一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法，属于代谢工程【技术领域】。本发明是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶的同时融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶，构建了能够以p-香豆酸或白藜芦醇为底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和气候条件的制约，在可控条件下实现紫檀芹的生产，为工业化生产紫檀芹奠定基础。
【专利说明】—种利用O-甲基转移酶生物合成紫擅芹的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法，属于代谢工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]紫檀芹是一种在蓝莓和葡萄中发现的与白藜芦醇相关的二苯乙烯类化合物，属于植物用于抗传染病的植物抗毒素。动物实验表明，紫檀芹有抗癌、抗高胆固醇血症、抗高甘油三酯血症的特性，还能够抵御认知能力下降。除此之外，尽管鲜有研究，但紫檀芹还是被认为具有抗糖尿病的作用。
[0003]Schmidlin等的研究表明白藜芦醇O-甲基转移酶(ROMT)可以催化白藜芦醇直接转化为紫檀芹(Schmidlin等，2008 Accession No:FM178870)。如图1所示，紫檀芹可以由4-香豆酸-辅酶A-连接酶(4CL)、芹合酶(STS)以及O-甲基转移酶(ROMT)催化生成。
[0004]本发明的目的是在细胞系统中同时表达R0MT、4CL及STS，以实现白藜芦醇向紫檀芹的转化。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的第一个技术问题是提供能利用O-甲基转移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶并融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的基因工程菌。
[0006]所述基因工程菌可以是以下4种:
[0007](I)表达了源自拟南芥(Arabi`dopsis thaliana)的4_香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)、源自葡萄(Vitis vinife)的芹合酶(STS)的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄(Vitis vinife)的O-甲基转移酶的大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌基因工程菌是以E.coli BL21 (DE3)为宿主，携带重组质粒pETDuet_4CLSTS和Sumo-ROMT。所述pETDuet-4CLSTS是携带编码4CL:: STS的融合基因的pETDuet-Ι重组载体，所述Sumo-ROMT是携带编码ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。
[0008](2)表达了源自葡萄(Vitis vinife)的O-甲基转移酶(ROMT)的大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，携带重组质粒Sumo-ROMT ;所述Sumo-ROMT是携带编码ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。
[0009](3)表达了源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的4_香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)、源自葡萄(Vitis vinife)的芹合酶(STS)的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄(Vitis vinife)的O-甲基转移酶的酵母基因工程菌。酵母基因工程菌是以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll 为宿主，携带重组质粒 pAG304GPD_4CLSTS 和PAG305GPD-R0MT。所述pAG304GPD_4CLSTS是携带编码融合基因的pAG304GPD_ccdB重组载体；所述PAG305GPD-R0MT是携带编码ROMT的基因的pAG305GPD_ccdB重组载体。
[0010](4)表达了源自葡萄(Vitis vinife)的0_甲基转移酶(ROMT)的酵母基因工程菌。所述酵母基因工程菌是以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll为宿主，携带pAG305GPD-R0MT重组质粒；所述重组质粒pAG305GPD_R0MT是携带编码ROMT的基因的pAG305GPD-ccdB 重组载体。
[0011]所述4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana,生态型哥伦比亚-O)的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。上述两个基因融合获得编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白4CL:: STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。O-甲基转移酶(ROMT)是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012]所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll的构建方法参照文献 Urban P,Mignotte C，Kazmaier M, Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5.J BiolChem272(31):19176-19186。 [0013]本发明要解决的第二个技术问题是提供利用所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，包括以下4种具体方法:
[0014](I)以改良M9培养基在200rpm、37°C条件下培养携带重组质粒pETDuet_4CLSTS和 Sumo-ROMT 的 E.coliBL21 (DE3)至 OD6tltl=0.6，添加终浓度 ImM 的 IPTG 诱导培养 2h，添加P-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养以合成紫檀芹。所述P-香豆酸乙醇溶液是以纯乙醇为溶剂，P-香豆酸浓度为0.5g/mL。
[0015](2 )以改良M9培养基在200rpm、37 °C条件下培养携带重组质粒Sumo-ROMT的E.coliBL21 (DE3)至OD600=0.6，添加终浓度ImM的IPTG诱导培养2h，将白藜芦醇DMSO溶液添加到培养物中至白藜芦醇终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养以合成紫檀芹。所述白藜芦醇DMSO溶液是以DMSO为溶剂，白藜芦醇的浓度为0.228g/mL。
[0016](3)以SD drop-out培养基在30 °C条件下培养携带pAG304GPD_4CLSTS和PAG305GPD-R0MT的S.cerevisiae WATll细胞至0D_=0.2，然后添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，继续振荡培养4天以合成紫檀芹。所述P-香豆酸乙醇溶液是以纯乙醇为溶剂，P-香豆酸浓度为0.5g/mL。
[0017](4)以SD drop-out培养基在30 °C条件下培养携带pAG305GPD_R0MT的
S.cerevisiae WATll细胞至0D_=0.2，将白藜芦醇DMSO溶液添加到培养物中至白藜芦醇终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养。所述白藜芦醇DMSO溶液是以DMSO为溶剂，白藜芦醇的浓度为0.228g/mL。
[0018]所述改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%(v/v)甘油得到的。
[0019]本发明还提供了能够以P-香豆酸为底物生物合成白藜芦醇的基因工程菌，包括(I)融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶(SEQ ID N0.3)的E.coliBL21 (DE3)，(2)融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶(SEQ ID N0.3)的S.cerevisiae WATll细胞。
[0020]4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana,生态型哥伦比亚-O)的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。将上述两个基因融合获得编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。O-甲基转移酶(ROMT)是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.5所示，芹合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，O-甲基转移酶(ROMT)的氨基酸序列如SEQID N0.8 所示。
[0021]目前，紫檀芹的获得方法主要是依赖从少数几种植物中提取，还没有微生物合成紫檀芹的方法。本发明构建了能够以P-香豆酸或白藜芦醇为底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和气候条件的制约，在可控条件下实现紫檀芹的生产，为工业化生产紫檀芹
奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1紫檀芹的生物合成途径。
[0023]图2p-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹三种物质的标样的HPLC图谱。
[0024]图3融合表达了 4CL和STS的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。
[0025]图4表达了 ROMT的E.co i I细胞提取物的HPLC图谱。
[0026]图5共表达了 4CL、STS和ROMT的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。
[0027]图6融合表达了 4CL和STS的酵母细胞提取物的HPLC图谱。
[0028]图7表达了 ROMT的酵母细胞提取物的HPLC图谱。
[0029]图8共表达了 4CL、STS和ROMT的酵母细胞提取物的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0030]4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana,生态型哥伦比亚-O)的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。将上述两个基因融合获得编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。O-甲基转移酶(ROMT)是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.5所示，芹合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，O-甲基转移酶(ROMT)的氨基酸序列如SEQID N0.8 所示。
