一种乳酸菌肽的制备方法及其在动物饲料中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种乳酸菌肽的制备方法及其在动物饲料中的应用,属于饲料添加剂和生物【技术领域】。乳酸菌肽是以植物乳杆菌为出发菌株，液体发酵以2-3%葡萄糖作为碳源，1-2.5%胰蛋白胨和0.5-1.5%酵母膏作氮源，经发酵、提取、分离纯化和低温喷雾干燥而制得。这种乳酸菌肽按照6000IU/kg添加至动物饲料中，对促进生长、抗应激、预防仔猪腹泻等均有较好效果。本发明菌株和产物均为安全微生物，发酵产品抑菌活性可达30000-150000IU/g，活性高，工艺简单，成本低，适合在动物饲料中替代抗生素药物和其他抗菌促生长产品应用，对保障食品安全和促进养殖业健康可持续发展具有重要的经济和生态价值。
【专利说明】一种乳酸菌肽的制备方法及其在动物饲料中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种乳酸菌肽的制备方法及其在动物饲料中的应用，属于饲料添加剂和生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着人们对食品安全、生态、环保等问题日益关注以及绿色意识的不断增强，发展绿色食品，不论是从满足人们消费需求还是从提高经济效益及市场竞争力看都既是客观需要，又是现实选择。要发展绿色畜禽产品，就需要重点抓好药物残留控制，因此就必须从食物链的源头一饲料抓起，努力降低药物残留和污染，寻求一种安全、高效、无污染、无残留的绿色饲料添加剂已然成为一个热点问题。目前饲料中经常使用的绿色添加剂包括:饲用微生物添加剂、化学益生肽(如各种寡糖)、酶制剂、中草药添加剂、酸化剂、植物提取物等。这些添加剂均具有安全、无残留、无污染的特点，其中微生物添加剂以其高效、低廉而倍受青睐。在众多微生物添加剂中，乳酸菌制剂是饲用微生物添加剂中应用最为广泛，效果较好的一类。有大量报道证明这类饲用微生物添加剂具有良好的生物学功能，其有改善胃肠道功能、提高增重、提高饲料转化率、提高畜禽的免疫机能、降低死淘率等效果，并且已在饲料工业中得到广泛应用，有极大的市场潜力。
[0003]仔猪腹泻一直是困扰广大养猪业者的一个难题，仔猪腹泻的发生率以及严重程度对动物场经济效益会产生重要的影响。目前，仔猪腹泻的防治措施主要有使用抗生素、仔猪断奶后减少饲喂量以及使用部分动物性蛋白取代豆柏等植物性蛋白等以减少腹泻的发生率，降低腹泻的严重程度。但使用抗生素会对肠道的微生态平衡产生不良影响，并且由于细菌抗药性的存在，抗生素的效果已不尽人意；使用动物性蛋白，由于原料价格较高以及资源缺乏，也不是解决仔猪腹泻的基本措施；而仔猪断奶后实行限制饲喂，虽然对于防治仔猪腹泻有一定的作用，但相应的会降低生长速度，所以益生菌的使用正逐步增加。Siuta(2000)报道，乳酸菌、链球菌和酵母菌混合物可极显著提高仔猪增重，降低腹泻率，控制死亡率。顾方鸿等(1998)也报道，乳酸菌可以提高仔猪日增重、抗病力和饲料报酬，显著降低仔猪腹泻发生率(P < 0.01)。植物乳杆菌作为国家农业部《饲料添加剂品种目录(2010)》允许在所有养殖动物中使用的微生物，其安全性和有效性已经得到公认。
[0004]细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中产生的一种代谢产物，通常为低分子量多肽或蛋白类物质，分子量小，结构复杂。研究表明，绝大多数乳酸菌在生长过程中都能合成这种物质，通称为乳酸菌肽或乳酸菌素，乳酸菌肽是具有生物活性的蛋白质，一般是带正电荷的小分子蛋白(30~60个氨基酸残基)，具有高等电点和亲水特性。大部分的细菌素通常只对近缘关系的细菌有损害作用，并且无毒副作用、无残留、无耐药性，对环境无污染。因此，可以将细菌素作为饲料添加剂来减少甚至替代抗生素的使用。