复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
【专利摘要】本发明涉及复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途。本发明公开了编码复合酶(即，具有至少两种独立的和可分的酶活性的单一多肽)的分离核酸片段和包含此类片段的重组构建体以及使用这些复合酶在植物和含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法。
【专利说明】复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
[0001] 本申请是申请日为2008年4月3日的中国专利申请200880018608. X "复合酶及 其在制备多不饱和脂肪酸中的用途"的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本专利申请要求于2007年4月3日提交的第60/909790号美国临时申请和2008 年2月12日提交的第61/027898号美国临时申请的优先权，该临时申请的公开内容全文以 引用方式并入本文。
【技术领域】
[0004] 本发明属于生物【技术领域】。更具体地讲，本发明涉及编码复合酶的多核苷酸序列 及其在合成长链多不饱和脂肪酸（PUFA)中的用途。
【背景技术】
[0005] PUFA的重要性无可争议。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生物成分并被公 认为是："必需"脂肪酸，其不能由哺乳动物从头合成，而是必须从饮食中获得或者通过 进一步延长和去饱和亚油酸αΑ;18:2ω-6)或α-亚麻酸（ALA ;18:3c〇-3)来获得；在 质膜中它们可以例如磷脂或三酰基甘油之类的形式存在；正常发育（尤其是在发育中的 婴儿脑中）和组织形成及修复的必需物质；以及哺乳动物中几种重要的具有生物活性的 类二十烷酸（如前列环素、类花生酸、白三烯和前列腺素）的前体。而且，摄入大量长链 ω-3 PUFA 产生心血管保护效果（Dyerberg 等人，Amer.J. Clin. Nutr. 28 :958-966 (1975); Dyerberg 等人，Lancet. 2(8081) :117-119(1978) ;Shimokawa，Η·，World Rev. Nutr. Diet 88:100-108(2001) ;von Schacky 等人，World Rev. Nutr. Diet 88:90-99(2001))。大量的 其他研究证明，针对多种症状和疾病（如哮喘、牛皮癣、湿疹、糖尿病、癌）施用ω-3和/或 ω-6 PUFA赋予了广泛的健康益处。
[0006] 目前正在研究包括植物、藻类、真菌和酵母在内的多种不同宿主作为经由多种不 同途径商业化生产PUFA的手段。虽然宿主生物的天然PUFA生产能力有时对给定方法来说 是必要的，但基因工程也已证明能够完全改变一些宿主的天然能力（甚至那些不能天然产 生LA和ALA脂肪酸的宿主）以产生高水平的不同长链ω -3/ ω -6 PUFA。不管该效应是天 然能力的结果还是重组技术的结果，花生四烯酸（ARA ;20 :4ω-6)、二十碳五烯酸（EPA ;20 : 5 ω-3)和二十二碳六烯酸（DHA ;22 :6 ω-3)均需要Λ 9延伸酶/ Λ 8去饱和酶途径（该途径 存在于一些生物中，如类眼虫物种，并且其特征在于产生二十碳二烯酸（EDA ;20 :2ω-6)和 /或二十碳三烯酸（ETrA ;20 :3 ω -3))或Λ 6去饱和酶/ Λ 6延伸酶途径（该途径主要存在 于藻类、苔藓、真菌、线虫动物和人类中，并且其特征在于产生亚麻酸（GLA;18:3c〇-6) 和/或硬脂艾杜糖酸（STA ;18:4c〇-3))的表达（图1)。还已知，Λ6延伸酶是C18/2Q延伸 酶。
[0007] 迄今已鉴定的Λ 8去饱和酶能够将EDA转化成二高亚麻酸（DGLA(也称为 HGLA) ;20 :3, n-6)并将ETrA转化成二十碳四烯酸（ETA ;20 :4, n-3)。ARA和EPA随后分 别通过Λ 5去饱和酶进行的反应由DGLA和ETA合成。然而DHA合成需要随后表达附加的 C20/22延伸酶和Λ 4去饱和酶。迄今已鉴定的大多数C2〇/22延伸酶主要能将ΞΡΑ转化成DPA， 其次能将花生四烯酸（ARA ;20 :4ω-6)转化成二十二碳四烯酸（DTA ;22 :4ω-6)，然而迄今 已鉴定的大多数Λ 4去饱和酶主要能将DPA转化成DHA，其次能将成二十二碳四烯酸（DTA ; 22 :4 ω-6)转化成 ω-6 二十二碳五烯酸（DPAn-6 ;22 :5 ω-6)。
[0008] 基于(：2(|/22延伸酶和Λ4去饱和酶在DHA合成中的作用，已经投入相当大的努力 鉴定和研究这些来自不同来源的酶。同样，已将多个C 2(l/22延伸酶公开于公开文献和专利 文献（例如巴夫藻CCMP459 (GenBank登录号AAV33630)、绿藻（GenBank登录号AAV67798) 和假微型海链藻（GenBank登录号AAV67800))中。同样，已经公开了以下Δ4去饱和酶： 小眼虫（SEQ ID NO :13;GenBank 登录号 AAQ19605;Meyer 等人，Biochemistry，42(32): 9779-9788(2003));假微型海链藻（SEQ ID NO :29 ;GenBank 登录号 AAX14506 ;Tonon 等 人，FEBS J. ,272(13) :3401-3412(2005));金黄色破囊壶菌（SEQ ID NO :27 ;GenBank 登 录号AAN75707);海洋破囊壶菌（GenBank登录号CAD42496;美国专利公开7, 087, 432); 聚合裂殖壶菌（SEQ ID NO :28 ;PCT公开W0 2002/090493);鲁兹巴夫藻（GenBank登录 号 AAQ98793);和绿光等鞭金藻（SEQ ID N0:30;GenBank 登录号 AAV33631 ;Pereira 等人， Biochem.J·，384 (2) :357-366(2004) ;PCT 公开 TO 2002/090493)]。
