高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。具体地，本发明对大肠杆菌内源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径进行改造，利用改造后的大肠杆菌底盘细胞进行萜类化合物的高效生物合成，前体途径的改造主要是充分挖掘自然界中其他微生物来源的MEP前体途径基因模块，筛选特性优良的基因模块在大肠杆菌中进行表达，同时在改造后的底盘细胞中集成组装萜类化合物的下游合成途径，包括倍半萜类化合物如紫槐二烯，二萜类化合物如贝壳烯，四萜类化合物如番茄红素，多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物等。本发明的大肠杆菌底盘细胞能够显著提高萜类化合物的合成。
【专利说明】高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于合成生物学及工业生物学【技术领域】，具体地，本发明涉及一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。
【背景技术】
[0002]合成生物学是基于理性的设计，将标准化的生物元件进行集成与装配，从而构建性能优良的人造生命系统。合成生物学一经诞生，它的思想和设计就深刻地影响着工业微生物技术的发展，使微生物技术在药物，生物燃料，精细化学品的开发与生产过程中发挥出更加巨大的作用。
[0003]美国加州大学伯克利分校的Keasling实验室，将黄花蒿来源的紫槐二烯合成酶基因(ads)，紫槐二烯氧化酶基因(cyp71avl)以及细胞色素P450还原蛋白基因(cpr)置于酵母细胞调控元件下，最终在酵母工程菌中组装了一条青蒿酸的异源合成途径并成功地合成了青蒿酸。随后，麻省理工学院和塔夫茨大学的合作者在大肠杆菌中重建了紫杉醇前体-紫杉二烯的合成途径，结合对工程菌株的一系列改造，最终使得紫杉二烯的产量超过了 lg/L。这些研究表明结合合成生物学的设计以及成熟的微生物基因工程技术，可以打破了种属的界限，实现各种来源珍稀化合物在通用微生物底盘细胞中的高效合成。
[0004]萜类化合物是种类最多，结构最丰富，功能最多样的天然产物，是药物，芳香物质，食品添加剂，橡胶以及生物燃料的重要来源。目前已被发现的萜类化合物超过40，000种，它们广泛地存在于植物中，同时真菌和细菌中也有越来越多的萜类化合物被报道。萜类化合物由通用的异戊酰焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)前体单元(C5)通过次序叠加合成。根据叠加的前体单元数量不同，分为半萜(C5)，单萜(ClO)，倍半萜(C15)，二萜(C20)，三萜(C20)，四萜(C40)，多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物等。越来越多的萜类化合物被发现具有治疗和防控多种疾病的功能，比如抗癌，抗微生物，抗真菌，抗寄生虫，抗病毒，抗炎，免疫调节等。但这些化合物在原产植株或微生物中的合成往往受到严格的调控，含量低，且具有明显的季节性，严重地制约了进一步的开发利用。以太平洋红豆杉来源的紫杉醇为例，作为有效的抗药药物，该化合物非常微量地分布在太平洋红豆杉的树皮中，1200kg的树皮只能提取IOg纯的紫杉醇。
[0005]在传统的模式微生物中，大肠杆菌是一种常用的异源合成底盘细胞。它具有清晰的遗传背景、成熟的基因操作技术与工具、丰富的基因表达元件，可靠经济的大规模发酵技术。大肠杆菌采用2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径合成IPP/DMAPP前体单元，但原始大肠杆菌细胞的MEP途径只有极低的表达水平，仅能维持很低的前体供应，无法满足萜类化合物的高效合成。Yuan等人用染色体工程的方法，采用T5启动子替换MEP途径相关基因的原始启动子，以逐个强化MEP途径基因，并鉴定了途径中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)，4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤藓糖醇合成酶基因(ispD)，2-甲基赤藓糖醇-2，4-环焦磷酸合成酶基因(ispF)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(idi)是限速步骤，共同强化这四个基因的表达，能够有效改善番茄红素的合成。基于Yuan等研究结果，MIT的研究人员将大肠杆菌内源dxs，ispD, ispF, idi基因串联成一个操纵子，并结合启动子工程，基因拷贝数调节等手段，最终获得工程菌经补料分批发酵后获得了 >lg/L的紫杉二烯。这一系列对MEP途径的改造，虽取得了很大的成功，但是获得的底盘细胞仍无法满足萜类化合物大规模生产的要求。而且针对大肠杆菌内源MEP途径调控机制及酶学特性仍缺乏足够的了解，仅仅依赖某些限速步骤基因表达的强化无法彻底地解除途径中可能存在的未知调控，因此也就无法完全打开MEP途径的代谢通量并实现更高产萜类化合物底盘细胞的构建。
[0006]因此，本领域目前还没有一种有效的可靠的合成生物学与工业微生物技术，大规模生产萜类化合物。因此迫切需要构建能够异源合成萜类化合物的重组微生物工程菌，从而实现廉价，全天候，大规模生产萜类化合物。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是提供一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。
[0008]在本发明的第一方面，提供了一种底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
[0009]在另一优选例中，所述的底盘细胞是用于生产萜类化合物的底盘细胞，并且所述的基因是选自下述的至少一个基因或其组合:
[0010]来源于阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD 基因；
[0011]来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxr、ispD、idil、或idi2基因；
`[0012]来源于欧文氏菌ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因；
[0013]来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；
[0014]来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因。
[0015]在另一优选例中，所述的底盘细胞为真核细胞(如酵母细胞)或原核细胞(如枯草芽孢杆菌细胞、大肠杆菌细胞)；较佳地为大肠杆菌细胞。