乳酸菌肽的抑菌谱一般只限于革兰氏阴性细菌，能有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌等病原微生物的生长，维持机体肠道内微生物区系平衡，某些乳酸菌肽可以抑制食品中的致病菌和腐败菌，包括蜡状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等，普遍呈现不可逆的杀菌作用方式，在食品和饲料中稳定，可在人畜体内进行生物降解和消化，对健康无害且在低浓度下具有活性。目前，国内外对乳酸菌产生的乳酸菌肽研究较深入，己发现了几十种乳酸菌肽，但真正应用较多的仅有乳酸链球菌肽，也称乳链菌肽或称尼生肽(Nisin) oNisin是某些乳酸球菌在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小分子肽。1969年，联合国粮农组织(FAO / WHO)确认Nisin为食品防腐剂，这也是第一个被批准使用的细菌素。1983年，Nisin被美国食品和药物管理局(FDA)批准使用。乳酸菌肽目前在食品中已经得到广泛的应用，但在畜禽饲料中的应用还较少。乳酸菌肽不仅具有抗生素饲料添加剂相似的有益作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性，也不污染环境，正因为这些性质，让乳酸菌肽取代抗生素逐渐成为可能，使畜禽健康和畜产品安全以及养殖生态安全得到了进一步的保证。
【发明内容】
[0005]本发明针对饲料中抗生素长期添加和普通微生物添加剂生产量低且抑菌效果不切实等问题，提供一种以乳杆菌发酵、分离纯化和低温喷雾干燥等步骤生产乳酸菌肽的方法及其在动物饲料中的应用。
[0006]实现本发明的技术方案如下:
一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
1)摇瓶培养:将植物乳杆菌接种至摇瓶中，摇瓶装有液体培养基，28-33°C条件下培养时间18小时；
2)发酵培养:将步骤I)摇瓶培养的植物乳杆菌接种至发酵培养基进行发酵培养，接种量1-3%(ν/ν)，发酵温度28-33°C，培养时间36-48小时或发酵液pH达到1.5-3.5时，停止发酵；
3)分离提纯:将步骤2)的发酵液离心去除菌体，在上清液中加入有机溶剂溶解，再次离心，在上清液中加入赋形剂，低温喷雾干燥，得到乳酸菌肽，抗菌效价为30000-150000IU/g ;其中所述有机溶剂为醇类、醚类或羧酸类；所述赋形剂为多孔淀粉。
[0007]步骤I)所述的液体培养基为蛋白胨10g/L、牛肉膏8 g/L、酵母粉4 g/L、麦芽糖20 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、吐温-80 g/L、柠檬酸氢二氨2 8/1，？!1调至6.5;
步骤2)所述的发酵培养基为葡萄糖2-3%，蛋白胨1-2.5%，酵母膏0.5-1.5%，微量元素0.05-0.1%，pH 5.5-7，所述微量元素为柠檬酸铵、乙酸钠、MgS04、MnSO4中的一种或几种。
[0008]步骤3)所述的赋形剂的加入量为每ImL的上清液中加入5~8g。
[0009]步骤3)中所述的离心转速为2000-10000转/分，时间为5_40分钟。
步骤3)中所述的低温喷雾干燥进风温度为100-120°C，出风温度为40-60°C。
上述任意一项制备方法制备得到的乳酸菌肽，抗菌效价为30000-150000IU/g，这种乳酸菌肽有较宽的抑菌谱，不仅对革兰氏阳性菌有抑菌作用，而且对大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌也有很好的抑菌效果。尤其是对大肠杆曲、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等几种常见的病原菌和腐败菌均有良好的作用效果，但对乳酸菌和酵母菌几无抑制作用。这种乳酸菌肽是一种广谱抗菌肽。其应用于生产试验也取得了良好的结果。