[0009] 申请人:的受让人有多个关于含油酵母（S卩，解脂耶氏酵母）中PUFA生产的专利申 请，包括例如：美国专利公开7, 238, 482和7, 125, 672 ;美国专利申请11/265, 761 (提交于 2005年11月2日）；美国专利申请11/264, 784(提交于2005年11月1日）；美国专利申 请11/264,737(提交于2005年11月1日）。
[0010] 与此相关，PCT公开W0 2004/071467(公布于2004年8月26日）关于植物中的 PUFA生产，而PCT公开W0 2004/071178(公布于2004年8月26日）关于膜联蛋白启动子 以及它们在植物转基因表达中的用途。它们都是 申请人:的受让人的共同未决的专利申请。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及包括具有至少两种独立的和可分的酶活性的单一多肽的复合酶 (multizyme) 〇
[0012] 在第二实施方案中复合酶的酶活性可选自脂肪酸延伸酶、脂肪酸去饱和酶、酰基 转移酶、酰基CoA合酶和硫酯酶。更具体地讲，酶活性可包括连接到至少一种脂肪酸去饱和 酶的至少一种脂肪酸延伸酶。
[0013] 在第三实施方案中复合酶可包括连接到第二酶活性的第一酶活性，并且所述连接 选自多肽键 SEQ ID N0 :198 (EgDHAsynl 接头）、SEQ ID NO :200 (EgDHAsyn2 接头）、SEQ ID N0:235(EaDHAsynl接头）、SEQ ID N0:438、SEQ ID N0:445、SEQ ID N0:472、和SEQ ID NO: 504。
[0014] 在第四实施方案中，本发明涉及编码DHA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包 括：
[0015] (a)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法在 与如 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:95、SEQ ID N0:96、或 SEQ ID N0:97 所示 出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80%的氨基酸同一性；
[0016] (b)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在 与如 SEQ ID N0 :11、SEQ ID N0 :205、SEQ ID N0 :21、SEQ ID N0 :91、SEQ ID N0 :92、SEQ ID NO :93、或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少 80 %的序列同一性；
[0017] (C)编码具有DHA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条 件下与如 SEQ ID N0 :11、SEQ ID N0 :205、SEQ ID N0 :21、SEQ ID N0 :91、SEQ ID N0 :92、 SEQ ID NO :93、或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列杂交；或
[0018] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由 相同数目的核苷酸组成并且1〇〇 %互补。
[0019] 在第五实施方案中，本发明涉及编码具有DHA合酶活性的多肽的多核苷酸，其中 所述核苷酸序列包括 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、SEQ ID NO :93、或 SEQ ID NO :410。
[0020] 在第六实施方案中，本发明涉及具有DHA合酶活性的多肽，其中所述多肽的氨基 酸序列包括 SEQ ID N0 :12、SEQ ID N0 :22、SEQ ID N0 :95、SEQ ID N0 :96、或 SEQ ID N0 : 97〇
[0021] 在第七实施方案中，本发明涉及编码C20延伸酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸 包括：
[0022] (a)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法 在与如 SEQ ID N0 :12、SEQ ID N0 :22、SEQ ID N0 :95、SEQ ID N0 :96、SEQ ID N0 :97、SEQ ID N0:202(EgDHAsynl C20 延伸酶结构域）、SEQ ID N0:204(EgDHAsyn2 C20 延伸酶结构 域）、SEQ ID NO :231 (EaDHAsynl C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :232 (EaDHAsyn2 C20 延 伸酶结构域）或SEQ ID N0:233(EaDHAsyn3 C20延伸酶结构域）所示出的氨基酸序列进行 比较时，所述多肽具有至少80%的氨基酸同一性；