[0016]在另一优选例中，所述的真核细胞为酵母细胞。
[0017]在另一优选例中,所述的原核细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
[0018]在另一优选例中,所述的底盘细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
[0019]在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组:半萜(C5)类化合物、单萜(ClO)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C20)类化合物、四萜(C40)类化合物、多萜类化合物、其他萜类生物碱化合物或其组合。
[0020]在另一优选例中，所述的基因选自下组:
[0021](I)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因；(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因；(3)枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；(4)上述(1)-(3)基因的任意组合。
[0022]在另一优选例中，所述的底盘细胞含有多拷贝的提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
[0023]在另一优选例中，所述的基因为:
[0024](I)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因的组合；(2)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；(3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；⑷阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
[0025]在另一优选例中，所述的底盘细胞还包括任选自下组的基因或其组合:
[0026]来源于阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxr、或 ispD 基因；
[0027]来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxr、ispD、idil、或idi2基因；
[0028]来源于欧文氏菌的ispD基因；
[0029]来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；和/或
[0030]所述的底盘细胞还含有其它甲羟戊酸途径(MVA途径)和/或非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的酶。
[0031]在另一优选例中，所述的基因为外源基因。
[0032]在另一优选例`中，所述的萜类化合物选自下组:半萜(C5)类化合物、单萜(ClO)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C20)类化合物、四萜(C40)类化合物、多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物或其组合。
[0033]在另一优选例中，所述的倍半萜(C15)类化合物为紫槐二烯。
[0034]在另一优选例中，所述的四萜(C40)类化合物为番茄红素。
[0035]在另一优选例中，所述的二萜(C20)类化合物为贝壳烯。
[0036]在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组:紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
[0037]在本发明的第二方面，提供了一种生产萜类化合物的方法，所述方法包括步骤:
[0038](a)在适合表达的条件下，培养本发明第一方面所述的底盘细胞，获得含有萜类化合物的培养物；
[0039](b)从步骤(a)的培养物中分离出所述的萜类化合物；
[0040]其中，在步骤(a)中所述的底盘细胞含有或不含有外源的萜类化合物合成基因模块。
[0041]在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组:紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
[0042]在本发明的第三方面，提供了一种基因的用途，所述基因选自下组:
[0043]来源于阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD基因；来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因；来源于欧文氏菌ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 idi 基因；来源于枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因；和/或上述基因的任意组合，所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
[0044]在另一优选例中，所述基因用于制备生产萜类化合物能力被提高的底盘细胞。
[0045]在另一优选例中，所述的基因选自下组:(I)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的 dxs2 基因；(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi基因;(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；(4)上述(1)-(3)基因的任意组合；在另一优选例中，所述的底盘细胞为真核细胞(如酵母细胞)或原核细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞)。
[0046]在另一优选例中，所述的底盘细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
[0047]在另一优选例中，所述的基因任选自下组:
[0048](I)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因的组合；
[0049](2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