[0031]一种制备紫檀芹的方式是在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶，以含有白藜芦醇的培养基培养细胞系统产紫檀芹。
[0032]一种制备白藜芦醇的方式是在细胞系统中表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶，以含P-香豆酸的培养基培养细胞系统产白藜芦醇。
[0033]另一种制备紫檀 芹的方式是在第一细胞系统中表达4-香豆酸-辅酶A-连接酶(4CL)、芹合酶(STS)，以含P-香豆酸的培养基培养该第一细胞系统产白藜芦醇。在第二细胞系统中表达O-甲基转移酶(R0MT)，以含有白藜芦醇的培养基培养该第二细胞系统产紫檀芹。
[0034]菌种、质粒
[0035]H1-ControllOG和DH5a用于质粒扩增，BL21 (DE3)用于在大肠杆菌中重组表达蛋白，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll用于在酵母中表达蛋白。P-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芳:标样均从Sigma购买获得。pETite N-His SUMO Kan载体从Lucigen (Middleton, WI)购买。pETDuet-Ι从Novagen购买获得，并用于重组蛋白表达。pAG304GPD-ccdB、pAG305GPD_ccdB 从 Addgene (Boston, MA)获得。
[0036]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll的构建方法参照文献Urban P,Mignotte C，Kazmaier Μ,Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5.J BiolChem272(31):19176-19186。
[0037]改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%(v/V)甘油得到的。
[0038]DNA 操作
[0039]所有DNA操作均参照标准程序。限制性酶和T4DNA连接酶均从New EnglandBiolabs购买。所有PCR扩增和克隆反应均采用Phusion高保真DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)。
[0040]RNA提取和cDN A合成
[0041]ROMT (O-甲基转移酶)、4CL (4-香豆酸-辅酶A-连接酶)、STS (芹合酶)克隆于不同的植物。用于克隆ROMT和STS的葡萄RNA，以及用于克隆4CL的拟南芥RNA均采用TrizolPlus RNA 纯化试剂盒(Invitrogen)。cDNA 的合成是利用 Promega Inc.的 Im Prom-1I ?反向转录系统，按照其使用说明完成的。基因扩增是利用表1所示引物借助New EnglandBiolabs PhusionPCR试剂盒完成的。
[0042]产物的提取
[0043]发酵培养液(400 μ L)用800 μ L乙酸乙酯进行萃取，然后将提取物用EppendorfVacufuge (Eppendorf Scientific Westbury, NY)在室温下进行蒸发干燥,然后再复溶于200 μ L80% (v/v )的甲醇中。
[0044]HPLC 分析
[0045]利用Dionex Ultimate3000系统对所提取的产物中的白藜芦醇和紫檀芹进行分析。中间产物通过反相色谱Kinetex C18 (粒径为2.6 μ m ;150X4.6mm)进行分离,洗脱液为0.1% (v/v)的蚁酸(溶液A)和100%的乙腈(溶液B)。样品用80%的甲醇进行稀释，梯度洗脱程序如下:10%的溶液B洗脱2min，10%-70%的溶液B线性洗脱18min，70%-30%的溶液B线性洗脱lmin，30%-10%的溶液B线性洗脱2min，10%的溶液B洗脱以流速0.8ml/min洗脱5min。为了定量分析，所有中间体都通过外标法测定。化合物通过HPLC系统的二极管阵列检测器检测的滞留时间和相应的光谱进行定性。3个标准样品(P-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹)经HPLC分析得到了 3个分离效果良好的峰(图2)。
[0046]实施例1在E.coliBL21 (DE3)中融合表达4CL、STS产白藜芦醇
[0047]为融合表达4CL及STS，两个基因通过PCR扩增策略融合在一起。4CL的终止子被敲除，并在4CL和STS的开放阅读框之间插入一个由3个氨基酸组成的连接肽(Gly-Ser-Gly),以此获得了一个大小为2.87kb的编码4CL、3肽连接子和STS的融合基因，融合基因4CL: =STS的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。4CL: =STS融合基因通过pCR8/Gff/TOPO TA克隆试剂盒连接到入门载体(Gateway entry vector)然后转化进入One Shot大肠杆菌感受态细胞，并测序验证。4CL::STS融合基因通过扩增、BamH I和Hind III双酶切连接到pETDuet-Ι载体上，得到重组质粒pETDuet-4CLSTS，转化进入E.coliBL21 (DE3)。
[0048]挑选E.coli BL21单菌落到3mL含100 μ L/mL氨苄霉素的LB培养基中37°C过夜培养获得种子培养液，将种子培养液转接到50mL含有100 μ L/mL氨苄霉素的改良M9培养基中在200rpm、37°C条件下培养至OD6tltl=0.6，添加ImM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液(纯乙醇为溶剂)至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
[0049]我们检测了以改良M9培养基摇瓶培养携带pETDuet_4CLSTS质粒的E.coliBL21(DE3 )时白藜芦醇的产量，如图3所示，P-香豆酸可被成功转化为白藜芦醇。
[0050]实施例2 在 E.coliBL21 (DE3)中表达 ROMT