[0010]所述乳酸菌肽在 动物饲料中的应用，在动物饲料中按照6000IU/kg添加乳酸菌肽。在仔猪饲料中按照6000IU/kg添加在饲料中，从教槽料连续使用到70日龄左右。
[0011]本发明所用植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌植物亚种1.2437购于中国科学院微生物所菌种保藏中心。
[0012]本发明所述的乳酸菌肽及其制备方法与现有技术相比，具有以下优势；
(I)、本发明首次将乳酸菌肽应用于动物饲料中，使用安全，对动物生长无任何毒副作用；(2)、本发明乳酸菌肽与目前猪饲料中较广泛使用的黄霉素、金霉素相较有显著促进生长，降低因仔猪腹泻等引起的死亡率；(3)、本发明乳酸菌肽能有效降低肠道的pH值，抑制有害菌群的生长；同时还能有效提闻动物的应激能力，降低死亡率，促进生长，提闻了词料的消化吸收效果，降低料肉比，提高日增重，对替代或部分替代抗生素饲料添加，保障食品绿色安全具有重要意义。
[0013]试验结果表明添加乳酸菌肽后仔猪料重比降低(P < 0.05 )，腹泻率减少(P <
0.01)，促进了仔猪生长，提高了仔猪生产性能，取得了较好的效果。
【具体实施方式】
[0014]以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
[0015]实施例1乳酸菌肽的制备
将植物乳杆菌植物亚种1.2437 (购于中国科学院微生物所菌种保藏中心下同)，先在摇瓶上培养，培养条件: 蛋白胨10g/L、牛肉膏8 g/L、酵母粉4 g/L、麦芽糖20 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、吐温-80 g/L、柠檬酸氢二氨2 g/L, pH调至6.5，培养18小时，体积比3%接种在100L发酵罐(上海保兴生物工程有限公司)中发酵培养，发酵条件:以2%葡萄糖作为碳源，1.5%胰蛋白胨和1%酵母膏作氮源，另加柠檬酸铵0.5%、乙酸钠0.5%、MnS04 0.025%,培养基起始pH=6，接种量3%，发酵温度30°C，发酵液pH达到2±0.2时发酵结束；发酵液经离心去除菌体(离心分离转速为4000转/分，时间为10分钟)，然后在上清液中加入乙醇溶解，再次离心去杂(离心分离转速为4000转/分，时间为5分钟)，取上清液按6:1 (重量比)加入赋形剂多孔淀粉(重庆泰威生物工程股份有限公司)，低温喷雾干燥(进风温度为120°C，出风温度为40°C)，制得产品抗菌效价为82000IU/g。
[0016]实施例2乳酸菌肽的制备
将植物乳杆菌植物亚种1.2437 (购于中国科学院微生物所菌种保藏中心下同)，按上述实施例1先在摇瓶上培养，在100L发酵罐(上海保兴生物工程有限公司)中培养，发酵条件:以2.5%葡萄糖作为碳源，2%胰蛋白胨和1.5%酵母膏作氮源，另加柠檬酸铵0.5%、磷酸氢二钾1%、乙酸钠0.5%、MnS04 0.025%、MgSO4 0.055%，培养基起始pH=6，接种量3%，发酵温度29°C，发酵36小时，发酵液pH达到1.8±0.2时发酵结束；发酵液经离心去除菌体(离心分离转速为6000转/分，时间为5分钟)，然后在上清液中加入正丁醇溶解，再次离心去杂(离心分离转速为6000转/分，时间为5分钟)，取上清液按4:1 (重量比)加入赋形剂多孔淀粉(重庆泰威生物工程股份有限公司)，低温喷雾干燥(进风温度为120°C，出风温度为50°C，制得产品抗菌效价为108000IU/g。
[0017]实施例3乳酸菌肽的制备
