四倍体泥鳅鳍细胞系temf及其建立方法
【专利摘要】本发明提供一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法。所述细胞系于2013年8月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?No：C2013111。所述四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF支持鲤春病毒血症病毒的生长和复制。所述四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF的生物学特性包括：细胞为成纤维细胞样、胞浆丰富贴壁生长、具接触抑制生长特性；细胞倍增时间为41.45小时；特征染色体数目为100条。
【专利说明】四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法。
【背景技术】
[0002]泥嫩(Misgurnusanguillicaudatus)在分类学中属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)、泥鳅属(Misgurnus),是亚洲特有的野生小型淡水鱼类，广泛分布于我国辽河以南大部分地区以及越南、朝鲜和日本。我国各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水沟、稻田等均有分布。泥鳅肉质细嫩、味美，营养丰富，有“水中人参”之称，除了较高的食用价值，它还具有定的滋补药用功效，是市场上畅销的特种水产品之一。除了具有重要经济价值外，泥鳅还是一种很好的细胞学、遗传学等方面的研究材料。
[0003]泥鳅存在多倍体现象，天然四倍体约占2%。关于四倍体泥鳅的研究主要涉及和二倍体杂交生产三倍体，迄今为止还没有关于体外培养四倍体泥鳅鳍细胞的相关报道。
[0004]大量的研究报道证实四倍体和肿瘤的发生有关。四倍体泥鳅细胞系的建立不仅用于种质资源保护、四倍体特性的机理分析，而且以其为模型进行肿瘤的研究也是非常有益的。
【发明内容】
[0005]鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法。
[0006]所述四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF于2013年8`月19日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No:C2013111。
[0007]所述细胞系支持鲤春病毒血症病毒的生长和复制。
[0008]本发明还提供一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF的建立方法，包括以下步骤:
[0009]1、制备细胞培养液
[0010]所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成所述培养液，胎牛血清占培养液总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子的终浓度为20ng/ml，硫酸软骨素的终浓度为10 μ g/ml，所述培养液存放在4°C ；
[0011]I1、原代培养
[0012]在无菌环境下剪取四倍体泥鳅的鳍组织，先用质10wt%的碘伏浸泡剪下的所述鳍组织15分钟，再用含有终浓度为500IU/mL的青霉素和终浓度的500 μ g/mL链霉素的混合液浸泡30分钟，然后用无菌PBS漂洗，将漂洗后的鳍组织剪成Imm3左右的小块，均匀接种在没有培养液的细胞培养瓶中，在25°C的CO2培养箱中正置干贴24小时，然后往所述培养瓶中加入所述培养液，放置在25°C的CO2培养箱中继续培养；
[0013]II 1、传代培养
[0014]待步骤II的细胞长成单层后，移走所述培养瓶中的培养液，然后往所述培养瓶中加入0.25%的胰蛋白酶溶液对所述细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一层胰蛋白酶膜继续消化I分钟，然后加入培养液吹打消化后的细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液按预定比例转入新的培养瓶中，并补加培养液，在25°C的CO2培养箱中培养;
[0015]IV、按照步骤III的过程传代，30代后所用培养液为含20vol%胎牛血清的DMEM/F12培养基。
[0016]本发明所提供的四倍体泥鳅鳍细胞系可用于进行病毒学、病理学、毒理学、免疫学、遗传育种和种质保存等理论研究以及病毒疫苗研制等应用研究。
【专利附图】
【附图说明】 [0017]图1是在显微镜下观察，本发明的四倍体泥鳅鳍细胞系的形态图。
[0018]图2是示出图1所示四倍体泥鳅鳍细胞系的染色体分析图。
[0019]图3是对图1所示四倍体泥鳅鳍细胞系进行SSR分析的结果图。
[0020]图4是示出图1所示四倍体泥鳅鳍细胞系生长曲线的图。
[0021]图5是示出接种鲤春病毒血症病毒两天后的四倍体泥鳅鳍细胞系形态的图。
【具体实施方式】
[0022]以下通过【具体实施方式】对本发明的四倍体泥鳅鳍细胞系及其建立方法进行说明。
[0023]1、细胞系的建立
[0024]四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF通过下述步骤建立。
[0025](I)制备细胞培养液
[0026]所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清(FBS)、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成细胞培养液。其中，胎牛血清占培养液总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子的终浓度为20ng/ml，硫酸软骨素的终浓度为10μ g/ml。配制好的培养液存放在4°C。
[0027](2)原代培养
[0028]在无菌环境下剪取四倍体泥鳅的鳍组织。接下来，先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鳍组织15分钟，再用青霉素和链霉素混合液(青霉素终浓度为500IU/mL，链霉素终浓度% 500 μ g/mL)浸泡30分钟。浸泡结束之后，再用无菌PBS (配方:8gNaCl、0.2gKCl、3.63gNa2HPO4.12Η20、0.24gKH2P04，溶于蒸馏水并定容至1L)漂洗两遍。然后，将漂洗后的鳍组织剪成Imm3左右的小块，均匀接种在没有培养液的25cm2细胞培养瓶中，在25°C的CO2培养箱中正置干贴24小时。然后往培养瓶中加入细胞培养液至5mL/瓶，在25°C的CO2培养箱中继续培养。
[0029](3)传代培养