[0051]编码O-甲基转移酶(ROMT)的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，将ROMT的基因扩增产物按照pETite N-His SUMO Kan载体的使用说明连接到pETite N-His SUMOKan载体上。通过测序验证正确插入基因的重组质粒命名为Sumo-ROMT,并将该该重组质粒转化到BL21 (DE3)中进行异源表达。
[0052]将携带Sumo-ROMT质粒的E.coliBL21 (DE3)以改良M9培养基在37°C条件下培养至0D_=0.6，添加ImM的IPTG诱导培养2h，将白藜芦醇溶解于DMSO添加到培养物中至终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC分析。
`[0053]如图4所示，摇瓶培养时，将白藜芦醇添加到表达ROMT的E.coli培养物中，白藜芦醇可转化为紫檀芹，转化率为30%。HPLC分析结果也证明了这一点，然而，出现了一个未知的峰，可能是原白藜芦醇上的甲基。
[0054]实施例3在E.coliBL21 (DE3)中融合表达4CL: =STS并同时表达ROMT
[0055]携带pETDuet-4CLSTS 和 Sumo-ROMT 质粒的 E.coliBL21 (DE3)以改良 M9 培养基在200rpm、37°C条件下培养至OD6tltl=0.6，添加ImM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液(纯乙醇为溶剂)至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
[0056]向共表达了 4CL: =STS融合蛋白和ROMT的E.coli培养物中添加p_香豆酸，如图5的HPLC图谱所示，24h时P-香豆酸成功转化为白藜芦醇和紫檀芹，P-香豆酸到紫檀芹的转化率为20%。样品在96h内进行HPLC检测。
[0057]实施例4在酵母中融合表达4CL: =STS
[0058]将核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的4CL: =STS融合基因连接到载体pAG304GPD-ccdB (Addgene, Boston, MA)上，得到重组质粒 pAG304GPD_4CLSTS，并将该重组质粒并转入S.cerevisiae WAT11。酵母转化借助Frozen-EZ酵母转化II试剂盒(ZymmoResearch, Orange, CA)进行。阴性对照质粒为 pAG304GPD_ccdB。
[0059]携带pAG304GPD-4CLSTS 的 S.cerevisiae WATll 细胞以 SD drop-out 培养基在30°C条件下培养至OD6tltl=0.2，然后添加P-香豆酸(0.5g/L)，继续振荡培养4天，间歇取样用HPLC进行分析。
[0060]将携带pAG304GPD_4CLSTS的新鲜酵母菌落以3ml含0.5g/Lp-香豆酸的drop-out培养基在30°C条件下培养4天。细胞提取物经HPLC分析，如图6所示，几乎所有的p-香豆酸在4天内都被转化为了白藜芦醇。与E.coli相比，酵母的转化效率更高。
[0061]实施例5在酵母中表达ROMT
[0062]将核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的ROMT基因通过LR Clonase II酶混合试剂盒替换连接到pAG305GPD-ccdB (Addgene),得到重组质粒pAG305GPD_R0MT，转入S.cerevisiae WATll细胞用于发酵。
[0063]将携带pAG305GPD-R0MT 的 S.cerevisiae WATll 细胞以 SD drop-out 培养基在30°C条件下培养至0D_=0.2，然后添加白藜芦醇(0.228g/L)，相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
[0064]如图7所示，摇瓶培养时，将白藜芦醇添加到表达ROMT的S.cerevisiae WATll细胞培养物中，白藜芦醇可转化为紫檀芹，转化率30%。HPLC分析结果也证明了这一点，然而，出现了一个未知的峰，可能是原白藜芦醇上的甲基。
[0065]实施例6在酵母中融合表达4CL::STS并同时表达ROMT
[0066]将核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的4CL: =STS融合基因连接到载体pAG304GPD-ccdB。将核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的ROMT基因通过LR Clonase II酶混合试剂盒替换连接到pAG305GPD-ccdB (Addgene)0上述两步得到的重组质粒分别命名为PAG304GPD-4CLSTS和pAG304GPD-R0MT。这些质粒含有组成型启动子GPD。将这些质粒转入S.cerevisiae WATll 细胞用于发酵。阴性对照质粒为 pAG304GPD_ccdB和 pAG305GPD_ccdB。
[0067]将携带pAG304GPD-4CLSTS 和 pAG305GPD_R0MT 的 S.cerevisiae WATll 以 SDdrop-out培养基在30 °C条件下培养至OD6tltl=0.2,然后添加p-香豆酸(0.5g/L),相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
[0068]向共表达了 4CL: =STS融合蛋白和ROMT的S.cerevisiae WATll的培养物中添加P-香豆酸，如图8的HPLC图谱所示，24h时P-香豆酸成功转化为白藜芦醇和紫檀芹，P-香豆酸到紫檀芹的转化率为30%。样品在96h内进行HPLC检测。
[0069]表1引物序列
[0070]
【权利要求】