[0023] (b)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法 在与如 SEQ ID N0 :11、SEQ ID N0 :21、SEQ ID N0 :91、SEQ ID N0 :92、SEQ ID N0 :93、SEQ ID N0:183、SEQ ID N0:188、SEQ ID N0:201(EgDHAsynl C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO: 206(EgDHAsynl*C20 延伸酶结构域）、SEQ ID N0:203(EgDHAsyn2 C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :227 (EaDHAsynl C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :228 (EaDHAsyn2 C20 延伸酶结构 域）、SEQ ID N0:229(EaDHAsyn3 C20 延伸酶结构域）或 SEQ ID N0:230(EaDHAsyn4 C20 延伸酶结构域）所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80%的序列同 一I"生；
[0024] (c)编码具有C20延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格 条件下与如 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:93、 SEQ ID N0:183、SEQ ID N0:188、SEQ ID N0:201(EgDHAsynl C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :206 (EgDHAsynl*C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :203 (EgDHAsyn2 C20 延伸酶结构域）、 SEQ ID NO :227 (EaDHAsynl C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :228(EaDHAsyn2 C20 延伸酶结 构域）、SEQ ID N0:229(EaDHAsyn3 C20 延伸酶结构域）或 SEQ ID N0:230(EaDHAsyn4 C20 延伸酶结构域）所示出的核苷酸序列杂交；或
[0025] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由 相同数目的核苷酸组成并且100 %互补。
[0026] 在第八实施方案中，本发明涉及编码Λ4去饱和酶的分离多核苷酸，所述多核苷 酸包括：
[0027] (a)编码具有Λ4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方 法在与如SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:95、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:97、SEQ ID N0:193、SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:221、SEQ ID N0:239、SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO：24U SEQ ID NO：246, SEQ ID NO：247, SEQ ID NO：248, SEQ ID NO ：249, SEQ ID NO ：382,SEQ ID NO ：384,SEQ ID NO ：386,SEQ ID NO ：388,SEQ ID NO ：404,SEQ ID NO :406、或SEQ ID NO :408所示出的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少80%的氨 基酸同一I"生；
[0028] (b)编码具有Λ 4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法 在与如 SEQ ID Ν0 :11、SEQ ID Ν0 :21、SEQ ID Ν0 :91、SEQ ID Ν0 :92、SEQ ID Ν0 :93、SEQ ID NO ：192,SEQ ID NO ：214,SEQ ID NO ：216,SEQ ID NO ： 220,SEQ ID NO ： 236,SEQ ID NO： 237,SEQ ID NO ：238,SEQ ID NO ：242,SEQ ID NO ：243,SEQ ID NO ：244,SEQ ID NO ：245,SEQ ID N0：38USEQ ID NO ： 383, SEQ ID NO ： 385, SEQ ID NO ： 387, SEQ ID NO ： 403, SEQ ID NO： 405、或SEQ ID NO :407所示出的核苷酸序列进行比较时，所述核苷酸序列具有至少80%的 序列同一性；