[0050](3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
[0051](4)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
[0052]在另一优选例中，所述的基因还包括任选自下组的基因或其组合:
[0053]来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的 dxs、dxr、ispD、ispF、或 idi 基因；
[0054]来源于阿维链霉菌(Streptomyc`esavermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0055]来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；
[0056]来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的 dxs、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0057]来源于欧文氏菌的dxs、dxr、或ispD基因；
[0058]来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
[0059]在本发明的第四方面，提供了一种分离的基因组合，所述的基因组合为:
[0060]阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的任意组合。
[0061]在另一优选例中，所述的组合为2个或多个基因的组合。
[0062]在另一优选例中，所述的基因组合任选自下组:
[0063](I)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因的组合；
[0064](2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
[0065](3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
[0066](4)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加；
[0067](5)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的叠加；[0068](6)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的叠加。
[0069]在另一优选例中，所述的基因组合还包括任选自下组的基因或其组合:
[0070]来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的 dxs、dxr、ispD、ispF、或 idi 基因；
[0071]来源于阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0072]来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；
[0073]来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的 dxs、dxr、ispD、或 ispF 基因；
[0074]来源于欧文氏菌的dxs、dxr、或ispD基因；
[0075]来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
[0076]在本发明的第五方面，提供了一种载体或载体混合物，所述的载体或载体混合物含有第四方面所述的基因组合。
[0077]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0078]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0079]图1为MEP 前体途径及下游萜类合成途径示意图。
[0080]图2为MEP前体途径不同种属来源的dxs模炔基因的表达结果，泳道M:piOteinmarker ;泳道1:ControI ;泳道2:Escherichia coli dxs ;泳道3:Bacillus subtilis dxs ；泳道 4:Erwinia taxi ATCC55669dxs ;泳道 5:Streptomyces avermitilis dxsl ;泳道 6:Streptomyces avermitilis dxs2 ;泳道 7:Saccharopolyspora erythraea dxs。
[0081]图3为MEP前体途径不同种属来源的dxr模炔基因的表达结果，泳道M:piOteinmarker ;泳道1:ControI ;泳道2:Escherichia coli dxr ;泳道3:Bacillus subtilis dxr ；泳道4:Erwinia taxi ATCC55669strain dxs ;泳道5:Streptomyces avermitilis dxr ;泳道 6 -Saccharopolyspora erythraea dxr。
[0082]图4为MEP前体途径不同种属来源的ispD模炔基因的表达结果，泳道M:proteinmarker;泳道 I: Contro I ;泳道 2:Escherichia coli ispD ;泳道 3:Bacillus subtilisispD ;泳道 4:Erwinia taxi ATCC55669strain ispD ;泳道 5:Streptomyces avermitilisispD ;泳道 6-Saccharopolyspora erythraea ispD。
[0083]图5为MEP前体途径不同种属来源的ispF模炔基因的表达结果，泳道M:piOteinmarker;泳道 I: Contro I ;泳道 2:Escherichia coli ispF ;泳道 3:Bacillus subtilisispF ;泳道 4:Streptomyces avermitilis ispF ;泳道 6:Saccharopolyspora erythraeaispF。
[0084]图6为MEP前体途径不同种属来源的idi模炔基因的表达结果；泳道M:piOteinmarker ;泳道1:ControI ;泳道2:Escherichia coli idi ;泳道3:Bacillus subtilis idi ；泳道4:Streptomyces avermitilis idi ;泳道5:Saccharopolyspora erythraea idil ;泳道 6:Saccharopolyspora erythraea idi2 ;泳道 7:Staphylococcus aureus idi。