1.一种利用O-甲基转移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶的同时表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示；所述芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；将上述两个基因融合获得了编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白4CL:: STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；所述O-甲基转移酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是表达了SEQ ID N0.3所示融合基因以及 SEQ ID N0.4 所示 ROMT 基因的 E.coli BL21 (DE3)。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL2KDE3)为宿主，携带重组质粒 pETDuet-4CLSTS 和 Sumo-ROMT ;所述 pETDuet_4CLSTS 是携带 SEQ ID N0.3 所示融合基因的pETDuet-Ι重组载体；所述Sumo-ROMT是携带SEQ ID N0.4所示基因的pETiteN-His SUMO Kan 重组载体。
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是表达了SEQ ID N0.3所示融合基因以及 SEQ ID N0.4 所不基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WAT11。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，是以S.cerevisiae WATll为宿主，携带重组质粒 pAG304GPD-4CLSTS 和 pAG305GPD_R0MT ;所述 pAG304GPD_4CLSTS 是携带 SEQID N0.3所示融合基因的pAG304GPD-ccdB重组载体；所述pAG305GPD_R0MT是携带SEQ IDN0.4所示基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。
7.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了SEQ IDN0.4 所示基因的 E.coli BL21 (DE3)。`
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL21 (DE3)为宿主，携带重组质粒Sumo-ROMT ;所述Sumo-ROMT是携带SEQ ID N0.4所示基因的pETite N-HisSUMO Kan重组载体。
9.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了SEQ IDN0.4 所不基因的 S.cerevisiae WATlI。
10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，是以S.cerevisiae WATll为宿主，携带重组质粒PAG305GPD-R0MT ;所述pAG305GPD_R0MT是携带SEQ ID N0.4所示基因的pAG305GPD-ccdB 重组载体。
11.一种利用权利要求3-6任一所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，是以P-香豆酸为底物生物合成紫檀芹。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，是以改良M9培养基在200rpm、37°C条件下培养携带重组质粒 pETDuet-4CLSTS 和 Sumo-ROMT 的 E.coliBL21 (DE3)至 0D_=0.6，添加ImM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养以合成紫檀芹。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，以SDdrop-out培养基在30°C条件下培养携带 PAG304GPD-4CLSTS 和 pAG305GPD_R0MT 的 S.cerevisiae WATll 细胞至 0D_=0.2，然后添加0.5g/L P-香豆酸，继续振荡培养4天以合成紫檀芹。
14.一种利用权利要求7-10任一所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，是以白藜芦醇为底物生物合成紫檀芹。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，是以改良M9培养基在200rpm、37°C条件下培养携带重组质粒Sumo-ROMT的E.coliBL21 (DE3)至OD6tltl=0.6，添加ImM的IPTG诱导培养2h，将白藜芦醇溶解于DMSO添加到培养物种至终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养以合成紫檀芹。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，是以SDdrop-out培养基在30°C条件下培养携带 PAG305GPD-R0MT 的 S.cerevisiae WATll 细胞至 OD6tltl=0.2，然后添加 0.228g/L白藜芦醇，相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
17.根据权利要求12或15所述的方法，其特征在于，所述改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5% (v/v)甘油得到的。
18.权利要求1所述基`因工程菌在紫檀芹生产中的应用。
【文档编号】C12R1/865GK103773704SQ201310723683
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】汪业春, 穆罕默德·瓦杜·慧娅, 余晓丹 申请人:无锡新和源发酵技术研究院有限公司