]利用甲醇和三甲基硅醚将茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用气相色谱分析并对照9种标准单糖混合物的衍生物气相色谱图，可以得出茜草酸性多糖组分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸组分表明其是电负性的酸性多糖。
[0046]通过苯酚-硫酸反应后在490nm下测吸光值，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得多糖含量为82.7%。
[0047]通过考马斯亮蓝法在570nm下测吸光值，以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得蛋白质含量为4.6%。这些含量测定结果表明所制备茜草酸性多糖杂质少，多糖含量高。
[0048]以碘化钾为试剂检测茜草酸性多糖未呈现蓝色，表明其不含淀粉类成分。将茜草酸性多糖过Sepharose6凝胶柱，以水洗`脱,按Iml/管收集洗脱峰,采用苯酹-硫酸法检测每管多糖含量，将每管吸收峰按洗脱时间绘制吸光值图谱，发现仅存在一个连续的吸收峰，表明该酸性多糖分子量分布较为均一。
[0049]实施例4
[0050]本实施例提供的一种茜草酸性多糖，其通过如下方法制备获得:将500g茜草根茎粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C下加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:5 (g/mL)加水，在100°C下加热搅拌提取5h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，按照2.0g/mL浓度加入胰酶，在40°C、pH7.0条件下加热搅拌3h。酶解结束后将5倍体积乙醇加入酶解液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集多糖，经过真空冷冻干燥获得粗多糖。将粗多糖溶于水后过732型阳离子交换树脂，以水洗脱，洗脱多糖溶液采用2.0kD透析袋进行透析。透析截流液经减压浓缩后再过D900型阴离子交换树脂，依次采用水和0.5mol/L醋酸钠溶液洗脱，收集0.5mol/L醋酸钠溶液的洗脱液，采用2.0kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得茜草酸性多糖，称重为9.3g，以茜草重量相比可计算得率为1.9%。
[0051]利用甲醇和三甲基硅醚将茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用气相色谱分析并对照9种标准单糖混合物的衍生物气相色谱图，可以得出茜草酸性多糖组分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸组分表明其是电负性的酸性多糖。[0052]通过苯酚-硫酸反应后在490nm下测吸光值，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得多糖含量为78.4%。
[0053]通过考马斯亮蓝法在570nm下测吸光值，以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得蛋白质含量为3.6%。这些含量测定结果表明所制备茜草酸性多糖杂质少，多糖含量高。
[0054]以碘化钾为试剂检测茜草酸性多糖未呈现蓝色，表明其不含淀粉类成分。
[0055]将菌草酸性多糖过Sepharose6凝胶柱，以水洗脱,按ImL/管收集洗脱峰,采用苯酚-硫酸法检测每管多糖含量，将每管吸收峰按洗脱时间绘制吸光值图谱，发现仅存在一个连续的吸收峰，表明该酸性多糖分子量分布较为均一。
[0056]实施例5
[0057]本实施例提供的一种茜草多糖，其常规制备通过如下方法获得:将500g茜草根茎粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加水，在10(TC下加热搅拌提取3h。减压浓缩后离心获得澄清提取液，将4倍体积乙醇加入提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集多糖，经过真空冷冻干燥获得茜草多糖，称重为27.9g，以茜草重量相比可计算得率为5.6%。
[0058]通过苯酚-硫酸反应后在490nm下测吸光值，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得多糖含量为18.3%。
[0059]通过考马斯亮蓝法在570nm下测吸光值，以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，将多糖吸光值代入标准曲线后计算可得蛋白质含量为29.2%。这些含量测定结果表明所制备茜草多糖杂质较多，多糖含量较低。
[0060]将菌草多糖过Sepharose6凝胶柱，以水洗脱，按ImL/管收集洗脱峰，采用苯酚-硫酸法检测每管多糖含量，将每管吸收峰按洗脱时间绘制吸光值图谱，发现存在多个连续的吸收峰，表明该多糖分子量分布不均一。
[0061]实施例6
