胶质瘤细胞系及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种胶质瘤细胞系，所述胶质瘤细胞系为感染了病毒载体的胶质瘤细胞；所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR。这种胶质瘤细胞系被光感基因特异性标记，可以在光的诱导刺激下可以产生稳定的光电流，从而可以通过光来对这种胶质瘤细胞系进行选择性特异调控。本发明还提供了一种上述胶质瘤细胞系的构建方法。
【专利说明】胶质瘤细胞系及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种胶质瘤细胞系及其构建方法。
【背景技术】
[0002]胶质瘤作为神经系统肿瘤来源于胶质细胞或未成熟的前体细胞，具有特殊的电生理学特性和膜通道性质，细胞膜离子通道的开放和关闭可以影响细胞的极化状态和兴奋性，进而影响细胞内的分子信号通路，从而在胶质瘤的存活，生长，转移中发挥重要作用。已有的研究也证实，癌症细胞的恶性增殖程度多涉及细胞自身兴奋性的改变；如肿瘤细胞自身膜电位的改变会影响肿瘤干细胞增殖和分化的效率。早期的研究表明电压依赖型钾离子通道可以调控神经细胞有丝分裂周期，采用钾离子通道阻断剂和去极化剂可以阻断钾离子通道从而有效抑制少突胶质细胞的增殖；另外，钙激活的瞬时受体电位通道(TRPC)通道也被证明在胶质瘤的生长特别是细胞周期中G2/M期的转变中发挥重要作用，通过抑制TRPC通道的活性，不仅抑制了胶质瘤细胞的体外增殖，同时还减少了皮下肿瘤和颅内肿瘤的体积,造成了瘤体积的缩小。[0003]同正常胶质细胞相比，胶质瘤细胞表面缺乏正常胶质细胞表达的K4.1通道，这类内向整流型钾离子内流通道在胶质瘤表达的缺失导致细胞的生长失去控制，若将功能性K4.1通道转回胶质瘤细胞可以显著抑制胶质瘤细胞的生长。因此，通过影响胶质瘤细胞的兴奋性和调控细胞膜离子通道开放可以影响胞内的分子传导通路传导，进而可以达到抑制肿瘤生长的目的。
[0004]传统的影响胶质瘤细胞的兴奋性和调控细胞膜离子通道开放的方法，多通过离子通道的兴奋剂和抑制剂完成，然而，离子通道的兴奋剂和抑制剂多不具有组织特异性和胶质瘤细胞选择性，具有副作用大等缺点。因此，目前缺乏一种能够被选择性特异调控的胶质瘤细胞系。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种能够被选择性特异调控的胶质瘤细胞系及其构建方法。
[0006]一种胶质瘤细胞系，所述胶质瘤细胞系为感染了病毒载体的胶质瘤细胞；
[0007]所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR。
[0008]在一个实施例中，所述启动子为c-fos，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。
[0009]在一个实施例中，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87或人胶质瘤细胞H4。
[0010]一种胶质瘤细胞系的构建方法，包括如下步骤:
[0011]将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒以及与病毒包装相关的混合质粒PCMVAR8.74和pMD2.G.—起，用脂质体一起转染至293FT细胞中，然后将所述293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，所述上清液中含有用于感染胶质细胞的病毒载体，所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR ；[0012]用所述病毒载体感染胶质瘤细胞，得到所述胶质瘤细胞系。
[0013]在一个实施例中，所述启动子为c-fos，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。
[0014]在一个实施例中，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87或人胶质瘤细胞H4。
[0015]这种胶质瘤细胞系被光感基因特异性标记，可以在光的诱导刺激下可以产生稳定的光电流，从而可以通过光来对这种胶质瘤细胞系进行选择性特异调控。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为病毒载体感染离体小鼠胶质细胞48hr后的明场照片(BF)和荧光(FL)照片对比图；
[0017]图2为采用激光刺激装置对实施例1得到的胶质细胞进行蓝光刺激，得到的刺激电流和内向光电流的对比图；
[0018]图3为采用蓝光持续刺激胶质瘤细胞lh，24h后对胶质瘤细胞的存活率进行分析得到的对照图；
[0019]图4a~图4e为蓝光照射肿瘤细胞后，引起胶质瘤细胞存活率下降，通过TUNEL染色得到的染色照片；其中，图4a为空白对照组不经过光照，图4b为空白对照组蓝光照射，图4c为绿色荧光标记基因表达组经过蓝光照射，图4d为光敏基因表达组不经过光照，图4e为光敏基因表达组经过蓝光照射。
