表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组bcg活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用，本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及基因工程【技术领域】。本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗。本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，是将编码野生型金葡菌肠毒素蛋白的野生型金葡菌肠毒素基因序列或者编码突变型金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株；本发明还提供了该重组菌株的构建方法以及由其得到的活菌疫苗。该活菌菌株能够在细胞中表达分泌出金葡菌肠毒素蛋白，动物学实验证明，将其作为疫苗接种机体后，可以起到预防和治疗癌症的作用。
【专利说明】表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种利用基因工程技术构建获得的能够表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]癌症是威胁人类健康和生命的杀手，每年因患恶性肿瘤致死的病例已经上升到各种疾病的首位。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗。尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。由于肿瘤本身易转移和复发，使传统的手术、放疗和化疗效果有限。目前，肿瘤免疫治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫治疗包括抗体、细胞因子、疫苗和细胞治疗。它是一种新型的主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，肿瘤与机体之间的相互作用、肿瘤免疫耐受以及肿瘤抗原鉴定都取得了很大的进展，这也促进了肿瘤疫苗的发展。目前，很多抗肿瘤疫苗在动物水平和临床试验已取得令人鼓舞的效果。作为一种高效、无明显毒副作用的肿瘤免疫疗法已经成为了人类预防和治疗肿瘤疾病的必然趋势。
[0003]金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下简称金葡菌)分泌产生的外毒素，肠毒素是金葡菌在宿主体内导致疾病的主要原因。目前，已有超过17种金葡菌肠毒素获得鉴定，包括典型的肠毒素(SEA、SEB、SECs、SED和SEE)以及新发现的多种肠毒素蛋白(Letertre C，et al.J.Appl.Microbiol.2003, 95 (I): 38-43.)。
[0004]超抗原(Superantigen, SAg)是指一类只需极低浓度(l-lOng/ml)就可以激活大量的T细胞活化，产生极强的免疫应答的抗原因子。超抗原的作用途径不需要呈递细胞的加工处理，而是以完整的蛋白质形式呈递给T细胞，其一端与APC膜上的MHC II类分子的非多态区外侧结合形成超抗原MHC复合物，另一端直接与TCR的V β片段外侧结合，诱导免疫应答反应。
[0005]金葡菌肠毒素蛋白分子作为典型的超抗原物质，对宿主免疫系统具有强烈的免疫刺激作用。因此，肠毒素很早就开始作为新的抗肿瘤蛋白分子进行研究。肠毒素蛋白分子对肿瘤细胞的杀伤分子机制包括= (I)SAg依赖性细胞毒(SDCC)作用和SAg抗体依赖性细胞毒(SADCC)作用。由于SAg不需要抗原呈递细胞(APC)的处理，能以完整的蛋白质分子形式，一端在抗原结合沟外与APC上的MHC类分子连接，另一端仅与T细胞受体(Τ cell receptor, TCR)的νβ片段连接，不需APC处理，也不受MHC的限制，在APC外形成MHC类分子-SAg-TCR-v β复合物，在极低的摩尔浓度(10_12数量级)下便可刺激存在TCRvP序列的T淋巴细胞大量增殖，能够在短时间内直接激活具有很强杀伤力的CD8+细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)和与⑶4+相关的辅助性T细胞产生，以TCR-vβ-SAg-MHC-1I类分子的方式以及MHC-1I类分子相关的肿瘤细胞相偶联后产生强力的杀灭作用，对表达具有MHC-1I类分子有关的肿瘤细胞进行直接杀灭(Kuge S，et al.JImmunol.1995，154(4):1777-1785.)。(2)细胞因子的直接和间接杀伤作用。超抗原活化的于CD4+相关的T淋巴细胞能分泌包括TNF-α、TNF-β、INF1、IL_2、IL-6和IL-12等多种足量的细胞因子。它们不仅能通过直接作用或间接作用的方式杀伤肿瘤细胞，而且可以促使肿瘤细胞增加表达MHC类抗原分子，进一步增强对宿主免疫系统的刺激作用(Matsushita K, et al.Br J Cancer.1996，73 (5): 644-648.)。(3)超抗原刺激 T 细胞后，T细胞释放的IL-2、INF-gamma和IL-12等细胞因子，可产生广谱抗肿瘤的淋巴因子激活杀伤细胞(LAK),进一步产生 LAK 样细胞毒作用(Lando P, et al.Cancer Tmmunol Immunother.1991，33(4):231-237.)。
[0006]BCG (Bacillus Calmette_Gu6rin)作为预防结核病的疫苗已经得到广泛的使用。BCG作为重组疫苗载体具有其他疫苗载体不可比拟的优越性。BCG在全世界范围内应用最广泛，它是一种耐热活疫苗，生产成本低，且应用于实验动物和人体并发症少。因此，把BCG作为活菌疫苗载体，是目前构建重组疫苗的理想选择。
[0007]金葡菌肠毒素是典型的超抗原物质，极低的浓度就可以刺激机体大量T细胞活化，产生强烈的免疫应答反应，在肿瘤疾病免疫治疗过程中具有巨大的潜能。因此，如果能够使用BCG作为疫苗载体构建金葡菌肠毒素蛋白的活菌疫苗，将其接种机体后使之持续分泌表达金葡菌肠毒素蛋白，刺激机体免疫系统使其杀伤肿瘤细胞，将有望达到高效预防和治疗人类肿瘤疾病的发生的目的。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗，特别是提供一种能够胞外表达野生型金葡菌肠毒素蛋白或者突变型金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌疫苗。