[0029] (c)编码具有Λ 4去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严 格条件下与如 SEQ ID Ν0 :11、SEQ ID Ν0 :21、SEQ ID Ν0 :91、SEQ ID Ν0 :92、SEQ ID Ν0 : 93,SEQ ID NO ：214,SEQ ID NO ：216,SEQ ID NO ：220,SEQ ID NO ：236,SEQ ID NO ：237,SEQ ID NO ：238,SEQ ID NO ： 242,SEQ ID NO ： 243,SEQ ID NO ： 244,SEQ ID NO ： 245,SEQ ID NO： 381、SEQ ID N0:383、SEQ ID N0:385、SEQ ID N0:387、SEQ ID N0:403、SEQ ID N0:405、或 SEQ ID NO :407所示出的核苷酸序列杂交；或
[0030] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由 相同数目的核苷酸组成并且1〇〇 %互补。
[0031] 在第九实施方案中，本发明涉及编码DHA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸包 括如SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、SEQ ID NO :93、或SEQ ID NO :410中任一种所示出的序列。
[0032] 在第十实施方案中，本发明涉及编码C20延伸酶的分离多核苷酸，所述分离多核 苷酸编码C20延伸酶，所述多核苷酸包括如SEQ ID N0 :183、SEQ ID N0 :188、SEQ ID N0 : 201(EgDHAsynl C20延伸酶结构域、SEQ ID N0:206(EgDHAsynl*C20延伸酶结构域）、SEQ ID NO :203 (EgDHAsyn2 C20 延伸酶结构域）、SEQ ID NO :227 (EaDHAsynl C20 延伸酶结构域）、 SEQ ID N0:228(EaDHAsyn2 C20 延伸酶结构域）、SEQ ID N0:229(EaDHAsyn3 C20 延伸酶结 构域）或SEQ ID N0:230(EaDHAsyn4 C20延伸酶结构域）中任一种所示出的序列。
[0033] 在第十一实施方案中，本发明涉及编码Λ4去饱和酶的分离多核苷酸，所述多核 苷酸包括如 SEQ ID N0:192、SEQ ID N0:214、SEQ ID N0:220、SEQ ID N0:236、SEQ ID N0: 237、SEQ ID NO :238、SEQ ID NO :242、SEQ ID NO :243、SEQ ID NO :244、SEQ ID NO :245、 SEQ ID N0：38USEQ ID NO ：383,SEQ ID NO ：385,SEQ ID NO ：387,SEQ ID NO ：403,SEQ ID NO :405、或SEQ ID NO :407所示出的序列。
[0034] 在第十二实施方案中，本发明涉及包括本发明任何可操纵地连接到至少一个调控 序列上的分离多核苷酸的重组构建体。
[0035] 在第十三实施方案中，本发明涉及在其基因组中包括本发明重组构建体的宿主 细胞。更具体地讲，宿主细胞是包括本发明复合酶的重组微生物宿主细胞，其中第一酶活性 是Λ9延伸酶，第二酶活性是Λ8去饱和酶。在另一方面，第一酶活性是C20延伸酶，第二 酶活性是Λ 4去饱和酶。
[0036] 在第十四实施方案中，本发明涉及包括本发明重组构建体的转化过的耶氏酵母菌 种。
[0037] 在第十五实施方案中，本发明涉及用于转化细胞的方法，所述方法包括用本发明 重组构建体转化细胞以及选择那些用所述重组构建体转化过的细胞。
[0038] 在第十六实施方案中，本发明涉及用于生产转化植物的方法，所述方法包括用本 发明的任何多核苷酸转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。
[0039] 在第十七实施方案中，本发明涉及用于生产酵母的方法，包括用本发明的任何多 核苷酸转化酵母细胞以及从转化过的酵母细胞生长酵母。
[0040] 在第十八实施方案中，本发明涉及在其基因组中包括本发明重组构建体的植物。 还关注获自此类植物的种子，获自此类种子的油，掺入此类油的食物或饲料，以及掺入本发 明的油的饮料。
[0041] 在第十九实施方案中，本发明涉及编码如SEQ ID Ν0:183所示出的C20延伸酶的 分离核酸分子，其中至少147个密码子是经密码子优化的以用于在耶氏酵母菌种中表达。
[0042] 在第二十实施方案中，本发明涉及编码如SEQ ID N0:188所示出的C20延伸酶的 分离核酸分子，其中至少134个密码子是经密码子优化的以用于在耶氏酵母菌种中表达。
[0043] 在第二i^一实施方案中，本发明涉及编码如SEQ ID N0 :192所示出的Λ 4去饱和 酶的分离核酸分子，其中至少285个密码子是经密码子优化的以用于在耶氏酵母菌种中表 达。
[0044] 在第二十二实施方案中，本发明涉及用于制备复合酶的方法，所述方法包括：
[0045] (a)使第一多肽与至少第二多肽连接，其中每个多肽具有独立的和可分的酶活性； 并且
[0046] (b)评估步骤（a)产物的独立的和可分的酶活性。
[0047] 在第二十三实施方案中，本发明涉及用于改变油料种子植物的脂肪酸分布型的 方法，所述方法包括：