【具体实施方式】
[0020]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0021]一实施方式的胶质瘤细胞系，该胶质瘤细胞系为感染了病毒载体的胶质瘤细胞。
[0022]病毒载体中包括依次连接的ITR (inverted terminal repeat,反向终端重复序列)、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR。
[0023]本实施方式中，启动子为c-fos，光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。
[0024]本实施方式中，病毒载体为慢病毒lent1-virus载体。
[0025]光感基因调控技术是近几年快速发展的一种新兴技术，其原理是基于基因治疗的方法给哺乳动物细胞转入不同的对光敏感的基因，通过不同波长的光对特定细胞类型活性进行调控。Channelrhodopsin-2 (ChR2)编码阳离子通道蛋白，493nm波长的蓝光光照后使阳离子进入细胞，而兴奋细胞活性。
[0026]ChETA把ChR2的E123突变为苏氨酸或丙氨酸，提高了对频率较高的光照的敏感性和稳定性。利用光感基因ChETA的电传导性和快速动力学特性，不仅可以实现通过光来诱导神经元产生动作电位，还可以调控神经系统的兴奋性和突触的传递性。
[0027]本实施方式中，胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87或人胶质瘤细胞H4。[0028]这种胶质瘤细胞系被光感基因特异性标记，可以在光的诱导刺激下可以产生稳定的光电流，从而可以通过光来对这种胶质瘤细胞系进行选择性特异调控。
[0029]具体而言，这种胶质瘤细胞系可以被波长为470nm的蓝光特异性刺激，产生光电流。
[0030]上述胶质瘤细胞系的构建方法，包括如下步骤:
[0031]S10、将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒以及与病毒包装相关的混合质粒PCMVAR8.74和pMD2.G.一起，用脂质体一起转染至293FT细胞中，然后将293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，上清液中含有用于感染胶质细胞的病毒载体，病毒载体中包括依次连接的反向终端重复序列ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和反向终端重复序列ITR。
[0032]具体而言,将该转染后的293FT细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株。转染24小时后，将培养293FT细胞的培养液换成无血清含有5mM丙酮酸钠的DMEM培养液后继续孵育16小时。
[0033]然后，用超速离心机对上述293FT细胞进行破膜得到细胞悬液，将该细胞悬液通过20%的蔗糖滤柱，收集上清，得到含有携带光敏基因的病毒的细胞液。该病毒滴度能达3X IO8TUAiL以上，用灭菌的磷酸盐缓冲液重悬含有携带光敏基因的病毒的细胞液得到重悬液，其中含有携带光敏基因的病毒的细胞液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1000。
[0034]本实施方式中，启动子为c-fos，光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。
[0035]本实施方式中，病毒为慢病`毒lent1-virus。
[0036]本实施方式中，包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒通过如下步骤制备得到:将人源化c-fos-ChETA密码子(由Stanford大学KarlDeisseroth教授的实验室2007年馈赠，GENE ID: 2353)通过Hindi 11/BamHI酶切位点融入到开放型框架质粒pCS2-eYFP-1TR(于2008年从Clotech公司购得)的N末端。
[0037]构建成功后的融合质粒通过Qiagen公司的maxiprep试剂盒纯化扩增，PCR扩增的正向引物序列为SEQ ID N0.1所示的序列，反向引物序列为SEQ ID N0.2所示的序列，目标产物的大小为3.6kb。
[0038]S20、用SlO得到的病毒载体感染胶质瘤细胞，得到胶质瘤细胞系。
[0039]本实施方式中，胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87或人胶质瘤细胞H4。
[0040]下通过具体实施例，对光的诱导刺激下上述胶质瘤细胞系产生稳定的光电流进行进一步的解释和实验证明。实施例中，用于刺激的光为波长为470nm的蓝光。
[0041]实施例1
[0042]病毒载体的构建以及侵染胶质瘤细胞。
