一种纳米基因导入材料及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明涉及基因导入【技术领域】，特别是涉及一种纳米基因导入材料及其制备方法和用途，该纳米基因导入材料是由C18V2+和氯铂酸反应制成的平均粒径为100nm的PtNPs–C18V2+复合物，其与绿色荧光蛋白质粒基因pGFP以非共价方式结合，形成无机纳米基因导入系统，PtNPs–C18V2+复合物作为非病毒型转染载体，表现出了良好的细胞相容性，具有稳定且较高的转染效率。
【专利说明】一种纳米基因导入材料及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因导入【技术领域】，特别是涉及一种纳米基因导入材料及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]随着人类基因图谱测定的完成，我们对人类疾病发病机制的认识在基因水平上取得了突破性的进展。目前研究表明，有许多疾病的发生及发展与基因密切相关。如果可以筛查出与疾病特异相关的基因片段或者基因突变，就可以有针对性地在基因水平上进行特异治疗，如通过导入相关缺失基因或沉默基因，以增强相关缺失功能或者沉默致病基因，从而达到彻底治疗的目的。将目的基因安全有效地导入生物体内是目前此研究领域中的关键和难点。
[0003]基因导入系统或方法可以分为两类:一类是病毒型基因导入系统，以逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体；另一类是非病毒型基因导入系统，其转染方式如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体法、以及新兴的纳米基因导入材料。其中，病毒型基因导入系统存在许多严重的不足，如病毒转染有可能激活原癌基因等，因此，非病毒型转染方式是目前的研究热点。
[0004]上述非病毒基因导入系统的几种转染方式中，显微注射一次只能处理一个细胞；基因枪穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法结果不稳定，转染效率受温度、浓度、操作环境等众多因素影响；阳离子脂质体法虽然表现了良好的转染效率，但是过高的毒性又限制了它的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于避免现有技术中的不足之处而提供一种具有良好的生物相容性、稳定且转染效率高的纳米基因导入材料。
[0006]本发明的目的之二在于避免现有技术中的不足之处而提供一种反应简单、容易操作、可重复性好的纳米基因导入材料的制备方法。
[0007]本发明的目的之三在于避免现有技术中的不足之处而提供一种具有良好的生物相容性、稳定且转染效率高的纳米基因导入材料的新用途。
[0008]本发明的目的通过以下技术方案实现:
本发明的一种纳米基因导入材料，它是由C18V2+和氯钼酸反应制成的平均粒径为IOOnm的PtNPs - C18V2+复合物，其中C18V2+和氯钼酸用量的摩尔比为3:1;。
[0009]C18V2+和氯钼酸反应形成的PtNPs - C18V2+复合物由于其表面钼离子的正电性，使其具备成为转染材料的潜力，C18V2+可以控制生成的PtNPs - C18V2+复合物为球形颗粒，通过对反应时间的控制可以控制PtNPs - C18V2+复合物的平均粒径在IOOnm左右，从而符合转染要求。
[0010]本发明的一种纳米基因导入材料的制备方法如下:1)用去离子水分别制备浓度为6mM的C18V2+溶液和浓度为2mM的氯钼酸溶液；
2)取0.1ml所述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶液，并加热至110° C，然后滴加0.1ml所述氯钼酸溶液,冷却回流20min后，将所获得的混合物在7000rpm转速下离心3min，过滤后所得的沉淀物用去离子水和乙醇冲洗，最终产物分散在乙醇中，最后用超声处理，超声频率为28kHz，处理时间3min。
[0011]本发明提供了一种纳米基因导入材料的新用途，所述PtNPs - C18V2+复合物与绿色荧光蛋白质粒基因PGFP以非共价方式结合，形成无机纳米基因导入系统，用于基因转染。
[0012]所述PtNPs - C18V2+复合物作为基因转染材料在制备抗肿瘤药物中的应用。[0013]本发明的有益效果:
本发明的纳米基因导入材料，是由C18V2+和氯钼酸反应制成的平均粒径为IOOnm的PtNPs-C18V2+复合物，由于其表面钼离子的正电性，使其具备成为转染材料的潜力，PtNPs - C18V2+复合物作为非病毒型转染载体，表现出了良好的细胞相容性，具有稳定且较高的转染效率。现有技术中虽然已有大量纳米材料在转染领域被测试，但是使用PtNPs -C18V2+复合物作为转染材料尚属首例(这是因为尽管PtNPs - C18V2+复合物细胞相容性很好，但是其颗粒一般只能达到微米级，低尺度的很难做出来，我们通过对反应时间的控制，可以将其平均粒径控制在IOOnm左右，符合转染要求)。与现有技术相比，本发明的纳米基因导入材料具有以下优点:
1)具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中可以达到40%左右；
2)低毒性，因C18V2+和氯钼酸具有良好的生物相容性，细胞生存率很高；
3)材料分散性良好，符合对转染的要求；
4)制作成本极低，因C18V2+、二甲基甲酰胺、氯钼酸都是常见易得的廉价试剂；
5)材料制备反应简单，容易操作，可重复性好；
应用前景良好，可以应用于制备抗肿瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]利用附图对本发明做进一步说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
[0015]图1为本发明的纳米基因导入材料PtNPs-C18V2+的扫描电镜图片。
[0016]图2为转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片。
[0017]图3为转染后的细胞生存率图片。
[0018]图4为转染效率图。
【具体实施方式】
[0019]结合以下实施例及附图对本发明作进一步说明。
[0020]本发明的纳米基因导入材料是由C18V2+和氯钼酸反应制成的平均粒径为IOOnm的PtNPs - C18V2+复合物，其制备方法如下:
1、材料的准备:
分析纯的C18V2+和氯钼酸(Aldrich公司产品)；
所有的制备用玻璃器皿，均在乙醇中超声5min，然后双蒸水清洗，并用洗液Η20/ΗΝ03(浓度65%)/H2O2 (浓度35%) (I:1:l，v/v/v)清洗，之后再用双蒸水、丙酮依次清洗，最后在空气中晾干。
[0021]2、PtNPs - C18V2+ 复合物的制备:
1)用去离子水分别制备浓度为6mM的C18V2+溶液和浓度为2mM的氯钼酸溶液；
2)取0.1ml上述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶剂，并加热至110° C，然后滴加
0.1ml上述制备的氯钼酸溶液，冷却回流20min后，将所获得的混合物在7000rpm转速下离心3min，过滤后所得的沉淀物用去离子水和乙醇冲洗，最终产物分散在乙醇中，最后用超声处理，超声频率为28kHz，处理时间3min。
[0022]PtNPs - C18V2+的扫描电镜图片如图1所示。
[0023]以上制备的PtNPs - C18V2+复合物进行以下实验:
一、结合性能的测定
1、主要材料:
绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-Cl) ;HEPES平衡盐溶液(自配)；电泳缓冲液(0.5XTBE，自配)；DNA上样缓冲液；溴化乙啶(EB)。
[0024]2、主要方法:
取1μ I上述制备的PtNPs-C18V2+溶液(5mg PtNPs - C18V2+溶解在500 μ I双蒸水中)与I P Id 的 pEGFP-Cl 水溶液(0.1yg /μ I)以及 8μ I 的双蒸水(ρΗ=7.4 water)在 1.5ml 离心管中混合，置于室温下30min让其充分结合；
PtNPs - C18V2+ pEGFP-Cl 的质量比分别采用 100:1，50:1，30:1，10:1，1:1 ;
在5000rpm的速度下离心5min，将沉淀物加载到1%的琼脂糖(EB0.1yg /ml)在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在320nm处观察条带。
[0025]3、结果:
结果观察，有多种条带出现，这是因为PEGFP-Cl有多种构型所致。在质量比30:1，10:1,1:1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米颗粒结合不是很好，到了100:1，50:1条带消失，说明结合完全了。
[0026]实验结果表明:带正电荷的pEGFP-Cl和PtNPs-C18V2+有一个最佳的结合比，超出50:1以后过多的纳米颗粒显得不再重要，所以PtNPs - C18V2+和pEGFP-Cl的质量比采用50:1进行转染。
