唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与应用。本发明提供的所述唾液酸寡糖-金纳米粒子是表面通过S-Au键连接了唾液酸α2,3或α2,6寡糖-O(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR和HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR的金纳米粒子。使用所述唾液酸寡糖-金纳米粒子检测流感病毒毒株或其HA蛋白，通过肉眼观察即可快速得到待测流感病毒的受体特异性，检测流感病毒HA蛋白的灵敏度可达2.5nM。利用本发明方法可方便、快捷地得到流感病毒与宿主细胞之间的相互作用信息，对流感病毒的防控具有重要意义。
【专利说明】唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与在检测流感病毒宿主 特异性中的应用。
【背景技术】
[0002]流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人畜共患传染病，它的宿主累及人、 猪、鸟、马和海豚等多种动物。一般来说，流感病毒在不同的宿主间存在着一定的屏障， 禽类流感通常经猪(中间宿主)才能感染人。研究证实，流感病毒表面糖蛋白血凝素 (hemagglutinin, HA)特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复 制并继续传播的生物学基础。流感病毒对唾液酸的识别和结合有偏好型，禽流感病毒倾 向于结合Siaa 2，3Gal受体，而人流感病毒则主要结合Sia a 2，6Gal受体。禽类的肠道 主要含Siaa2，3Gal受体，人类的上呼吸道上皮细胞主要有Sia a 2，6Gal受体。人流感 病毒与人的气管上皮细胞结合紧密，而禽流感病毒与人气管上皮细胞结合很弱。猪既有 Sia a 2，3Gal受体也有Sia a 2，6Gal受体，猪对人流感病毒和禽流感病毒都易感。人上呼 吸道中Siaa 2，3Gal受体较少，这很可能是造成禽流感病毒不易感染人的主要原因，禽流 感病毒感染人需适应人的Siaa 2，6Gal受体，克服跨种间屏障。但是，2004年爆发的禽流 感及其人禽死亡的情况分析显示，禽H5N1毒株能突破宿主屏障直接感染人造成人员死亡， 这给人类社会造成很大的考验。因此快速准确地掌握流感病毒与宿主细胞的相互作用信息 (即流感病毒的宿主特异性)有助于人们进一步加强对流感病毒的防控，特别是在新型流感 病毒出现时，对其能否在不同宿主之间传播做出及时、有效的预测。
[0003]传统的流感病毒宿主特异性诊断方法是血凝和血凝抑制实验，前者通过流感病毒 和红细胞的凝集检测其受体特异性；后者通过抑制流感病毒对红细胞的凝集检测体系中病 毒或HA的受体特异性。两者都受限于红细胞表面的糖链结构。红细胞吸附检测技术突破 红细胞表面已有糖链结构的限制，先将细胞表面受体清除，再用特异的唾液酸转移酶分别 将唾液酸寡糖链转移到红细胞表面，但该方法操作较为繁琐。固相酶联检测技术模仿传统 ELISA形式，将流感病毒固定，待检测物质通过与表面带有唾液酸寡糖的标记胎球蛋白竞争 来检测其受体特异性。此方法可以检测多种病毒，但是通量较低。近年来出现的糖链芯片 技术由于其特异、敏感、高通量受到青睐，但是其成本极为昂贵，设备投入过高，无法在临床 推广应用，而且世界上仅美国的一家研究机构有该检测平台。因此，如何快速、便捷地检测 出流感病毒对流感的防控具有重要意义。
[0004]纳米科技是指在纳米尺度(Inm到IOOnm之间)上研究物质的特性和相互作用，以 及利用这些特性的多学科交叉的科学和技术。当物质小至1-1OOnm (10-9-l(T7m)时，其量子 效应、物质的局域性及巨大的表面及界面效应使物质的很多性能发生质变，呈现出许多奇 异的现象。金纳米颗粒由氯金酸通过化学还原制成，具有良好的光学性质，直径为13nm的 金颗粒在520nm处有明显的吸收，人们可以通过肉眼观察到明显的红色，这一特性使其成 为比色检测中优良的报告系统。金纳米颗粒在不同的聚集状态下呈现不同的颜色，肉眼可见，也可用分光光度计测定，其敏感性和特异性可与其它检测方法(如免疫荧光检测)匹敌。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子， 以及它的制备方法及应用。
[0006]本发明所提供的用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子，是表面通过S-Au共价键连接了如下化合物的金纳米粒子:
[0007]式X -1所示化合物或式X -2所示化合物，和式XI所示化合物；
[0008]
【权利要求】
1.用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子，是表面通过S-Au共价键连接了如下化合物的金纳米粒子:式X -1所示化合物或式X -2所示化合物，和式XI所示化合物；
2.根据权利要求1所述的唾液酸寡糖-金纳米粒子，其特征在于:所述m为3-6的整数；所述k为5-11的整数；所述式X -1所示化合物或式X -2所示化合物与所述式XI所示化合物的摩尔比为(2-10):1。