[0085]图7为不同dxs基因模块对番茄红素合成的影响。
[0086]图8为不同dxr基因模块对番茄红素合成的影响。
[0087]图9为不同ispD基因模块对番爺红素合成的影响。
[0088]图10为不同ispF基因模块对番爺红素合成的影响。
[0089]图11为不同idi基因模块对番爺红素合成的影响。
[0090]图12为不同基因模块共表达对番茄红素合成的影响。
[0091]图13为不同重要基因模块对紫槐二烯合成的影响。
[0092]图14为不同重要基因模块共表达对紫槐二烯合成的影响。
[0093]图15为不同重要模炔基因对贝壳烯合成的影响。
【具体实施方式】
[0094]本发明人经过广泛而深入的研究，首次对大肠杆菌内源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径进行改造，利用改造后的大肠杆菌底盘细胞进行萜类化合物的高效生物合成；前体途径的改造主要是充分挖掘自然界中其他微生物来源的MEP前体途径基因模块，筛选特性优良的基因模块在大肠杆菌中进行表达，同时在改造后的底盘细胞中集成组装萜类化合物的下游合成途径，包括倍半萜类化合物紫槐二烯，二萜类化合物贝壳烯，四萜类化合物番茄红素。本发明的大肠杆菌底盘细胞能够显著提高萜类化合物的合成。在此基础上完成了本发明。
[0095]本发明采取的技术方案是:
[0096]一种挖掘自然界MEP前体途径基因模块的，筛选性能优良的基因模块，进而将这些模块运用于大肠杆菌MEP途径改造的方法，包括选取了阿维链霉菌(dxsl，dxs2, ispD,ispF, idi)，红霉糖多孢菌(dxs, ispD, ispF, idil, idi2)，欧文氏菌(dxs, dxr, ispD)，枯草芽孢杆菌(dxs，ispD, ispF, idi)以及金黄色葡萄球菌(idi)等基因，同时选取大肠杆菌(dxs, ispD, ispF, idi)基因作为对照。通过克隆以上基因，然后将相关质粒与含有番茄红素合成途径的PAC-LYC质粒共同转化大肠杆菌细胞，筛选出能够明显改善番茄红素产量的基因，然后选取能够明显改善番茄红素基因，用于倍半萜前体紫槐二烯、二萜前体贝壳烯的异源合成，同时将效果特别明显的基因进行共强化进一步提高这些萜类化合物的合成。
[0097]MEP途径和MVA途径
[0098]如本文所用，术语“MEP途径”是指2-C-甲基-D-赤藻糖醇_4_磷酸途径，术语“MVA途径”是指甲羟戊酸途径。MEP途径和MVA途径是自然中的两条萜类化合物通用前体的合成途径，其中MEP途径主要存在于各种真细菌，蓝藻及植物质体中，真核细菌尤其是链霉菌具有比较丰富的萜类次级代谢。相对于本身不产萜类化合物的大肠杆菌来说，这些萜类代谢丰富微生物其MEP途径在表达调控，酶活特性上表现出一定的特性。同时丰富的天然基因资源也为大肠杆菌中MEP途径的改造提供了丰富的元件库。因此有效的挖掘这些资源，并用于大肠杆菌MEP途径的改造，是构建萜类高产底盘细胞的有效途径(图1)。
[0099]底盘细胞
[0100]本发明提供 了一种用于萜类化合物的合成的底盘细胞及其应用，
[0101]如本文所用，术语“底盘细胞” “宿主细胞” “工程细胞”可以互换使用，指合成生物学中一种可搭配不同的功能模块从而生产所需产品或实现所需功能的宿主细胞。这种细胞可以是天然来源的生物细胞，也可以是在天然来源的生物细胞基础上经过了一定改良操作得到的细胞，如基因元件的增减和优化。
[0102]在本发明中，所述底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
[0103]所述的底盘细胞为真核细胞或原核细胞；真核细胞可以为如酵母细胞；原核细胞可以为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
[0104]在本发明的一个优选例中，底盘细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0105]在本发明的一个优选例中，所述的基因选自下组:阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的 dxs2 基因;阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；上述基因的任意组合。
[0106]在本发明的一个优选例中，底盘细胞含有多拷贝的提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
[0107]优选地，所述的基因为:阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 dxs2 基因和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
[0108]更优选地，底盘细胞还包括任选自下组的基因或其组合:来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因；来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因；来源于欧文氏菌(Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD` 基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的 idi 基因。
[0109]更优选地，所述的底盘细胞还含有其它甲羟戊酸途径(MVA途径)和/或非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的酶。
[0110]在本发明中，所述的萜类化合物优选地选自下组:半萜(C5)类化合物、单萜(ClO)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C30)类化合物、四萜(C40)类化合物、或多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物。
[0111]优选地，单萜类化合物为异戊二烯、柠檬烯、薄荷醇等；倍半萜(C15)类化合物为紫槐二烯；四萜(C40)类化合物为番茄红素；二萜(C20)类化合物为贝壳烯(甜菊糖前体)、紫杉二烯(紫杉醇前体)、海松二烯等；四萜(C40)类化合物为番茄红素、β -胡萝卜素、虾青素等；多萜类化合物为杜仲胶等，以及萜类生物碱为喜树碱等。
[0112]本发明优选的萜类化合物选自下组:紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
[0113]基因用途
[0114]本发明还提供了一种基因的用途，所述基因选自下组:阿维链霉菌(Sti^ptomycesavermitilis)来源的 dxs2 基因;阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；上述基因的任意组合；所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