[0009]为实现上述目的，本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将编码野生型金葡菌肠毒素蛋白的野生型金葡菌肠毒素基因序列或者编码突变型金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株，所述野生型金葡菌肠毒素基因序列是指野生型金葡菌肠毒素SEA、SEB、SEC2、SED、SEE基因序列，所述突变型金葡菌肠毒素基因序列是指采用PCR的方法引入突变位点对SEA的D227A，SEC2的T20L、T20L/G22E、G22E/N23A和T20L/G22E/N23A进行定点突变改造后所获得的编码低毒或无毒的金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列。
[0010]进一步地，所述突变型金葡菌肠毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列分别具有如SEQ ID N0:6-10所示的核苷酸序列。
[0011 ] 进一步地，所述重组BCG活菌菌株是将所述野生型金葡菌肠毒素基因序列或者所述突变型金葡菌肠毒素基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。
[0012]进一步地，所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上还连接有核苷酸序列如SEQIDNO: 11所示的BCG分泌信号肽基因序列。
[0013]本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤:
[0014](I)利用限制性内切酶和链接酶将核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-10所示的基因序列中的任一个以及核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示的BCG分泌信号肽基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，转化到大肠杆菌E.coli TOPlO中，获得正确的重组转化子;
[0015](2)将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定阳性转化子；
[0016](3)将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的金葡菌肠毒素蛋白情况。
[0017]进一步地，上述构建方法中所使用的BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为P丽234穿梭表达载体。
[0018]本发明还提供了一种活菌疫苗，其特征在于:所述活菌疫苗中含有上述重组BCG活菌菌株。
[0019]本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用，其应用方法是将该重组BCG活菌菌株辅以药学上可接受的佐剂制备成疫苗，该疫苗可单独使用也可联合其他药物或者放疗化疗一起使用，使用时经皮内注射，注射量以BCG活菌个数计为IO6CFU/人，可一次注射，也可分多次注射。
[0020]有益效果:
[0021]本发明成功将野生型和突变型金葡菌肠毒素基因导入BCG活菌菌株中得到了能够在BCG细胞中表达分泌出野生型和突变型金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株。动物学实验证明，将该重组BCG活菌菌株作为疫苗接种机体后，可持续分泌表达金葡菌肠毒素蛋白，刺激机体免疫系统使其杀伤肿瘤细胞，使癌症患者获得强大的免疫治疗，从而达到治疗癌症的目的。本方法为野生型和突变型金葡菌肠毒素蛋白BCG重组抗癌疫苗的生产及应用奠定了基础。`【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是金葡菌肠毒素CTG基因的重组穿梭表达分泌载体pMN- a -CTG的物理图谱；
[0023]图2是本发明重组BCG胞外表达突变型金葡菌肠毒素SEC2蛋白的Western blot鉴定图；
[0024]图3是本发明活菌疫苗治疗肿瘤模型的荷瘤大小比较；
[0025]图4是本发明活菌疫苗治疗肿瘤模型的荷瘤重量比较图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
[0027]以下实施例中所用原料来源
[0028]菌株与载体:大肠杆菌菌株E.coli T0P10由本实验室保存，耻垢分支杆菌、BCG由深圳市疾病预防控制中心惠赠。PMN234载体由北京蛋白质组学研究中心惠赠。
[0029]酶与试剂盒:限制性内切酶购自Fermentas公司，连接酶为NEB公司产品，Taq酶购自北京全式金生物科技有限公司。基因组提取试剂盒为OMEGA品牌产品。
[0030]生化试剂:DNA序列、引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述所有野生型金葡菌肠毒素基因由本实验室前期克隆获得。金葡菌肠毒素SEC2蛋白单克隆抗体为Santas公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。[0031]培养基:大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0 ；M7H9+ADC液体培养基:称取4.79Middlebrook7H9Broth,溶于900ml去离子水中，加入
0.2%的甘油和0.05%的Tween-80,121 °C高压灭菌30min，待冷却至45°C加入IOOmLADCEnrichment，4i5C 保存；M7H10+0ADC 固体培养基:称取 19g Middlebrook M7H10Agar，溶于900ml去离子水中，加入0.4%甘油和0.1%的Tween-80，混匀，121°C高压灭菌30min，待冷却至 50-55DC，加入 IOOmL OADC Enrichment，倒置平板。
[0032]实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如SambiOok等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0033]实施例1
[0034]野生型金葡菌肠毒素SEA、SEC2基因脱毒突变改造