[0048] a)用本发明重组构建体来转化油料种子植物细胞；
[0049] b)从步骤（a)的转化油料种子植物细胞来再生植物，其中所述植物具有改变了的 脂肪酸分布型。
[0050] 在第二十四实施方案中，本发明涉及编码DGLA合酶的分离多核苷酸，所述多核苷 酸包括：
[0051] (a)编码具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽在SEQ ID N0 : 441、SEQ ID NO :454、SEQ ID NO :461、SEQ ID NO :464、SEQ ID NO :471、SEQ ID NO :515、 SEQ ID NO :516、SEQ ID NO :517、SEQ ID NO :518、或 SEQ ID NO :519 中示出；
[0052] (b)编码具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在SEQ ID N0:440、SEQ ID N0:446、SEQ ID N0:453、SEQ ID N0:460、SEQ ID N0:463、SEQ ID N0:470、 5Ε0ΙΟΝΟ:492、5Ε0ΙΟΝΟ:493、5Ε0ΙΟΝΟ:494、5Ε0ΙΟΝΟ :495、*5Ε0ΙΟΝΟ:496 φ* 出；
[0053] (c)编码具有DGLA合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条 件下与如 SEQ ID N0 :440、SEQ ID N0 :446、SEQ ID N0 :453、SEQ ID N0 :460、SEQ ID N0 : 463、SEQ ID N0:470、SEQ ID N0:492、SEQ ID N0:493、SEQ ID N0:494、SEQ ID N0:495、或 SEQ ID NO :496所示出的核苷酸序列杂交；或
[0054] (d) (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由 相同数目的核苷酸组成并且1〇〇 %互补。
[0055] 在第二十五实施方案中，本发明涉及用于将亚油酸转化成二高亚麻酸的方 法，所述方法包括
[0056] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0057] i)DGLA合酶，它包括：
[0058] 1)至少一个编码Λ 9延伸酶的多肽；
[0059] 2)至少一个编码Λ 8去饱和酶的多肽；并且
[0060] 3)多肤接头；
[0061] 其中所述接头插入Λ 9延伸酶和Λ 8去饱和酶之间；以及
[0062] ii)亚油酸源；并且
[0063] b)使（a)的宿主细胞在使得能产生二高亚麻酸的条件下生长。
[0064] 在第二十六实施方案中，本发明涉及用于将α-亚麻酸转化成二十碳三烯酸的 方法，所述方法包括：
[0065] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0066] i)DGLA合酶，它包括：
[0067] 1)至少一个编码Λ 9延伸酶的多肽；
[0068] 2)至少一个编码Λ 8去饱和酶的多肽；并且
[0069] 3)多肤接头；
[0070] 其中所述接头插入Λ 9延伸酶与Λ 8去饱和酶之间；以及
[0071] ii)a-亚麻酸源；以及
[0072] b)使（a)的宿主细胞在使得能产生二十碳三烯酸的条件下生长。
[0073] 在第二十七实施方案中，本发明涉及用于将二十碳五烯酸转化成二十二碳六烯酸 的方法，所述方法包括：
[0074] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0075] i)DHA合酶，其包括：
[0076] 1)至少一个编码C20延伸酶的多肽；
[0077] 2)至少一个编码Λ 4去饱和酶的多肽；并且
[0078] 3)多肤接头；
[0079] 其中所述接头插入C20延伸酶与Λ 4去饱和酶之间；并且
[0080] ii)二十碳五烯酸源；并且
[0081] b)使（a)的宿主细胞在使得能产生二十二碳六烯酸的条件下生长。
[0082] 在第二十八实施方案中，本发明涉及用于将花生四烯酸转化成二十二碳五烯酸的 方法，所述方法包括：
[0083] a)提供一种重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞包括：
[0084] i)DHA合酶，它包括：
[0085] 1)至少一个编码C20延伸酶的多肽；
[0086] 2)至少一个编码Λ 4去饱和酶的多肽；以及
[0087] 3)多肤接头；
[0088] 其中所述接头插入C20延伸酶与Λ 4去饱和酶之间；并且
[0089] ii)花生四烯酸源；以及
[0090] b)使（a)的宿主细胞在使得能产生二十二碳五烯酸的条件下生长。
[0091] 在第二十九实施方案中，本发明涉及用于鉴定具有改善的Λ4去饱和酶活性的多 肽的方法，所述方法包括：
[0092] a)提供一种野生型Δ 4去饱和酶多肽，它分离自Euglena anabena，具有基线Δ 4 去饱和酶活性；
[0093] b)使（a)的野生型多肽截短约1至约200个氨基酸以形成截短的突变型多肽，它 具有比基线Λ4去饱和酶活性更高的Λ4去饱和酶活性。
[0094] 在第三十实施方案中，本发明涉及微生物宿主细胞，所述宿主细胞产生多不饱和 脂肪酸并表达编码在以下连续途径中的酶的多肽：
[0095] 1) Λ 9去饱和酶，
[0096] 2) Λ 12去饱和酶，