[0115]在另一优选例中，所述的基因任选自下组:阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的 dxs2 基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的 idi 基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 dxs2 基因的叠加。
[0116]在另一优选例中，所述的基因还包括任选自下组的基因或其组合:来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；来源于欧文氏菌(Erwiniataxi ATCC55669)的dxs、dxr、或ispD基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的 idi 基因。
[0117]基因组合
[0118]本发明还提供了一种分离的基因组合，所述的基因组合为:阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 dxs2 基因、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的idi基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的任
意组合。
[0119]优选地，所述的组合为2个或多个基因的组合。
[0120]较佳地，所述的基因组合任选自下组:阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 dxs2 基因的叠加；阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的idi基因的叠加；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的叠加。
[0121]如本文所用，术语“叠加”指将某一基因A与一种或多种其他基因进行组合(combine)，从而构成一组合形式(combination)。较佳地，进行叠加的基因是与生产胳类化合物相关的基因，包括本发明中提及的任一基因。此外，该术语还包括基因A与基因A进行叠加的情况。
[0122]所述的基因组合还可以包括任选自下组的基因或其组合:来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxsl、dxr、ispD、或 ispF 基因；来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxs、dxr、ispD、ispF、idil、或 idi2 基因；来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；来源于欧文氏菌ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 dxs、dxr、或 ispD 基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 idi 基因。
[0123]本发明还提供了一种载体或载体混合物，所述的载体或载体混合物含有本发明所述的基因组合。[0124]根据本文所述的各种基因或基因组合，本【技术领域】人员可方便地用各种已知方法制得其编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。
[0125]作为本发明的一种实施方式，可通过PCR的方法来构建本发明的基因序列。
[0126]载体及宿主细胞
[0127]本发明还提供了一种载体或载体混合物，所述的载体或载体混合物含有本发明所述的基因组合，还优选地包含与基因序列操作性相连的表达调控序列。
[0128]所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的基因序列插入合适的限制性位点，制得重组表达载体。
[0129]本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明上述的载体；或其染色体上整合有本发明所述的基因或基因组合。
[0130]本发明的宿主细胞可以原核细胞或真核细胞(例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等)。本发明优选原核细胞，更优选大肠杆菌细胞。
[0131]将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于:磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
[0132]有关宿主细胞的培养和表达可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液，可通过凝胶电泳技术进行鉴定。
[0133]应用
[0134]本发明提供了一种生产萜类化合物的方法，所述方法包括步骤:
[0135](a)在适合表达的条件下，培养本发明第一方面所述的底盘细胞，获得含有萜类化合物的培养物；
[0136](b)从步骤(a)的培养物中分离出所述的萜类化合物；
[0137]其中，在步骤(a)中所述的底盘细胞含有或不含有外源的萜类化合物合成基因模块。
[0138]所述的“萜类化合物合成基因模块”指利用萜类前体(如异戊烯焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP))合成萜类化合物、衍生物所需要的基因、基因蔟、操纵子。
[0139]在本发明的一个优选例中，所述的萜类化合物选自下组:紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
[0140]本发明的主要优点:
[0141](I)本发明通过对自然界MEP途径基因的大量挖掘，提供了大肠杆菌MEP途径改造中具有重要价值的多种基因，这些基因为大肠杆菌MEP途径的改造提供了丰富的资源；
[0142](2)本发明提供了基因能明显改善萜类合成的能力，可以用于大肠杆菌的精细改造，比如结合启动子工程，染色体工程等；
[0143](3)本发明提供的闻效转化的大肠杆菌底盘细胞，能够有效的表达番爺红素、紫槐二烯以及贝壳烯的合成，从而用于萜类化合物的大规模工业化生产。[0144]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0145]实施例1
[0146]不同菌株来源MEP途径基因的克隆
[0147]表1
[0148]
【权利要求】