[0043]将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒，和慢病毒包装的质粒pCMV Δ R8.74、pMD2.G.(1.5 g)一起,利用脂质体(Invitrogen公司产品)一起转染至293FT细胞(ATCC公司产品，该细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株)中(每200，000个细胞用6mg/L脂质体)，24hr后用含有5mM丙酮酸钠的DMEM替代原293FT细胞的培养液继续培养，16小时后，利用超速离心机在50，OOOg速度下破膜，将悬液通过20%的蔗糖滤柱，收集上清。该病毒滴度能达3X 108TU/mL以上，产出的病毒颗粒以灭菌的磷酸盐缓冲液以1:1000的体积比进行重悬。将获取的病毒按1:400的体积比混入无血清DMEM中，用于感染目标细胞:人胶质瘤细胞系U87 ；6小时后，将含病毒的培养液换成新鲜含有10%胎牛血清的DMEM，继续培养48小时-72小时；放到显微镜下观察，如果80%左右的细胞表达绿色荧光的标记蛋白，可初步证实转染成功。
[0044]试验用的胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞系U87，利用上述的携带光感基因的病毒载体感染胶质细胞(感染浓度为1:500)，感染24hr后用含10%血清的培养基替代感染时的无血清培养基后继续观察，在48hr后的明场照片(BF)和荧光(FL)照片如图1所示。
[0045]图1中可以观察到胶质瘤细胞有绿色荧光表达，提示光感基因标记胶质细胞成功。
[0046]实施例2
[0047]光电流的诱发和记录。
[0048]为了验证光基因在胶质瘤细胞系的功能性表达，以膜片钳技术我们采用蓝光的单脉冲刺激和多脉冲刺激来对胶质瘤细胞的膜兴奋性改变进行记录，500ms的单脉冲蓝光刺激可以诱发胶质瘤细胞产生电流变化；50ms, 20HZ的连续蓝光刺激可以诱发出对应的系列性的膜电流变化。该电生理记录证明光感基因成功表达于胶质瘤细胞系上。
[0049]得到的刺激电流和内向光电流的对比图为图2，其中，F表示500ms蓝光引发光电流，G表示50ms，20Hz蓝光刺激引发光电流。
[0050]由图2可以看出，蓝光刺激胶质瘤细胞系，单个脉冲刺激和连续光脉冲刺激引起细胞膜兴奋性改变和对应光电流。
[0051]实施例3
[0052]蓝光刺激诱发胶质瘤细胞存活率下降。
[0053]在胶质瘤细胞系功能性表达光感基因后，我们采用蓝光持续刺激胶质瘤细胞Ih(20Hz )，24h后对胶质瘤的存活率进行分析，得到图3。
[0054]由图3可以看出，光感基因和光照联合组(ChETA+light)的肿瘤细胞同其他组相比，存活率显著降低。
[0055]实施例4
[0056]蓝光诱发胶质瘤细胞发生凋亡。
[0057]蓝光照射肿瘤细胞后，引起胶质瘤细胞存活率下降，通过TUNEL染色，得到图4a~图4e。
[0058]由图4a~图4e可以看出，光敏基因表达组经过蓝光照射(图4e)后阳性细胞明显增多，而其他组的信号无明显增强，说明蓝光刺激可以诱发表达光基因的肿瘤细胞凋亡。
[0059]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种胶质瘤细胞系，其特征在于，所述胶质瘤细胞系为感染了病毒载体的胶质瘤细胞； 所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR。
2.根据权利要求1所述的胶质瘤细胞系，其特征在于，所述启动子为c-fos，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。
3.根据权利要求1所述的胶质瘤细胞系，其特征在于，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87或人胶质瘤细胞H4。
4.一种胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒以及与病毒包装相关的混合质粒PCMVAR8.74和pMD2.G.一起，用脂质体一起转染至293FT细胞中，然后将所述293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，所述上清液中含有用于感染胶质细胞的病毒载体，所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR ； 用所述病毒载体感染胶质瘤细胞，得到所述胶质瘤细胞系。
5.根据权利要求4所述的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述启动子为c-fos，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。
6.根据权利要求4所述的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87或人胶质瘤细胞H4。
【文档编号】C12R1/91GK103509755SQ201310501109
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】杨帆, 屠洁, 王立平 申请人:深圳先进技术研究院