[0035]根据相关文献报道(VladimirS，et al.Toxicon.2004，43:433-438.等)及抗原表位分析网站(http://www.epipredict.de/)预测结果，对野生型金葡菌肠毒素SEA、SEC2基因序列(GenBank登陆号:NM—001126112)进行基因改造，改造位点为SEA的(D227A)、SEC2的(T20L ；T20L/G22E ；G22E/N23A ；T20L/G22E/N23A)氨基酸位点。
[0036]1.设计引物
[0037]利用Gene Tool软件设计相关突变引物，结果如下: [0038](I)SEA基因D227A单一位点突变引物
[0039]Forward:
[0040]5’-tgctatatatttatatacaagttaagtcgacaagctt-3J
[0041]Reverse:
[0042]5’-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3’
[0043](2) SEC2基因T20L单一位点突变引物
[0044]Forward:
[0045]5’-tttaatgggtaatatgaaatatttatatgatgatca-3?
[0046]Reverse:
[0047]5’-ccagtaaactcacttgatttgtgcaactc-3’
[0048](3) SEC2基因T20L/G22E双位点突变引物
[0049]Forward:
[0050]5’-tttaatggagaatatgaaatatttatatgatgatca-3?
[0051]Reverse:
[0052]5’-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3’
[0053](4) SEC2基因G22E/N23A双位点突变引物
[0054]Forward:
[0055]5’-tacgatggaggcaatgaaatatttatatgatg-3J
[0056]Reverse:
[0057]5’-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3’
[0058](5) SEC2基因T20L/G22E/N23A三个位点突变引物
[0059]Forward:[0060]5' -tttaatggaggcaatgaaatatttatatgatg-3'
[0061]Reverse:
[0062]5' -atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3'
[0063]以上突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
[0064]2.SEA、SEC2基因各位点基因改造
[0065]利用上述引物对肠毒素SEA、SEC2基因进行定点突变PCR扩增，对扩增产物进行回收、连接、转化，最终对转化子进行鉴定。具体操作方法及步骤如下:
[0066](I) 25μ I的PCR引入突变反应体系为:
[0067]
【权利要求】
1.一种重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将编码野生型金葡菌肠毒素蛋白的野生型金葡菌肠毒素基因序列或者编码突变型金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株，所述野生型金葡菌肠毒素基因序列是指野生型金葡菌肠毒素5E4、SEB、SEC2、SED、5^基因序列，所述突变型金葡菌肠毒素基因序列是指采用PCR的方法引入突变位点对的m2UEC2的T20L、T20L/G22E、G22E/N23A和T20L/G22E/N23A进行定点突变改造后所获得的编码低毒或无毒的金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素C20、CTG、CGN、C3基因序列。
2.根据权利要求1所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于:所述突变型金葡菌肠毒素A227, C20、CTG、CGN、C3基因序列分别具有如SEQ ID N0:6-10所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将所述野生型金葡菌肠毒素基因序列或者所述突变型金葡菌肠毒素基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。
4.根据权利要求3所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于:所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上还连接有核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示的BCG分泌信号肽基因序列。
5.一种活菌疫苗，其特征在于:含有权利要求1至4任一项所述的重组BCG活菌菌株。
6.权利要求4所述的重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤: (1)利用限制性内切酶和链接酶将核苷酸序列如SEQID NO: 1-10所示的基因序列中的任一个以及核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示的BCG分泌信号肽基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，转化到大肠杆菌万.coli TOPlO中，获得正确的重组转化子； (2)将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定阳性转化子； (3)将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的金葡菌肠毒素蛋白情况。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于:所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为PMN234穿梭表达载体。
8.权利要求1至4任一项所述的重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用。
【文档编号】C12R1/07GK103497927SQ201310495347
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】胡章立, 李勇 申请人:深圳大学