[0062]A β 42 ( β -淀粉样蛋白 42 片段，β-amyloid peptide42, A β 42)和 polyQ40 (多聚谷氨酰胺40片段,polyglutamine with40repeats,polyQ40)分别是阿尔茨海默症和亨廷顿舞蹈病中的关键致病蛋白，其聚集能够产生显著的神经毒性，而抑制其聚集能够有效缓解神经毒性。将实施例1制得的茜草酸性多糖和实施例5制得的茜草多糖，以2mg/mL浓度分别加入50 μ MA β 42和polyQ40单体溶液中，混匀后置于37°C下孵育。对照组同上处理,但用等体积的水代替多糖溶液。每隔一定时间取出混合液，加入硫磺素T溶液和Glycine-NaOH溶液，振荡均匀后利用荧光酶标仪检测样品的荧光强度，激发波长和发射波长分别为450nm和485nm。相对荧光强度以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0063]图1A和图1B表明，Aβ 42和polyQ40在体外随着时间延长而发生聚集，加入茜草多糖和茜草酸性多糖后均能够有效抑制其聚集速度和程度，表明茜草多糖具有潜在的神经毒性抑制作用。
[0064]实施例7
[0065]采用A β 42和3-硝基丙酸能够分别有效地在细胞水平上诱导阿尔茨海默症和亨廷顿舞蹈病相关的神经毒性，此外氧化损伤也是神经退行性疾病中的重要致病因素，采用百草枯作为造模剂可产生氧化胁迫。将实施例1制备的茜草酸性多糖和实施例5制得的茜草多糖，按照l_4mg/mL浓度分别加入到以50 μ M A β 42、7.5mM3_硝基丙酸、0.8mM百草枯造模的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中。对照组采用造模处理，但用细胞培养基代替多糖溶液，空白组未用造模试剂和多糖处理。在37°C下孵育24h后，加入MTT溶液继续孵育4h。孵育结束后吸弃上清，加入DMSO并振摇，在570nm处测定吸光值，细胞存活率为多糖组吸光值与对照组吸光值的比值。细胞活力值以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0066]图2A显示，A β 42在50 μ M时能够显著降低细胞活力，而茜草酸性多糖在l_4mg/mL浓度范围内均能够缓解A β 42的细胞毒性，茜草多糖在2mg/mL和4mg/mL浓度下能够缓解Αβ42的神经毒性。
[0067]图2Β显示,菌草酸性多糖在较高浓度2mg/mL和4mg/mL下能够抑制3-硝基丙酸的细胞毒性，而茜草多糖在4mg/mL浓度下可以缓解3-硝基丙酸的神经毒性。
[0068]图2C显示，茜草酸性多糖和茜草多糖在l_4mg/mL浓度范围内均能够抑制百草枯的细胞毒性。
[0069]这些结果显示茜草酸性多糖较茜草多糖作用更为显著，但两者均能够在细胞水平上抑制阿尔茨海默症和亨廷顿舞蹈病相关的神经毒性并减少氧化损伤，表明两者均具有良好的体外神经保护作用。
[0070]实施例8
[0071]秀丽线虫转基因模型HA759是将polyQ(多聚谷氨酰胺,polyglutamine,polyQ)和GFP在其头部ASH神经元中表达，在其生长发育过程中，polyQ聚集将导致ASH神经元进行性衰亡。因此可以通过观察ASH神经元的存活率来检测多糖对polyQ聚集介导的神经毒性的缓解作用。将实施例1制备获得的茜草酸性多糖和实施例5制得的茜草多糖，以l_4mg/mL浓度分别加入LI期HA759秀丽线虫幼虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于15°C下培养3天。收集HA759秀丽线虫·，加入叠氮化钠溶液使其麻痹，混匀后滴加在琼脂糖垫上，在荧光显微镜下观察每条秀丽线虫ASH神经元的GFP荧光点。随机统计~100条秀丽线虫，ASH神经元存活百分率=ASH神经元存活的秀丽线虫数目/ (ASH神经元存活的秀丽线虫数目+ASH神经元死亡的秀丽线虫数目)X 100。存活率以mean土SEM表示，使用one-wayANOVA分析和Tukey post-hoc test比较多糖组和对照组的差异性。
[0072]结果如图3A所示，由于polyQ在ASH神经元中进行性表达和聚集，导致对照组HA759秀丽线虫ASH神经元在3天后的存活率仅为33.5%，茜草酸性多糖在lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL浓度下均能延缓ASH神经元死亡，ASH神经元存活率相比于对照组的分别提高至46.4%,54.2%和55.3%。茜草多糖在2mg/mL和4mg/mL浓度下具有神经保护活性，ASH神经元存活率相比于对照组的分别提高至44.7%和48.3%，该结果表明茜草酸性多糖作用更为显著，但茜草酸性多糖和茜草多糖均能够缓解polyQ聚集介导的神经毒性。
[0073]秀丽线虫转基因模型AM141是在体壁肌肉细胞中诱导表达polyQ40::YFP融合基因，在其生长发育过程中，polyQ40进行性表达并形成聚集而导致秀丽线虫周身出现弥散的绿色荧光点，而且荧光点数量将逐渐增加。因此可以通过统计荧光点的数量来检测多糖对polyQ聚集的抑制作用。将实施例1制备的茜草酸性多糖和实施例5制得的茜草多糖，以l-4mg/mL浓度分别加入LI期AM141秀丽线虫幼虫中，对照组加入等体积的S Medium,置于20°C下培养4天。每24h收集AM141秀丽线虫，将其固定于琼脂糖垫上，在荧光显微镜下统计每条秀丽线虫周身的荧光点数，随机统计30~40条，连续统计4天。荧光点数目以mean土 SEM表示，使用one-way ANOVA分析和Tukey post-hoc test比较多糖组和对照组的差异性。