3.根据权利要求2所述的唾液酸寡糖-金纳米粒子，其特征在于:所述m为3或6，所述n为I或0,所述k为5或11,所述p为2或0 ;所述式X -1所示化合物或式X -2所示化合物与所述式XI所示化合物的摩尔比为2: 1、 5:1 或 10:1。
4.根据权利要求1-3任意所述的唾液酸寡糖-金纳米粒子，其特征在于:所述金纳米粒子的平均粒径为10—30nm,或13nm ；所述式X -1所示化合物或式X -2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为 10000-80000:1，或 20000-70000:1，或 30000-60000:1，或 30000-50000:1 或 40000:1。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述唾液酸寡糖-金纳米粒子的方法，包括将式X -1 所示化合物或式X -2所示化合物、和式XI所示化合物与含有金纳米粒子的溶液混合，获得所述用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子；所述式X -1所示化合物或式X -2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为(10000-80000):1 ;所述式X _1所示化合物或式X -2所示化合物与所述式XI所示化合物的摩尔比为(2-10):1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:含有金纳米粒子的溶液的溶剂为水，金纳米粒子的浓度为2 - 7.5nM。所述金纳米粒子的平均粒径为10—30nm,或13nm ；其中所述式X -1所示化合物或式X -2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为 40000:1
7.—种检测流感病毒的宿主特异性的试剂或试剂盒，其特征在于:包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式X -1所示和式XI所示化合物的金纳米粒子；所述B试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式X -2所示和式XI所示化合物的金纳米粒子；所述流感病毒的宿主特异性为所述流感病毒特异识别宿主细胞表面糖链受体类型为唾液酸a 2，3寡糖和唾液酸a 2，6寡糖中的至少一种。
8.—种检测流感病毒的宿主特异性的方法，包括如下步骤:将独立包装的A试剂和/ 或B试剂与待测流感病毒毒株或其HA蛋白在PBS缓冲液中孵育，获得反应液，检测所述反应液；当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与A试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染分泌唾液酸a 2，3寡糖寄主细胞的流感病毒；当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与B试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染分泌唾液酸a 2，6寡糖寄主细胞的流感病毒； 所述A试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式X -1所示和式X[所示化合物的金纳米粒子；所述B试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式X -2所示和式XI所示化合物的金纳米粒子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为 NaH2PO4, Na2HPO4, KCl 和 NaCl，所述溶质 NaH2P04、Na2HPO4, KCl 和 NaCl 在所述 PBS 缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、l.42g/L、0.2g/L及8.0g/L ;所述PBS缓冲液的pH值为7.4 ;所述流感病毒为A型流感病毒；所述结合为通过可见光下肉眼观察所述反应液的颜色来判断；若所述反应液的颜色与空白对照的颜色相比变浅或变紫，则所述待测流感病毒毒株候选为与所述唾液酸寡糖-金纳米粒子相结合的毒株；所述空白对照为不含流感病毒毒株或其HA蛋白的所述PBS缓冲液。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述反应液中的所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株的比例为2pmol:105个；所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株HA蛋白的比例为2pmol:16.7ug。
【文档编号】C12R1/93GK103551562SQ201310495249
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】李学兵, 未金花, 郑隆堂, 吕迅, 毕玉海, 高福, 刘文军, 严景华 申请人:中国科学院微生物研究所