[0097] 3) Λ 9 延伸酶，
[0098] 4) Λ 8去饱和酶，
[0099] 5) Δ 5去饱和酶，
[0100] 6) Λ 17去饱和酶，
[0101] 7)C2Q/22 延伸酶，和
[0102] 8) Δ 4去饱和酶；
[0103] 其中所述多肽包括至少一个复合酶、包括融合在至少一对相邻酶之间的融合区 域。
[0104] 牛物保藏
[0105] 下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection) (ATCC) (10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，并具有下 列名称、保藏号和保藏日期（表1)。
[0106] Μ 1
[0107] ATCC 保藏
[0108]
【权利要求】
1. 包含单一多肽的复合酶，所述多肽具有至少两种独立的和可分的酶活性，其中所述 酶活性是Λ 4去饱和酶和C2(l/22延伸酶，并且其中所述Λ 4去饱和酶和C2(l/22延伸酶通过连接 相连接，并且所述连接选自 SEQ ID NO :198、SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :235、SEQ ID NO : 438、SEQ ID NO :472、SEQ ID NO :445 和 SEQ ID NO :504。
2. 编码权利要求1的复合酶的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含： (a) 编码具有与 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:95、SEQ ID NO : 96 或 SEQ ID NO :97至少80%相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； (b) 如 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:92、 SEQ ID NO :93或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列；或 (c) 在严格条件下与如 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:205、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:91、 SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :93或SEQ ID NO :410所示出的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
3. 权利要求2的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO :12、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :96 或 SEQ ID NO :97 的核苷酸序列。
4. 权利要求3的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含如SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :93 或 SEQ ID NO :410 所示 出的核苷酸序列。
5. 包含权利要求2-4中任一项的分离多核苷酸的重组构建体，所述多核苷酸被可操作 地连接到至少一种调控序列上。
6. 包含权利要求5的重组构建体的宿主细胞。
7. 权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
8. 权利要求7的宿主细胞，其中所述植物细胞是油料种子植物细胞。
9. 权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
10. 权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞是含油酵母细胞。
11. 权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞是耶氏酵母细胞。
12. 用于转化细胞的方法，所述方法包括使用权利要求5的重组构建体来转化细胞以 及选择那些用所述重组构建体转化过的细胞。
13. 用于生产转化过的植物的方法，所述方法包括使用权利要求5的重组构建体来转 化植物细胞以及从所述转化过的植物细胞再生植物。
14. 包含权利要求5的重组构建体的植物。
15. 权利要求14的植物，其中所述植物是油料种子植物。
16. 权利要求15的植物，其中所述植物是大豆植物或向日葵植物。
17. 获自权利要求14的植物的种子，其中所述种子包含所述重组构建体。
18. 用于将二十碳五烯酸转化成二十二碳六烯酸的方法，所述方法包括： a) 提供包含权利要求5的重组构建体的重组微生物宿主细胞，和二十碳五烯酸源；并 且 b) 使（a)的宿主细胞在使得能产生二十二碳六烯酸的条件下生长。
【文档编号】C12R1/645GK104152423SQ201310495325
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2008年4月3日 优先权日:2007年4月3日
【发明者】H.G.达穆德, A.J.金尼, K.G.里普, Q.Q.朱 申请人:纳幕尔杜邦公司