[0027]二、转染
1、主要材料:
人乳腺癌细胞；231@pEGFP-Cl联合体(上述制备)；DMEM培养基；胎牛血清FBS ；6孔培养板。
[0028]2、主要方法:
O细胞的培养:将人乳腺癌细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中(5X IO6/孔)，用含FBS10%的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60%~70%的
融合度；
2)细胞转染实验:将培养好的细胞上清除去，换新的培养液，并加入质量比50:1的PtNPs - C18V2+@pEGFP-Cl联合体，培养48h后分别对其荧光显微镜观察(结果参见图2、细胞存活率(碘化吡啶标识，流式细胞仪检测——结果参见图3)、以及转染效率(流式细胞仪检测——结果参见图4)进行测定。[0029]3、结果分析:
如图2所示，荧光显微镜下观察可以看出有明显绿色荧光，并且覆盖面比较大。
[0030]如图3所示，转染后的细胞生存率图中分别为无添加物、PtNPs - C18V2+IgpEGFP-Cl联合体、Iipofectamine 20000 pEGFP-Cl联合体的生存率，可以看到PtNPs - C18V2+OpEGFP-Cl联合体对细胞生存率的影响是很小的，比Iipofectamine 20000 pEGFP-Cl联合体的影响小很多。
[0031]如图4所示，转染效率图中可以看到PtNPs - C18V2+IgpEGFP-Cl联合体可以达到约40%的转染效率，这是在保证了细胞生存率的前提下达到了一个较高的转染效率，其虽然不及Iipofectamine 2000高,但是其高细胞相容性是Iipofectamine 2000所无法比拟的，表现出了 PtNPs - C18V2+做为转染试剂的巨大潜力。
[0032]由此，本发明所制备的平均粒径为IOOnm的PtNPs - C18V2+复合物，表现出了良好的细胞相容性，具有稳定且较高的转染效率，符合转染要求，能够作为基因转染材料用于抗肿瘤药物的制备。
[0033]最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术·方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【权利要求】
1.一种纳米基因导入材料，其特征在于:它是由C18V2+和氯钼酸反应制成的平均粒径为IOOnm的PtNPs - C18V2+复合物，其中C18V2+和氯钼酸用量的摩尔比为3:1; 所述PtNPs - C18V2+复合物的制备方法如下: 1)用去离子水分别制备浓度为6mM的C18V2+溶液和浓度为2mM的氯钼酸溶液； 2)取0.1ml所述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶液，并加热至110° C，然后滴加0.1ml所述氯钼酸溶液,冷却回流20min后，将所获得的混合物在7000rpm转速下离心3min，过滤后所得的沉淀物用去离子水和乙醇冲洗，最终产物分散在乙醇中，最后用超声处理。
2.—种纳米基因导入材料的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)用去离子水分别制备浓度为6mM的C18V2+溶液和浓度为2mM的氯钼酸溶液； 2)取0.1ml所述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶液，并加热至110° C，然后滴加0.1ml所述氯钼酸溶液,冷却回流20min后,将所获得的混合物在7000rpm转速下离心3min，过滤后所得的沉淀物用去离子水和乙醇冲洗，最终产物分散在乙醇中，最后用超声处理，超声频率为28kHz，处理时间3min。
3.如权利要求1所述的一种纳米基因导入材料的用途，其特征在于:所述PtNPs-C18V2+复合物与绿色荧光蛋白质粒基因PGFP以非共价方式结合，形成无机纳米基因导入系统，用于基因转染。
4.如权利要求3所述的一种纳米基因导入材料的用途，其特征在于:所述PtNPs-C18V2+复合物作为基因转染材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103627719SQ201310620389
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】王深明, 徐安武, 张德元, 常光其, 周鸿雁, 李梓伦, 夏浩明, 张红霞 申请人:中山大学附属第一医院