将植物乳杆菌植物亚种1.2437 (购于中国科学院微生物所菌种保藏中心下同)，按上述实施例1先在摇瓶上培养，在IOOL发酵罐(上海保兴生物工程有限公司)中培养，发酵条件:以3%葡萄糖作为碳源，2%胰蛋白胨和1.5%酵母膏作氮源，另加柠檬酸铵0.5%、磷酸氢二钾1%、乙酸钠0.5%、MnS04 0.025%、MgSO4 0.055%，培养基起始pH=6，接种量3%，发酵温度29°C，发酵液pH达到2±0.2时发酵结束；发酵液经离心去除菌体(离心分离转速为6000转/分，时间为5分钟)，然后在上清液中加入正丁醇溶解，再次离心去杂(离心分离转速为6000转/分，时间为5分钟)，取上清液按8:1 (重量比)加入赋形剂多孔淀粉(重庆泰威生物工程股份有限公司)，低温喷雾干燥(进风温度为120°C，出风温度为45°C，制得产品抗菌效价为57000IU/g。
[0018]实施例4:乳酸菌肽抑菌效果试验
分别取实施例1-3制备得到的乳酸菌肽，稀释为抗菌效价为400IU/ml乳酸菌肽溶液，用牛津杯法测定乳酸菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌(菌株均购自中国兽医药品监察所)等的抑菌效果，结果见下表:
【权利要求】
1.一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)摇瓶培养:将植物乳杆菌接种至摇瓶中，摇瓶装有液体培养基，28-33°C条件下培养时间18小时； 2)发酵培养:将步骤I)摇瓶培养的植物乳杆菌接种至发酵培养基进行发酵培养，接种量1-3%(ν/ν)，发酵温度28-33°C，培养时间36-48小时或发酵液pH达到1.5-3.5时，停止发酵； 3)分离提纯:将步骤2)的发酵液离心去除菌体，在上清液中加入有机溶剂溶解，再次离心，在上清液中加入赋形剂，低温喷雾干燥，得到乳酸菌肽，抗菌效价为30000-150000IU/g ;其中所述有机溶剂为醇类、醚类或羧酸类；所述赋形剂为多孔淀粉。
2.根据权利要求1所述一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于:步骤I)所述液体培养基为蛋白胨10g/L、牛肉膏8 g/L、酵母粉4 g/L、麦芽糖20 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、吐温-80g/L、柠檬酸氢二氨2 8/1，？!1调至6.5。
3.根据权利要求1所述一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于:步骤2)所述的发酵培养基为葡萄糖2-3%，蛋白胨1-2.5%，酵母膏0.5-1.5%，微量元素0.01-0.5%,pH 5.5-7，所述微量元素为柠檬酸铵、乙酸钠、MgSO4、MnSO4中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于:步骤3)所述的赋形剂的加入量为每ImL的上清液中加入5~8g。
5.根据权利要求1所述一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于:步骤3)中所述的离心转速为2000-10000转/分，时间为5-40分钟。
6.根据权利要求1所述一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于:步骤3)中所述的低温喷雾干燥进风温度为100-120°C，出风温度为40-60°C。
7.根据权利要求1所述一种乳酸菌肽的制备方法，其特征在于:所述醇类为甲醇、乙醇、丙二醇、正丁醇等；.醚类为乙醚、乙基丁基醚、二丙醚等；羧酸类为甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、己二酸等中的一种或几种。
8.权利要求1~7中任意一项制备方法制备得到的乳酸菌肽。
9.权利要求8所述乳酸菌肽在动物饲料中的应用，其特征在于:在动物饲料中按照6000IU/kg添加乳酸菌肽。
【文档编号】C12R1/25GK103710413SQ201310684645
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】伍冶, 张敏莹 申请人:无锡百诺维生物科技研发有限公司