表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用，本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及基因工程【技术领域】。本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗。本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，是将编码人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株；本发明还提供了该重组菌株的构建方法以及由其得到的活菌疫苗。该活菌菌株能够在细胞中表达分泌出人类p53蛋白，动物学实验证明，将其作为疫苗接种机体后，可以起到预防和治疗癌症的作用。
【专利说明】表达分泌人类P53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种利用基因工程技术构建获得的能够表达分泌人类P53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]癌症是威胁人类健康和生命的杀手，每年因患恶性肿瘤致死的病例已经上升到各种疾病的首位。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗。尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。由于肿瘤本身易转移和复发，使传统的手术、放疗和化疗效果有限。目前，肿瘤免疫治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫治疗包括抗体、细胞因子、疫苗和细胞治疗。它是一种新型的主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，肿瘤与机体之间的相互作用、肿瘤免疫耐受以及肿瘤抗原鉴定都取得了很大的进展，这也促进了肿瘤疫苗的发展。目前，很多抗肿瘤疫苗在动物水平和临床试验已取得令人鼓舞的效果。作为一种高效、无明显毒副作用的肿瘤免疫疗法已经成为了人类预防和治疗肿瘤疾病的必然趋势。
[0003]人类P53基因是功能最强大的一种抑癌基因，p53蛋白对细胞周期和凋亡起关键性作用，尤其是对受辐射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞，起更大的杀伤作用。人类P53基因也是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。人类P53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。突变型P53基因具有促进细胞增殖的活性，导致细胞异常增殖，参与肿瘤形成。正常的人类P53基因功能的改变或缺失与大量不同种类的人类肿瘤细胞有密切关系。人类p53蛋白被认为是细胞应激的关键性调控分子之一，能整合各种不同的细胞危急事件的信号，通过转录或非转录途径对这些信号作出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应。有研究认为正常人类P53蛋白在体内扮演“分子警察”的角色，监视细胞基因组的完整性。因此，维持和修复人类P53基因功能在预防和治疗人类肿瘤疾病中有着重要意义。
[0004]BCG (Bacillus Calmette_Gu6rin)作为预防结核病的疫苗已经得到广泛的使用。BCG作为重组疫苗载体具有其他疫苗载体不可比拟的优越性。BCG在全世界范围内应用最广泛，它是一种耐热活疫苗，生产成本低，且应用于实验动物和人体并发症少。因此，把BCG作为活菌疫苗载体，是目前构建重组疫苗的理想选择。
[0005]人类P53蛋白是基因组的守卫，当DNA损伤发生时，p53蛋白会阻止细胞增殖直到损伤被修复后。人类癌细胞中的P53蛋白发生突变，失去了保护作用。因此，如果能够使用BCG作为疫苗载体构建表达分泌人类p53蛋白的活菌疫苗，将其接种机体后使之持续表达分泌人类p53蛋白，维持和恢复p53蛋白的功能，将有望达到高效预防和治疗人类肿瘤疾病的发生的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗，特别是提供一种具有表达分泌与人类肿瘤疾病密切相关的人类P53蛋白的重组BCG活菌疫苗。
[0007]为实现上述目的，本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类P53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。
[0008]进一步地,所述人类p53优选基因序列具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0009]进一步地，所述人类p53优选基因序列的上游连接有核苷酸序列如SEQ IDNO: 3所示的BCG分泌信号肽基因序列，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0010]进一步地,所述重组BCG活菌菌株是将具有核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示的基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株。
[0011]本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤:
[0012](I)根据编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列以及BCG基因组对密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的人类P53优选基因序列；
[0013](2)将具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的BCG分泌信号肽基因序列连接到上述人工合成的人类P53优选基因的上游，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0014](3)利用限制性内切酶和链接酶将上述人工合成的上游具有BCG分泌信号肽序列的人类P53优选基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，并转化到大肠杆菌E.coliT0P10中，获得正确的重组转化子；
[0015](4)将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定及测序鉴定阳性转化子；
[0016](5)将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的人类p53蛋白情况。
[0017]进一步地，上述构建方法中所使用的BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为P丽234穿梭表达载体。
[0018]本发明还提供了一种活菌疫苗，其特征在于:所述活菌疫苗中含有上述重组BCG活菌菌株。
[0019]本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用，其应用方法是将该重组BCG活菌菌株辅以药学上可接受的佐剂制备成疫苗，该疫苗可单独使用也可联合其他药物或者放疗化疗一起使用，使用时经皮内注射，注射量以BCG活菌个数计为IO6CFU/人，可一次注射，也可分多次注射。
[0020]有益效果:`
[0021]本发明对人类p53基因序列进行改造，并成功导入BCG活菌菌株中得到了能够在BCG细胞中表达分泌出人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株。利用该重组BCG活菌菌株制备而成的活菌疫苗，经Western blot检测结果显示,该活菌疫苗可以胞外表达人类p53蛋白，并能被人类P53蛋白抗体识别。将其接种人体后，可以在体内持续表达分泌人类p53蛋白，使得人体内的P53蛋白得到补充，从而起到对癌症的预防和治疗作用。本发明提供的重组BCG活菌疫苗可作为新型的人类癌症疾病预防性疫苗应用于对癌症疾病的预防。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是重组人类p53优选基因和BCG分泌信号肽基因穿梭表达载体p丽_p53的物理图谱；
[0023]图2是本发明重组BCG胞外表达人类p53蛋白的Western blot鉴定图；
[0024]图3是本发明活菌疫苗治疗A549肺癌小鼠模型细胞数变化结果；
[0025]图4是本发明活菌疫苗治疗A549肺癌小鼠模型荷瘤重量分析结果图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
[0027]以下实施例中所用原料来源
[0028]菌株与载体:大肠杆菌菌株E.coli T0P10由本实验室保存，耻垢分支杆菌、BCG、由深圳市疾病预防控制中心惠赠。PMN234载体由北京蛋白质组学研究中心惠赠。