[0030]待原代培养的细胞长成单层后，将培养瓶中的培养液转移到干净容器中备用。接着，往培养瓶中加入ImL0.25%的胰蛋白酶溶液，用于对细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液。此时在瓶底形成一层胰蛋白酶膜，继续消化I分钟，轻柔磕碰培养瓶。然后将前述转移到干净容器中备用的培养液重新转移入培养瓶中，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液。将细胞悬液均匀分到两个新的培养瓶中，并补加培养液至5mL，在25°C的CO2培养箱中培养。
[0031]待细胞再次长成单层后，按照步骤(3)的过程进行传代。30代后所用培养液为含20vol% FBS 的 DMEM/F12 培养基。
[0032]2、细胞的保存
[0033]首先配制细胞冻存液，该细胞冻存液中含FBS20%、DMEM/F1260%和二甲基亚砜20%。配好的细胞冻存液放在4°C冰箱中保存备用。
[0034]取生长旺盛的细胞，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化。消化结束后，加入培养液重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，然后用ImL细胞冻存液重悬细胞。调整细胞浓度至1.0X IO6个/mL，将细胞转入冻存管中。
[0035]对上述细胞悬液逐渐降温，具体降温程序如下:首先在4°C冰箱中放置30min，再转入_20°C冰箱中放置2h，然后转入-80°C冰箱中24h，最后放入液氮中(_196°C )长期保存。
[0036]检测在液氮中冻存后的细胞存活率。取一管在液氮中保存的细胞，在40°C水中解冻，待细胞悬液融化后转入25°C水浴中3min。然后将细胞悬液转入干净离心管，加入等量DMEM/F12培养基，1500rpm离心5min，弃上清，用含20vol % FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，转入到25cm2的细胞培养瓶中，补加培养液至5mL，在25°C的CO2培养箱中培养24h，然后更换新鲜的培养液，继续培养。
[0037]同时，取少量解冻过程中重悬的细胞液，加入台盼蓝(Trypan Blue)染色，并用血球计数板计数，计算存活率。存活率=(活细胞数/细胞总数)X 100%。
[0038]冻存细胞的存活率为(81.57 ± 1.28) %。
[0039]3、染色体分析`
[0040]向培养有四倍体泥鳅鳍细胞系的培养瓶中加入终浓度为I μ g/mL的秋水仙素，将培养瓶置于25°C的CO2培养箱中继续培养3~5h。然后用0.25%的胰蛋白酶溶液消化，将消化后的细胞转入离心管中，1500rpm离心5min，收集细胞。用0.075mol/LKC1溶液低渗40min, Carnoy固定液固定15min,固定三次后滴片,干燥,然后用Giemsa染液染色。
[0041]显微镜下观察拍照，计数染色体数目，并进行核型分析，根据染色体的长度、着丝点位置、臂长等特征，对染色体进行分组、配对。
[0042]四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF的染色体核型如图2所示。
[0043]4、SSR 分析
[0044]通过SSR(Simple Sequence Repeats)技术来鉴定所建立的三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF是否与泥鳅具有相同的遗传特征。
[0045]首先，分别提取斑马鱼肌肉组织、泥鳅肌肉组织和三倍体泥鳅鳍细胞系的DNA。采用常规的苯酚-氯仿抽提法从泥鳅肌肉组织中提取基因组DNA。三倍体泥鳅鳍细胞系DNA的提取步骤如下:①取出在_20°C冰冻的细胞，在4°C解冻后放入1.5mL离心管中，离心后去除上清液；②加入250 μ L的DNA裂解液(含有10mmol/L Tris-Cl、50mmol/L KCl和0.5%Tween-20, ρΗ8.0)，再加入5 μ L蛋白酶Κ(浓度为0.5mg/mL)，于55°C水浴恒温裂解3h ?’③参照苯酚-氯仿抽提法，用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。
[0046]接下来，进行PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增。
[0047]根据已报道的泥鳅微卫星标记位点，合成Mac9、Mac50两对引物(具体序列见表I)。
[0048]表1
[0049]
【权利要求】
1.一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF，于2013年8月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:C2013111o
2.根据权利要求1所述四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF，其特征在于，所述细胞系支持鲤春病毒血症病毒的生长和复制。
3.一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF的建立方法，包括以下步骤: I、制备细胞培养液 所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成所述培养液，胎牛血清占所述培养液总体积的.20%，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子的终浓度为.20ng/ml，硫酸软骨素的终浓度为10 μ g/ml，所述培养液存放在4°C ； II、原代培养 在无菌环境下剪取四倍体泥鳅的鳍组织，先用10wt%的碘伏浸泡剪下的所述鳍组织.15分钟，再用含有终浓度为500IU/mL的青霉素和终浓度为500 μ g/mL的链霉素的混合液浸泡30分钟，然后用无菌PBS漂洗，将漂洗后的鳍组织剪成Imm3左右的小块，均匀接种在没有培养液的细胞培养瓶中，在25°C的CO2培养箱中正置干贴24小时，然后往所述培养瓶中加入所述培养液，放置在25°C的CO2培养箱中继续培养； III、传代 培养 待步骤II的细胞长成单层后，移走所述培养瓶中的培养液，然后往所述培养瓶中加入.0.25%的胰蛋白酶溶液对所述细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一层胰蛋白酶膜继续消化I分钟，然后加入培养液吹打消化后的细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液按预定比例转入新的培养瓶中，并补加培养液，放在25°C的CO2培养箱中培养； IV、按照步骤III的过程传代，30代后所用培养液为含20VOl%胎牛血清的DMEM/F12培养基。
【文档编号】C12R1/91GK103555657SQ201310538211
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】李霞, 马辰, 秦艳杰, 李雅娟, 杨艳津 申请人:大连海洋大学