[0074]结果如图3B所示，对照组AM141秀丽线虫在发育生长过程中，其周身肌肉细胞的polyQ聚集点逐渐增多，第I天到第四天的荧光聚集点数分别为?2个、?12个、?30个和?52个。采用2mg/ml茜草酸性多糖处理后，在第I天和第2天时荧光聚集点数基本与对照组的相当，在第3天和第4天时聚集点数分别为?27个和?46个，相比于对照组的有所下降。而采用2mg/mL茜草多糖处理后，第1、2和4天时荧光聚集点数基本与对照组的相当，第3天的聚集点相比于对照组的下降至?29个，该结果表明茜草酸性多糖和茜草多糖均具有抑制polyQ体内聚集的作用,但酸性多糖效果较为显著。
[0075]将实施例1制备的茜草酸性多糖和实施例5制得的茜草多糖，以2mg/mL浓度加入LI期HA759秀丽线虫幼虫中，对照组加入等体积的S Medium，置于15°C下培养3天。收集HA759秀丽线虫，加入含1%吐温20的PBS，然后转移至玻璃匀浆器中在冰上匀浆，收集匀浆再加入DCFH-DA探针溶液，在37°C下避光孵育，然后用荧光酶标仪检测荧光值，激发波长为485nm，发射波长为530nm。相对荧光强度以mean 土 SEM表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0076]结果如图3C所示，对照组的DCF相对荧光值为47.8，采用2mg/mL茜草酸性多糖和茜草多糖处理后，DCF相对荧光值分别下降至32.6和35.6，表明茜草酸性多糖和茜草多糖均能够显著降低HA759秀丽线虫体内活性氧自由基水平，具有良好的体内抗氧化活性。
[0077]这些结果进一步表明除了在细胞水平，茜草多糖还能够在整体动物水平上抑制多聚谷氨酰胺异常聚集及其神经毒性，并能减少其氧化水平，充分说明该多糖的体内神经保护活性。
[0078]经上述体外聚集模型、哺乳动物细胞和秀丽线虫疾病模型试验证实，茜草多糖能够有效抑制多聚谷氨酰胺和β -淀粉样蛋白的异常聚集(见实施例6和实施例8)及其神经毒性(见实施例7和实施例8)，还能显著降低疾病模型的活性氧自由基水平(见实施例8)，表明其对神经退行性疾病具有良好的防治作用。
[0079]实施例9
[0080]将实施例1制得的茜草酸性多糖，根据需要添加适量乳清蛋白、麦芽糊精制备成为具有神经保护功效的粉末状态健康食品或保健食品，还可以添加其它常规辅料制成常规剂型。
[0081]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【权利要求】
1.茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈病和帕金森氏综合症在内的以蛋白质异常聚集、特定神经细胞和组织逐渐衰退死亡为主要病理特征的神经系统疾病。
3.根据权利要求1所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:所述的茜草多糖为市售产品。
4.根据权利要求1所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:所述的茜草多糖为茜草酸性多糖。
5.根据权利要求4所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:所述的茜草多糖通过以下方法制备获得:以茜草为原料，经含脱脂、水提、酶解、醇沉、离子交换和透析工序制备获得，所述茜草酸性多糖具有神经保护作用，能制备具有防治神经退行性疾病的保健食品。
6.根据权利要求5所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:脱脂时，采用乙醇为脱脂溶剂，茜草和乙醇的质量体积比为1:2?1:20，脱脂温度为50?90°C，时间为I?IOh ;水提时，茜草和水的质量体积比为1:2?1:20，提取温度为50?100°C，水提取时间为I?10h。
7.根据权利要求5所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:酶解时，采用的酶为木瓜蛋白酶、胰酶、果胶酶或中性蛋白酶，酶解的作用是除去茜草的药用部位根或根茎中的蛋白质，酶解时酶的质量体积百分含量为0.5?5.0%，pH为2.0?8.0，温度为30?60°C，时间为0.5?5h ;醇沉时，采用乙醇沉淀酶解液获得茜草酸性粗多糖，乙醇和酶解液的体积比为3:1?5:1。
8.根据权利要求5所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:离子交换包括阳离子交换和阴离子交换，首先进行阳离子交换，将醇沉获得的茜草酸性粗多糖，进行阳离子交换，水洗脱后，洗脱液经透析袋透析获得透析液，将透析液进行阴离子交换，依次采用水和洗脱液洗脱后，过透析袋透析，透析液经浓缩和干燥处理，获得茜草酸性多糖。
9.根据权利要求8所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:所述阳离子交换和阴离子交换的材料为纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或树脂；透析袋的截留分子量为1.0?5.0kD ;阴离子交换时，洗脱液为醋酸盐、磷酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、铵盐或甘氨酸。
10.根据权利要求5所述的茜草多糖在制备具有防治神经退行性疾病功效的保健食品中的应用，其特征是:所述茜草是指茜草的药用部位根或根茎。
【文档编号】A23L1/09GK103564288SQ201310476130
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】马忠华, 马方励, 李海峰, 胡明华, 徐晓飞 申请人:无限极（中国）有限公司