1.一种底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
2.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞是用于生产萜类化合物的底盘细胞，并且所述的基因是选自下述的至少一个基因或其组合: 来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD 基因； 来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因； 来源于欧文氏菌 ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因； 来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因； 来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因。
3.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞为真核细胞(如酵母细胞)或原核细胞(如枯草芽孢杆菌细胞、大肠杆菌细胞)；较佳地为大肠杆菌细胞。
4.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的萜类化合物选自下组:半萜(C5)类化合物、单萜(ClO)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C20)类化合物、四萜(C40)类化合物、多萜类化合物、其他萜类生物碱化合物或其组合。
5.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的基因选自下组: (1)阿维链霉菌(Strep`tomycesavermitilis)来源的 dxs2 基因； (2)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的 idi 基因； (3)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的idi基因； (4)上述(1)-(3)基因的任意组合； 较佳地，所述的基因是选自下组的基因组合: (1)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 idi 基因的组合； (2)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合； (3)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合； (4)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
6.如权利要求1或5所述的底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞还含有任选自下组的基因或其组合: 来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因； 来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因； 来源于欧文氏菌 ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因； 来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；和/或所述的底盘细胞还含有其它甲羟戊酸途径(MVA途径)和/或非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的酶。
7.—种生产萜类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (a)在适合表达的条件下,培养权利要求1-6中任一所述的底盘细胞,获得含有職类化合物的培养物； (b)从步骤(a)的培养物中分离出所述的萜类化合物； 其中，在步骤(a)中所述的底盘细胞含有或不含有外源的萜类化合物合成基因模块。
8.一种基因的用途，其特征在于，所述基因选自下组: 来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的 dxs2、id1、dxr、或 ispD 基因； 来源于红霉糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)的 dxr、ispD、idil、或 idi2 基因； 来源于欧文氏菌 ATCC55669 (Erwinia taxi ATCC55669)的 ispD 基因； 来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因； 来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因；和/或 上述基因的任意组合， 其特征在于，所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
9.一种基因的用途，其特征在于，所述基因选自下组: (1)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的 dxs2 基因； (2)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的 idi 基因； (3)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的idi基因; (4)上述(1)-(3)基因的任意组合； 所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
10.一种分离的基因组合，其特征在于，所述的基因组合为:阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的 dxs2 基因、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的idi基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的任意组合。
11.一种载体或载体混合物，其特征在于，所述的载体或载体混合物含有权利要求10所述的基因组合。
【文档编号】C12P5/00GK103773729SQ201310501221
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】王勇, 熊智强, 李诗渊, 汪建峰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院