[0029]酶与试剂盒:限制性内切酶购自Fermentas公司，连接酶为NEB公司产品，Taq酶购自北京全式金生物科技有限公司。基因组提取试剂盒为OMEGA品牌产品。
[0030]生化试剂:DNA序列、引物由`生工生物工程(上海)股份有限公司合成。人类p53蛋白单克隆抗体为Santas公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。
[0031]培养基:大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0 ；M7H9+ADC液体培养基:称取4.79Middlebrook 7H9 Broth,溶于900ml去离子水中，加入
0.2%的甘油和0.05%的Tween-80，121 °C高压灭菌30min，待冷却至45 °C加入IOOmLADCEnrichment,4°C保存；M7H10+0ADC 固体培养基:称取 19g Middlebrook M7H10Agar,溶于900ml去离子水中，加入0.4%甘油和0.1%的Tween-80，混匀，121 °C高压灭菌30min，待冷却至 50-55?，加入 IOOmLOADC Enrichment，倒置平板。
[0032]实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0033]实施例1
[0034]人类P53基因改造及上游添加BCG分泌信号肽序列
[0035]根据人类p53基因序列(GenBank登陆号:NM_001126112)和BCG基因组密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的人类p53优选基因序列。人类p53优选基因序列如SEQ ID NO:2所示序列。
[0036]通过查阅相关文献，获得BCG基因组所携带120bp长度的α分泌信号肽基因序列，如SEQ ID Ν0:3所示核苷酸序列。根据穿梭表达载体ρΜΝ234的酶切位点要求，将α分泌信号肽基因序列拼接到人类Ρ53优选基因上游，α分泌信号肽基因序列上游添加BamHI和Xba I酶切位点，人类ρ53优选基因下游添加HindIII酶切位点。由生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成α-ρ53基因序列。最终合成的α-Ρ53基因序列具有如SEQ IDNO:4的核苷酸序列。人工合成的α -ρ53基因的克隆质粒为pUC_57。[0037]实施例2
[0038]BCG穿梭表达载体的构建
[0039]1.pMN-p53穿梭表达载体构建
[0040]质粒PMN234是大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体，同样含有HSP60启动子(北京蛋白质组学研究中心惠赠)。目的基因可以插入到P丽234载体的BamH I和Hind III酶切位点之间表达目标蛋白。实施例1中已经获得了上游含有α分泌信号肽人类ρ53优选基因亚克隆重组质粒pUC- α -ρ53两端含有BamH I和Hind III酶切位点)。
[0041](I)提取ρΜΝ234空质粒以及克隆质粒pUC_ α -Ρ53
[0042]质粒DNA的快速小量提取:接种分别含有P丽234空质粒以及克隆质粒pUC-α -P53大肠杆菌菌株于30ml含卡那霉素抗性和氨节青霉素抗性的LB培养基中，37°C、200rpm摇动培养过夜。按照质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.3.0)说明书提取质粒 DNA。
[0043]I)将30mL过夜培养的菌液各取3ml、13000rpm离心2min收集菌体于1.5ml的EP
管中；
[0044]2)菌体沉淀悬浮于250 μ I溶液I中，混匀；
[0045]3)加入250 μ I溶液II，轻柔地颠倒混匀10次左右，裂解时间不宜超过5min ；
[0046]4)加入350 μ I预冷的溶液III,轻柔地颠倒混匀10次左右；
[0047]5)13000rpm 离心 IOmin,将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，离心上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心lmin,弃滤液。
[0048]6)将 500 μ I 的 Buffer WA 加入 Spin Column 中，12000rpm 离心 30sec,弃滤液。
[0049]7)将 700 μ I 的 Buffer WB 加入 Spin Column 中，12000rpm 离心 30sec,弃滤液。
重复一次。
[0050]8)重新将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12000rpm 离心 2min,除尽残
留洗液。
[0051]9)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上,在Spin Column膜的中央处加Λ 40 μ I加热至60°C的灭菌蒸馏水，室温静置2分钟。
[0052]10) 12000rpm 离心 2min 洗脱 DNA。
[0053](2)双酶切
[0054]pUC-α-p53信号肽质粒和P丽234质粒同时用BamH I和Hind III双酶切，酶切体
系如下:
[0055]
【权利要求】
1.一种重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将编码氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的人类P53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类P53优选基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株。
2.根据权利要求1所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于:所述人类p53优选基因序列具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于:所述人类p53优选基因序列的上游连接有核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的BCG分泌信号肽基因序列，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
4.根据权利要求3所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将具有核苷酸序列如SEQID N0:4所示的基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。
5.一种活菌疫苗，其特征在于:含有权利要求1至4任一项所述的重组BCG活菌菌株。
6.权利要求4所述的重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤: (1)根据编码氨基酸序列如SEQID NO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列以及BCG基因组对密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的人类P53优选基因序列； (2)将具有如SEQID N0:3所示的核苷酸序列的BCG分泌信号肽基因序列连接到上述人工合成的人类P53优选基因的上游，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； (3)利用限制性内切酶和链接酶将上述人工合成的上游具有BCG分泌信号肽序列的人类P53优选基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，并转化到大肠杆菌E.coliTOPlO中，获得正确的重组转化子； (4)将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定及测序鉴定阳性转化子； (5)将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的人类p53蛋白情况。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于:所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为PMN234穿梭表达载体。
8.权利要求1至4任一项所述的重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用。
【文档编号】C12R1/07GK103497926SQ201310495294
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】胡章立, 李勇 申请人:深圳大学